多种癌症病理演变前期Bmi1基因mRNA水平的原位杂交检测试剂盒及检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物检测领域，更具体地说，是涉及与癌症病理演变前期mRNA表达改 变（病理演变过程中）的相关检测技术。
【背景技术】
[0002] 根据国内外权威机构提供的资料，我国每年癌症的新增人数已达到312万，死亡 人数近260万，患者超过700多万，全球每年新增癌症患者800万，死亡人数接近800多万， 患者约有8400多万人，到2020年以上人数将翻一番，这是一组可怕的数字。癌症诊治成本 越来越高，按癌症患者的年治疗费用20万(贫穷地区可能偏高，发达地区可能远远高出20 万)，700多万患者，每年的花费是1. 4万亿人民币，扣除成本35%约4千亿，每年约有1万 亿人民币白白消耗了。而且，癌症患者大部分会在治疗后不久死亡。因此，现有的临床癌症 诊治模式一定要改变，本发明的创新点是提前做到预防性筛查，在瘤块没有出现之前筛查 Bmil基因的mRNA表达量，对表达量降低者，及时介入预防性调控和预防性治疗，做到基因 水平癌症的治未病。
[0003] 2005年美国卫生研究院、癌症研究院、疾控中心等八家单位做了抗癌大战中是失 败，结论是癌症死亡率没有降低，其列举出造成抗癌大战失败的几个因素是：1.肿瘤细胞 异质性(多态性）；2.肿瘤细胞耐药性；3.抗癌药物设计思路不完善(动物模型设计不科学） 等。同时，该报告中亦提出应重新审视现有诊治癌症的措施。
[0004] 本发明人在长期研究中发现，导致癌症死亡率不降的重要原因是不能做到真正的 早期诊断。依照现有的临床医学影像（B超、CT、核磁共振成像等）及和其它生化(癌抗原、 癌胚抗原、糖类激素、细胞膜因子、细胞核因子、细胞流式技术）指标来诊断癌症，都是肿瘤 形成后诊断，前者要有组织学变化或已有占位性病变，后者大部分是肿瘤形成后所分泌、释 放、或肿瘤的标记物。传统临床观念认为占位性癌块在2公分下是属于早期癌症的诊断，这 一概念值得认真讨论，2公分以下癌块属早期这一界定科学性是不够严谨的，从细胞学角度 来分析，1公分的肿块约有一亿个肿瘤细胞，2公分的肿块其三维空间的细胞叠加数远不止 2亿个肿瘤细胞，从多种癌变前期到单克隆癌细胞产生及形成2公分的癌块，其病理演变过 程相当长，可能是5年或10年、甚至是10年以上(特殊病例除外)，很难证实的是在这个病 理演变过程中，肿块是癌症唯一的发生地和单独的病灶，可能癌细胞早已迁移到其它组织 或器官生长。临床研究早已证实，一旦形成肿块的同时，其它癌细胞通过不同途径迁移到 其它部位克隆生长，一旦切除原发灶后，其它器官复发灶或多发癌块灶先后形成。因此，在 临床上以2公分以下的癌肿块大小来界定早期与否，不够严谨(有些病例，在发现原发病灶 时，同时发现转移病灶，不在我们表述的内容中)，其实这时已经是晚期诊断和晚期治疗，这 是导致癌症死亡率不降的真正原因。
[0005]随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症基因组学等研究的深入展开，为 了寻求更早期的诊断癌症、治疗癌症、以及预防癌症，已取得长足进步。至今，我们已有可能 在基因的一级转录功能产物（mRNA水平或microRNA)上做更精确的早期筛查和诊断，在多 种癌变前期或癌细胞形成(单克隆）前，就可以做到早期预测和筛查。
[0006] 研证实Bmil是一个新的原癌基因，在各种癌症组织高度表达，是癌症发生和转移 的因子，Bmil的高表达与各种癌症的进程、复发和预后显著相关，表明了Bmil是一个潜在 的各种癌症病变前期及预后有非常重要意义的标记物。
[0007] 本发明选择多组临床标本(癌症病人、高危人群、正常对照）采用核酸原位杂交技 术和免疫组化方法对Bmil基因mRNA乳腺癌的早期预警进行检测分析。本发明人在研究 中发现Bmil基因mRNA在乳腺癌患者、癌症高危人群、正常对照人有明显的表达量变化，将 Bmil基因mRNA作为各种癌变病理变化前期筛查指标，有非常重要的临床诊断意义。作于多 种癌变前期筛查、及癌症治疗后的复发、转移预警也有非常重要的临床意义。
[0008] 发明人在长期的研究中，得出了一种新理念，癌症和其它临床的重大疾病的临床 诊治模式一定要改变，不能只停留现有治已病(发病后诊治)，要做到预防性诊治，做到治未 病，只有这样才能降低重大疾病的发病率和死亡率，降低社会成本和医疗成本。因此，发明 人在开发和生产重大疾病的RNA水平筛查试剂盒及治疗药物中，在理论和技术上都做了创 新。特别是筛选临床标本(正常人群、癌症高危人群、肿瘤患者)，突破了正常组织与肿瘤组 织比较的一贯性研发思路，来寻找和开发癌前变的RNA水平，与癌症早期基因病理生理学 演变密切相关，而且临床意义非常重要靶标(疾病基因)，将临床上肿瘤形成后诊治模式提 高到肿瘤的预防性诊治，争取了肿瘤诊治的时间和空间，达到预防癌症。
[0009] 目前，Bmi1基因表达谱检测方法用Northern杂交、基因芯片、实时荧光定量PCR和 Solexa测序等分析技术，而这些方法多用于科研方面，不适应临床应用，而检测mRNA比DNA 分析更科学（DNA分析大部分在易感性的表象上，mRNA是DNA功能的体现)，比蛋白分析更可 靠(发明人在采用双标记技术研究中发现mRNA与蛋白转录和表达时空上，有时候不同步)。 根据现有的文献资料采用原位杂交技术和组化免疫方法检测Bmi1基因mRNA水平表达量的 检测技术及试剂盒未见报道。
[0010] 本发明人在针对创新性发明的要求，设计了（乳腺癌患者、高危人群、正常对照）不 同数据例组，用原位杂交技术进行检测，结果表明以上癌症病人Bmil基因mRNA都高表达， 高危人群有不同程度表达10-25%，正常对照都是零表达。表明Bmil基因mRNA是多种癌变 前期筛查的重要标志物。
[0011] 原位杂交技术（insituhybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
[0012] 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确 该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标 记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的 同位素标记物有 3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但 是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素 标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其 灵敏的。
[0013]根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA，RNA-DNA，RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和 显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（RNA)和检测的靶RNA是采用碱基互 补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果没 有影响。
[0014]鉴于目前临床上多种癌变前期的诊断(影像医学和生化指标物都是肿瘤形成后的 诊断）是晚期诊断，治疗也是晚期治疗，也是导致死亡率不降的医治模式。本发明的初衷是 想完善目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治未病，达到预防性诊治，将 目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到癌前变mRNA水平量化改变技术，做了创 新性的技术突破，提供癌前变mRNA水平筛查技术。使临床上有了一项新的癌前变mRNA水 平真正早期筛查的技术，为临床癌症的诊治争取时间和空间。
[0015] 综上所述，本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交 检测探针和标记物。其次，本发明还要提供上述试剂盒用于多种癌症理演变前期筛查及治 疗后转移早期预警相关的原位杂交检测方法。
【发明内容】
[0016] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下： 本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂 交探针序列如SEQIDNO. 1所示，序列表SEQIDN0JF271685,核苷酸序列长度是791bp， ⑶S序列是31. ? ? 633bp，探针全长480bp取自⑶S中一段。
[0017] 本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显 色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
[0018] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。
[0019] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。
[0020] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。
[0021] 本发明的乳腺癌病理演变前期Bmil基因mRNA筛查试剂盒应用价值在于，对癌病 理演变前期筛查，及癌变后或治疗后复发、转移、扩散发生预警，进一步配合临床治疗。
[0022] 本发明还提供一种Bmil原位杂交的检测方法，包括以下步骤： (1) 在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
[0023] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为： 核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间为16 - 24小时。
[0024] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或 其它器官组织细胞标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本来自多种 癌症患者、高危人群、健康正常人群。
[0025] 本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以Bmil基因 mRNA为检测对象，合成探针是Bmi 1基因杂交互补序列，检测的底物是人体血液标本白细胞 或组织细胞的Bmil基因mRNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供Bmil基因mRN