人类原癌基因trg及其编码的蛋白的制作方法

专利名称：人类原癌基因trg及其编码的蛋白的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的表现诱导癌发生和癌转移能力的原癌基因，及其编 码的蛋白质。
背景技术：
通常，已知高级动物，包括人，具有大约30,000个基因，但每个个体只 能表达大约15%的基因。因此，已经发现根据何种基因被选择和表达决定所 有的生命现象，即发育、分化、稳态、对刺激的反应、细胞周期的控制、老 化和凋亡(一种程序性细胞死亡)等(Liang, P.and A.B.Pardee, >SWe ce 257: 967-971， 1992)。
由遗传变异引起的如肿瘤发生病理现象，导致基因表达的改变。因此，
法。例如，由Liang和Pardee ^是出的mRNA差异显示方法(Liang, P和 A.B.Pardee, Science 257: 967-971， 1992 )现在已经有效用于寻找肿瘤抑制基因、 与细胞周期调节有关的基因和与凋亡有关的转录调节基因等，并同样在确定 只在单细胞出现的多种基因之间的关系中得到广泛应用。
将肿瘤发生的多种结果综合起来，有报道称如特定染色体杂合性的丟失、 原癌基因的活化以及包括p53基因的其他肿瘤抑制基因的失活的多种基因改 变在肿瘤组织内积聚，导致人类肿瘤的形成(Bishop, J.M.， Cell 64: 235-248, 1991; Hunter, T.， Cell 64: 249-270， 1991 )。同样，有报道称10-30%的癌症是由 原癌基因通过原癌基因的扩增而激活从而诱导的，并且因此原癌基因的活化 在多种癌症的病因学研究中起着重要的作用。因此，人们已经试图确定这种 作用。
因此，本发明人发现在原癌基因水平研究产生宫颈癌的机制，并且因此
命名为人类转化相关基因(TRG)的原癌基因只在癌细胞中表现出特定升高 的表达水平。该原癌基因可以有效用于诊断、预防和治疗例如子宫癌、白血 病、淋巴瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌等的多种癌症。

发明内容
因此，本发明试图解决现有技术的问题，因此本发明的一个目的是提供 一种新的原癌基因及其片段。
本发明的另 一 目的是提供一种包含所述原癌基因及其片段的重组载体； 和一种被该重组载体转化的微生物。
本发明的又一目的是提供一种由所述原癌基因编码的蛋白质；及其片段。
本发明的又一 目的是提供一种用于诊断癌症的包括所述原癌基因或其片 段的试剂盒。
本发明的再一目的是提供一种用于诊断癌症的包括所述蛋白质或其片段 的试剂盒。
为了完成上述目的之一，本发明提供了具有选自由SEQIDNO: 1、SEQID NO: 5、 SEQ ID NO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 21、 SEQ ID NO: 25、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 57和SEQ
ID NO: 61组成的组的DNA序列的原癌基因及其片段。
根据上述的另一目的，本发明提供一种包含原癌基因或其片段的重组载 体；和一种被该重组载体转化的微生物。
根据上述的又一 目的，本发明提供一种含有选自由SEQ ID NO: 2、 SEQ ID NO: 6、 SEQ ID NO: 10、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 18、 SEQIDNO:22、 SEQ ID NO: 26、 SEQ ID NO: 30、 SEQ ID NO: 34、 SEQ ID NO: 38、 SEQ ID NO:42、 SEQ ID NO: 46、 SEQ ID NO: 50、 SEQ ID NO: 54、 SEQ ID NO: 58和SEQ
ID NO: 62组成的组的氨基^列的蛋白质及其片段，该蛋白质及其片段分别 由所述的原癌基因编码。
根据上述的又一目的，本发明提供一种包括所述原癌基因或其片段的用 于诊断癌症的试剂盒。
根据上述的又一目的，本发明提供一种包括所述原癌蛋白或其片段的用 于诊断癌症的试剂盒。
根据上述的又一目的，本发明提供一种反义基因，该基因具有与全部或 部分由原癌蛋白或其片4殳转录而来的mRNA序列互补的DNA序列，并与 mRNA结合而抑制原癌蛋白或其片段的表达。
根据上述的再一目的，本发明提供一种包括作为活性成分的反义基因的 抗癌和抗转移的组合物。
以下，将参照附图详细描述本发明的优选实施方案。
1. TRG3
本发明的原癌基因，人类转化相关基因3 (以下，称为TRG3)，具有表 示为SEQ ID NO: 1的1，703画bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 1的DNA序列中，与从113至1522核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(1520-1522:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白 质编码区产生的氨基S吏序列表示为SEQ ID NO: 2，且包含469个氨基酸(以 下称为"TRG3蛋白质")。
SEQ ID NO: 1的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因库 数据库保存，收录号为AY189688(预定发布日期2005年4月8日)，该DNA 碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为BC011681的人 类CGI-51蛋白基因的相似。但是，由此研究结果发现TRG3原癌基因在包括 子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中其表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有469个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 2的氨基S吏序列，并且其分子量约为52kDa。
2. TRG4
本发明的原癌基因，人类转化相关基因4 (以下，称为TRG4)，具有表 示为SEQ ID NO: 5的2，576-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 5的DNA序列中，与乂人87至482核苷酸序列位置相对应 的开放阅读框(480-482:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白质 编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 6，且包含131个氨基酸(以下 称为"TRG4蛋白质")。
SEQIDNO: 5的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因库 数据库保存，收录号为AY1896卯(预定发布日期2005年4月8日)，该DNA 石咸基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为NM—022463的 人类核氧还蛋白(nucleoredoxin) ( NXN )基因的相似，但彼此的蛋白质序列完 全不同。但是，由此研究结果发现TRG4原癌基因在包括子宫癌的多种人类 肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有131个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 6的氨基酸序列，并且其分子量大约为14kDa。
3. TRG5
本发明的原癌基因，人类转化相关基因5 (以下，称为TRG5)，具有表 示为SEQ ID NO: 9的l，334-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 9的DNA序列中，与从88至1,092核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(1,090-1,092:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQIDNO: 10,且包含334个氨基酸(以 下称为"TRG5蛋白质")。 SEQIDNO:9的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因库 数据库保存，收录号为AY189689(预定发布日期2005年4月8日)，该DNA 碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为NM—002300的 人类乳酸脱氢酶B (LDHB )基因的相似。但是，由此研究结果发现TRG5原 癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达明 显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有334个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 10的氨基S臾序列，并且其分子量大约为37kDa。
4. TRG6
本发明的原癌基因，人类转化相关基因6 (以下，称为TRG6)，具有表 示为SEQ ID NO: 13的3,309-bp的全长DNA序列。在SEQ ID NO: 13的DNA 序列中，与从233至481核苷酸序列位置相对应的开放阅读框(479-481:终 止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白质编码区产生的氨基酸序列表 示为SEQ ID NO: 14,且包含82个氨基酸(以下称为"TRG6蛋白质")。
SEQ ID NO: 13的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY191222 (预定发布日期2005年4月8日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列中某些序列和保存在数据库内的收录号 为AL354928的9号染色体上的RP11-175D17克隆的相似。但是，由此研究 结果发现TRG6原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种 正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有82个氨基酸,具有表示为SEQ ID NO: 14的氨基酸序列，并且其分子量大约为9kDa。
5. TRG7
本发明的原癌基因，人类转化相关基因7 (以下，称为TRG7)，具有表 示为SEQ ID NO: 17的1,334-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 17的DNA序列中，与从42至1,422核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(1,420-1,422:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 18，且包含175个氨基Si(以 下称为"TRG7蛋白质")。
SEQ ID NO: 17的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY191223 (预定发布日期2005年4月8日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为AK074557 的人类cDNAFLJ90076fis ，克隆HEMBA1004444的相似。但是，由此研究 结果发现TRG7原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种 正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有175个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 18的氨基酸序列，并且其分子量大约为20kDa。
6. TRG9
本发明的原癌基因，人类转化相关基因9 (以下，称为TRG9)，具有表 示为SEQ ID NO: 21的l，582-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 21的DNA序列中，与从17至1，576核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(1,574-1,576:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 22,且包含519个氨基酸(以 下称为"TRG9蛋白质")。
SEQ ID NO: 21的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY272044 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为 NM—003100的人类分类樣i管连接蛋白2 (sorting nexin 2) ( SNX2 )的相似。 但是，由此研究结果发现TRG9原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高 表达，但在多种正常组织中表达明显降低。 由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有519个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 22的氨基酸序列，并且其分子量大约为58kDa。
7. TRG10
本发明的原癌基因，人类转化相关基因IO(以下，称为TRGIO)，具有 3，979-bp的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 25。
在SEQ ID NO: 25的DNA序列中，与从1,100至1,270核苷酸序列位置 相对应的开放阅读框(1,268-1,270:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由 此蛋白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 26，且包含56个氨基 酸(以下称为"TRGIO蛋白质，，)。
SEQ ID NO: 25的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277593 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为 NM一033346的人类骨形态发生蛋白受体II型(丝氨酸/苏氨酸激酶X BMPR2 )、 转录变异2基因的相似。但是，由此研究结果发现TRG10原癌基因在包括子 宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有56个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 26的氨基酸序列，其分子量大约为6kDa。
8. TRG11
本发明的原癌基因，人类转化相关基因11 (以下，称为TRGll)，具有 表示为SEQ ID NO: 29的235-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 29的DNA序列中，与从26至214核脊酸序列位置相对 应的开放阅读框(227-229:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白 质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 30，且包含62个氨基酸(以 下称为"TRGll蛋白质")。
SEQIDNO: 29的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277594 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为BC022205 的人类IMAGE:5258564基因克隆的相似。但是，由此研究结果发现TRG11 原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达 明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有62个氨基酸，具有表示为SEQID NO:30的氨基酸序列，其分子量大约为7kDa。
9. TRG12
本发明的原癌基因，人类转化相关基因12(以下，称为TRGll)，具有 510-bp的全长DNA序列表示为SEQIDNO:33。
在SEQ ID NO: 33的DNA序列中，与从80至475核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(473-475:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白 质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 34,且包含131个氨基酸(以 下称为"TRG12蛋白质")。
SEQ ID NO: 33的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277595 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为AY358674 的人类DNA59497MY047(UNQ577)的相似。但是，由此研究结果发现TRG12 原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达 明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有131个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 34的氨基酸序列，其分子量大约为14kDa。
10. TRG13
本发明的原癌基因，人类转化相关基因13 (以下，称为TRG13),具有 l，301-bp的全长DNA序列表示为SEQIDNO: 37。
在SEQ ID NO: 37的DNA序列中，与从18至1,193核苷S交序列位置相对 应的开放阅读框(1,191-1,193:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 38，且包含391个氨基酸(以 下称为"TRG13蛋白质")。
SEQ ID NO: 37的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277596 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号分别为 BC002940和BCO12729的人类MGC11349基因和人类MGC11349基因的相 似。但是，由此研究结果发现TRG13原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤 中高表达，但在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有391个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 38的氨基酸序列，其分子量大约为40kDa。
11. TRG14
本发明的原癌基因，人类转化相关基因14(以下，称为TRG13)，具有 表示为SEQ ID NO: 41的1,206-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 41的DNA序列中，与从18至1,202核普酸序列位置相对 应的开放阅读框(1,200-1，202:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 42，且包含394个氨基酸(以 下称为"TRG14蛋白质")。
SEQ ID NO: 41的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277597 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为 NM—006096的人类N-myc下游调控基因1 (NDRG1 )基因的相似。但是，由
此研究结果发现TRG 14原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但 在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有394个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 42的氨基酸序列，其分子量大约为43kDa。
12. TRG15
本发明的原癌基因，人类转化相关基因15 (以下，称为TRG15)，具有 表示为SEQ ID NO: 45的1,104-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 45的DNA序列中，与从1至1,104核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(1,102-1,104:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 46，且包含367个氨基酸(以 下称为"TRG15蛋白质")。
SEQ ID NO: 45的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277598 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为 NM—017952的人类FLJ20758蛋白基因的相似。FLJ20758蛋白基因的功能仍 待被认定。但是，由此研究结果发现TRG15原癌基因在包括子宫癌的多种人 类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有367个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 46的氨基酸序列，其分子量大约为42kDa。
13. TRG16
本发明的原癌基因，人类转化相关基因16(以下，称为TRG16),具有 表示为SEQ ID NO: 49的l，064-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 49的DNA序列中，与从92至1,064核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(1,062-1,064:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋
白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 50，且包含324个氨基酸(以 下称为"TRG16蛋白质")。
SEQ ID NO: 49的DNA序列已经由美国国立卫生研究院(NIH)的基因 库数据库保存，收录号为AY277601 (预定发布日期2005年3月31日)，该 DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的收录号为AF318376 的人类pp9320 mRNA基因的相似。pp9320基因的功能仍待被认定。但是，由 此研究结果发现TRG 16原癌基因在包括子宫癌的多种人类肺瘤中高表达，但 在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有324个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 50的氨基S臾序列，其分子量大约为36kDa。
14. TRG17
本发明的原癌基因，人类转化相关基因17(以下，称为TRG17)，具有 表示为SEQ ID NO: 53的432-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 53的DNA序列中，与^v 1至408核苷酸序列位置相对应 的开放阅读框(406-408:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白质 编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 54,且包含135个氨基酸(以下 称为"TRG17蛋白质")。SEQ ID NO: 53的DNA序列已经由美国国立卫生研 究院(NIH)的基因库数据库保存，收录号为AY277599 (预定发布日期2005 年3月31日)，该DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库内的 收录号分别为NM—032286和BC003353的人类MGC5309 (MGC5309)基因 和人类MGC5309基因的相似。但是，由此研究结果发现TRG17原癌基因在 包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有135个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 54的氨基酸序列，其分子量大约为16kDa。
15. TRG18
本发明的原癌基因，人类转化相关基因18(以下，称为TRG18),具有 表示为SEQIDNO: 57的1,141-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 57的DNA序列中，与从20至1,141核香酸序列位置相对 应的开放阅读框是全长的蛋白质编码区(1,139-1,141:终止密码子)，由此蛋 白质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 58，且包含373个氨基酸(以 下称为"TRG18蛋白质，，)。SEQ ID NO: 57的DNA序列已经由美国国立卫生 研究院(NIH)的基因库数据库保存，收录号为AY277600 (预定发布日期 2005年3月31日)，该DNA碱基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库 内的收录号为AJ131389的人类PEX3蛋白的mRNA的相似。但是，由此研究 结果发现TRG18原癌基因在包括子宫癌的多种人类肿瘤中高表达，但在多种 正常组织中表达明显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有373个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 58的氨基酸序列，其分子量大约为42kDa。
16. TRG20
本发明的原癌基因，人类转化相关基因20 (以下，称为TRG20)，具有 表示为SEQ ID NO: 61的449-bp的全长DNA序列。
在SEQ ID NO: 61的DNA序列中，与从42至449核苷酸序列位置相对 应的开放阅读框(447-449:终止密码子)是全长的蛋白质编码区，由此蛋白 质编码区产生的氨基酸序列表示为SEQ ID NO: 62，且包含135个氨基酸(以 下称为"TRG20蛋白质")。SEQ ID NO: 61的DNA序列已经由美国国立卫生 研究院(NIH)的基因库数据库保存，收录号为AY453397 (预定发布日期 2005年3月31日)，该DNA44基序列结果显示其DNA序列和保存在数据库 内的收录号分别为NM—032286和BC003353的人类假定蛋白MGC5309基因 和人类假定蛋白MGC5309基因的相似。但是，由此研究结果发现TRG20原
癌基因在包括子宫癌的多种人类肺瘤中高表达，但在多种正常组织中表达明 显降低。
由本发明的原癌基因表达的蛋白质含有135个氨基酸，具有表示为SEQ ID NO: 62的氨基酸序列，其分子量大约为16kDa。
同时，由于密码子的简并性，或考虑到生物表达原癌基因的密码子偏爱 性，可以对本发明的原癌基因在编码区进行多种修饰而不改变编码区表达的 致癌蛋白的氨基酸序列，并且也可以对除编码区外的区域在不影响基因表达 的范围内进行多种修饰或变化。这样修饰的基因同样包括在本发明的范围内。 因此，本发明也包括具有与上述原癌基因基本相同的DNA序列的多核苷酸； 及其片段。词语"基本相同的多核苷酸"是指具有同编码与SEQIDNO:2相同 的翻"i奪蛋白产物的SEQIDNO: 1的DNA至少80%、优选至少90%，及最优 选至少95%的序列同源性。
同样，在不影响蛋白质功能的区域内，甚至在本发明的蛋白质氨基酸序 列中可以有一个或多个氨基酸被取代、添加或去除，并且根据其用途只有一 些蛋白可以被利用。这样被修饰的氨基酸序列同样包括在本发明的范围内。 因此，本发明也包括具有与致癌蛋白质大致相同的氨基酸序列的多肽；及其 片段。词语"大致相同的多肽"是指具有至少80%、优选至少90%、最优选至 少95%的同源序列的多肽。
本发明的原癌基因和蛋白质可以从人类癌症组织中被分离出来，或者根 据已知的合成DNA或肽的方法被同样合成。同样，在本领域中已知，制备的 基因因此可以被插入载体以便在微生物内表达，以获得表达载体，然后表达 载体被导入如大肠杆菌、酵母细胞等适合的宿主细胞。本发明基因的DNA可 以大量复制或者在这样的转化宿主内其蛋白可以以商品化数量产生。
就构建表达载体而言，根据产生原癌基因或蛋白质的宿主细胞的种类可 以适当选择和结合如启动子和终止子的表达调控序列、自主复制序列、分泌 信号等。
由于发现本发明的基因很少在正常外宫颈组织表达，但在如RNA印迹法 等这样的分析方法中其在宫颈癌组织和子宫癌细胞系中过表达，因此本发明 的基因被证明在子宫癌形成中具有强大的诱发肿瘤能力。除了如宫颈癌的上 皮组织，本发明的原癌基因在其他如白血病、结肠癌等的癌性肺瘤中高表达。 因此，本发明的原癌基因被认为是在多种肺瘤发生中的共同的致癌基因，并 且可以有效的用于诊断多种癌症、产生转化动物以及用于反义基因治疗等。
例如，使用原癌基因诊断癌症的方法包括的步骤是使用多种本领域中 已知的技术，在将用作探针的全部或部分原癌基因与自受试者提取的体液中 的核酸杂交后，确定受试者是否具有本发明的原癌基因。使用放射性同位素、 酶等标记的探针可以容易的确定组织样本中该基因的存在。因此，本发明也 提供用于诊断癌症的包括全部或某些该原癌基因的试剂盒。
可以通过将本发明的原癌基因导入例如如大鼠的啮齿类动物的哺乳动物 来获得转化动物，并且该原癌基因优选在受精卯阶段至少是在8-细胞阶段之 前被导入。这样制备的转化动物因此可以有效地用于寻找如抗氧化剂的致癌 物质或抗癌物质。
本发明也提供有效用于基因治疗的反义基因。在本申请中，词语"反义基 因，，是指具有与部分或全部由原癌基因或其片段转录来的mRNA序列互补的 DNA序列的多核苷酸，并且通过向患者导入具有可以和mRNA蛋白质结合区 结合的DNA序列来破坏原癌基因的开放阅读框(ORF)，可以用于预防和治 疗由原癌基因表达引起的癌症。本发明也提供通过给患者施用有效治疗剂量 的本发明的反义基因来治疗或预防癌症或癌症转移的方法。
在本发明的反义基因治疗中，使用常规方法给患者施用本发明的反义基 因来阻止原癌基因的表达。例如，通过静电吸引的方法将反义寡聚脱氧核苷
酸(ODN)和聚-左旋-赖氨酸衍生物混合，根据公开的方法(J. s. Kim等人，J. Controlled Release 53: 175-182， 1998)对患者静脉施用得到的混合物。
同样，在本发明的实质和范围内，本发明的药物组合物包括含有与药学 上可接受的载体、赋形剂或非必需的其他添加剂连接的本发明反义基因的抗 癌组合物。本发明的药物组合物优选制备成注射剂型。
根据多种相关因素如治疗的状况、施用途径、患者的年龄和体重、状况 的严重程度等，实际施用的反义基因的量是不同的。
由本发明的原癌基因派生出的蛋白质可以作为产生抗体的诊断工具被有 效使用。使用含有本发明原癌基因或其片段表达的氨基酸序列的蛋白质，才艮 据本领域已知的常规方法，可以以单克隆或多克隆抗体制备本发明的抗体， 并且通过使用本领域已知的如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定 (RIA)、夹心法测定、蛋白质印迹法或聚丙烯酰胺凝胶免疫印迹法等的方法， 来确定受试者体液样本中是否有该蛋白质的表达，因此那些抗体可以用于诊 断癌症。
同样，本发明的原癌基因可以用于建立可无控制生长的癌细胞系，例如， 使用经原癌基因转染的成纤维细胞在棵鼠背部形成肿瘤组织，并可以由此肿 瘤组织制备该细胞系。该癌细胞系可以有效用于寻找抗癌剂等。
以下，将参考优选实施例对本发明进行详细描述，但这里提出的描述仅 是为了对优选实施例进行举例说明，无意对发明的范围进行限制。
附图简述
在以下的详细描述中将参考附图对本发明的优选实施例的这些和其他特 征、技术方案和优点进行更全面的描述。在附图中


图1至16为显示确定H20-121 DNA片l殳(图1 )、 H93-811 DNA片l殳(图 2 )、 HI 17-321 DNA片段(图3 )、 H38-211 DNA片段(图4 )、 H38-621 DNA 片段(图5)、 H96 DNA片段(图6 )、 H94 DNA片段(图7)、 H42 DNA片 段(图8 )、 H109 DNA片段(图9 )、 H119 DNA片段(图10 )、 H201 DNA片 段(图11 )、 H151 DNA片4殳(图12)、 H132DNA片#殳(图13 )、 H141 DNA 片段(图14)、 H181 DNA片段(图15)和H134DNA片段(图16)分别是 否在正常外宫颈组织、宫颈肿瘤组织、转移'淋巴结肿瘤组织和CUMC-6癌细 胞中表达的差异显示反转录-多聚酶链反应(DDRT-PCR)结果的图。
图17至32为显示确定本发明的原癌基因TRG3 (图17的上部)、TRG4
(图18的上部)、TRG5 (图19的上部)、TRG6 (图20的上部)、TRG7 (图 21的上部)、TRG9 (图22的上部)、TRGIO (图23的上部)、TRGll (图24 的上部)、TRG12 (图25的上部)、TRG13 (图26的上部)、TRG14 (图27 的上部)、TRG15 (图28的上部)、TRG16 (图29的上部)、TRG17 (图30 的上部)、TRG18 (图31的上部)和TRG20 (图32的上部)分别是否在正常 外宫颈组织、子宫癌组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系中表达的RNA 印迹法结果的图；图17至32的下部是表示通过将与图17至32的上部图中 相同的样本分别与(3-肌动蛋白探针杂交获得的RNA印迹法结果的图。
图33至48是显示确定本发明的原癌基因TRG3(图33)、 TRG4(图34)、 TRG5 (图35 )、 TRG6 (图36 )、 TRG7 (图37 )、 TRG9 (图38 )、 TRGIO (图 39)、 TRGll (图40)、 TRG12 (图41 )、 TRG13 (图42 )、 TRG14 (图43 )、 TRG15 (图44 )、 TRG16 (图45 )、 TRG17 (图46 )、 TRG18 (图47 )、 TRG20
(图48)分别是否在正常人12泳道多组织中表达的RNA印迹法结果的图； 图33至48的下部是表示通过将图33至48上部的图中的相同样本分别与卩-肌动蛋白探针杂交获得的RNA印迹法结果的图。
图49至64是显示确定本发明的原癌基因TRG3 (图49 )、 TRG4 (图50 )、 TRG5 (图51 )、 TRG6 (图52 )、 TRG7 (图53 )、 TRG9 (图54 )、 TRG10 (图 55 )、 TRG11 (图56 )、 TRG12 (图57 )、 TRG13 (图58 )、 TRG14 (图59 )、 TRG15 (图60 )、 TRG16 (图61 )、 TRG17 (图62 )、 TRG18 (图63 )和TRG20
(图64)分别是否在人癌细胞系中表达的RNA印迹法结果的图表；图49至 64的下部是表示通过将与图49-64的上部图表中的相同样本分别与(3-肌动蛋 白探针杂交获得的RNA印迹法的结果的图表。
图65至80是显示确定本发明的原癌基因TRG3(图65 )、 TRG4(图66)、 TRG5 (图67 )、 TRG6 (图68 )、 TRG7 (图69 )、 TRG9 (图70 )、 TRG10 (图 71 )、 TRG11 (图72 )、 TRG12 (图73 )、 TRG13 (图74 )、 TRG14 (图75 )、 TRG15 (图76 )、 TRG16 (图77 )、 TRG17 (图78 )、 TRG18 (图79 )和TRG20
(图80)被分别转化入大肠杆菌(&c/^Wc/z/a co//)后，于左旋-阿拉伯糖诱 导前和诱导后表达的蛋白质大小的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳
(SDS-PAGE)结果的图。
具体实施例方式
以下，将参考附图详细描述本发明的优选实施例。
但是，这里提出的描述仅是为了对优选实施例进行举例说明，无意对发 明的范围进行限制。
实施例1:肿瘤细胞的培养和总RNA的分离 (步骤1)肺瘤细胞的培养
为了进行mRNA差异显示方法，由接受子宫切除手术的子宫肌瘤患者获 得正常外宫颈组织，并且由外科手术期间未接受前期抗癌化学治疗和/或放射 治疗的子宫癌患者获得原发宫颈肿瘤组织和转移淋巴结肿瘤组织。在差异显 示方法中使用CUMC-6 ( Kim, J. w.等人，G戸co/. 62: 230-240, 1996 )
作为人宫颈癌细胞系。
由获得组织得到的细胞和CUMC-6细胞系，在含有2mM谷氨酰胺、 100IU/mL青霉素、100|ug/mL链霉素和10%胎牛血清(Gibco，美国)的 Waymouth's MB 752/1培养基(Gibco)中生长。本实验中使用的培养细胞处 在指数生长阶段，并且这里使用的是在台盼蓝染中表现出至少95%生活力的 纟田月包(Freshney, "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique"第2 W反, A.R. Liss，纽约，1987)。
(步骤2 ) RNA的分离和mRNA差异显示方法
使用市售可得的系统RNeasy总RNA试剂盒(Qiagen公司，德国)将总 RNA样本从步骤1获得的各正常外宫颈组织、原发宫颈癌组织、转移淋巴结 肿瘤组织和CUMC-6细胞中分离出来。使用信息清洁(message clean)试剂 盒(GenHunter公司，Brookline, MA，美国)自RNA样本中去除DNA污染物。
实施例2:差异显示反转录-多聚酶链反应(DDRT-PCR)
使用由Liang, P.和A. B. Pardee提出的经过些微改变的反转录-多聚酶链 反应(RT-PCR)来进行差异显示反转录。
2-1.TRG3
首先，使用含有表示为SEQ ID NO: 3的DNA序列的锚定引物H-T11A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA，美 国)作为锚定oligo-dT引物，对在实施例1的步骤1中获得的0.2吗总RNA 进行反转录。
其次，使用相同的锚定引物和随机5'-13-mer引物(RNAimage引物1-5 ) H-AP 1至40中含有表示为SEQ ID NO: 4的DNA序列的H-AP20 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')的引物，在0.5mM [ a -35S] dATP (1200 Ci/mmole) 存在下进行PCR反应。该PCR反应在以下条件下进行全部40个扩增循环 由在95°C进行40秒的变性步骤、在40°C进行2分钟的退火步骤和在72°C进
行40秒的延长步骤组成，并且其后是一个在72 C进行5分钟的最终延长步 骤。
PCR-扩增片段溶解在6%的聚丙烯酰胺测序凝胶中，然后使用放射自显影 确定差异表达条带的位置。
自干燥的凝胶中切除含有H20-121 cDNA ( SEQ ID NO: 1的从1,342至 1,599的石威基位)的258-i咸基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H20-121 cDNA，然后除了这里不4吏用[a -35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20jiM dNTP夕卜，该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增 H20-121 cDNA。
2-2.TRG4
除了这里使用表示为 SEQ ID NO: 7的锚定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage试剂盒，Genhunter，公司，MA,美 国)和表示为SEQ ID NO: 8的引物H-AP9 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')夕卜，采用 同实施例2-l中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝月交中切除含有H93-811 cDNA ( SEQ ID NO: 5的从2,086至 2，478的碱基位)的393-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H93-811 cDNA,然后除了这里不使用[a -358]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP外，该PCR反应使用相同的引物在上述的相同条件下重复，以再扩增 H93-811 cDNA。
2-3.TRG5
除了这里4吏用含有表示为SEQIDNO: 11 DNA序列的锚定引物H-T11C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA，美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 12 DNA序歹l)的引物H-AP11 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。自干燥的凝胶中切除含有HI 17-321 cDNA ( SEQ ID NO: 9的从933至 1,224的碱基位)的292-碱基对(bp)条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱 HI 17-321 cDNA,然后除了这里不使用[a -358]-标记的dATP (1200 Ci/mmole) 和20(iM dNTP夕卜，该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复， 以再扩增HI 17-321 cDNA。
2-4.TRG6
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 15 DNA序列的锚定引物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 16 DNA序歹'J的引物 H-AP38 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝胶中切除含有H38-211 cDNA ( SEQ ID NO: 13的从2,823至 3,133的碱基位)的311-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H38-211 cDNA,然后除了这里不4吏用[a -358]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20pM dNTP外，该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增 H38-211 cDNA。
2-5.TRG7
除了这里4吏用含有表示为SEQ ID NO: 19 DNA序列的锚定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG画3', RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 20 DNA序歹'J的引物 H-AP38 (5'-AAGCTTCCAGTGC-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝胶中切除含有H38-621 cDNA ( SEQ ID NO: 17的从1,404至 1，695的石咸基位)的292-石咸基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H38-621 cDNA,然后除了这里不使用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20(iM dNTP夕卜，该PCR反应使用相同的引物在上述的相同条件下重复，以再扩增 H3 8-621 cDNA。2-6.TRG9
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 23 DNA序列的锚定引物H-T11A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter，公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 24 DNA序歹'J的引物H-AP9 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝胶中切除含有H96 cDNA ( SEQ ID NO: 21从1,225至1,499 的碱基位)的275-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H96 cDNA， 然后除了这里不使用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H96 cDNA。
2-7.TRG10
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 27 DNA序列的锚定S1物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3', RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 28 DNA序歹'J的引物 H-AP9 (5'-AAGCTTCATTCCG-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝胶中切除含有H94 cDNA( SEQ ID NO: 25的从3,528至3,879 的碱基位)的352-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H94 cDNA, 然后除了这里不4吏用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20)aM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H94 cDNA。
2-8.TRG11
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 31 DNA序列的锚定引物H-Tl 1C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter，公司，MA，美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 32 DNA序歹ll的引物H-AP4 (5'-AAGCTTCTCAACG-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝胶中切除含有H42 cDNA( SEQ ID NO:29的从83至229的碱 基位)的147-碱基对(bp)条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H42cDNA, 然后除了这里不使用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20pM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下进行，以再扩增H42 cDNA。
2-9.TRG12
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 35 DNA序列的锚定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3', RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 36 DNA序歹'J的引物H-AP10 (5'-AAGCTTCCACGTA-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝胶中切除含有H109 cDNA ( SEQ ID NO: 33的从284至495 的碱基位)的212-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H109 cDNA， 然后除了这里不使用[a-35s]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H109 cDNA。
2-10.TRG13
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 39 DNA序列的锚定引物H-T11C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 40 DNA序歹'J的引物 H-AP11 (5'-AAGCTTCGGGTAA-3')外，釆用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝胶中切除含有HI 19 cDNA ( SEQ ID NO: 37的从1,004至 1,235的碱基位)的232-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱HI 19 cDNA，然后除了这里不使用[a-"S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20|_iM
dNTP夕卜，该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增 H119cDNA。 2-11.TRG14
除了这里使用含有表示为SEQIDNO: 43 DNA序列的锚定引物H-T11G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG匿3'，認Aimage试剂盒，Genhunter，公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 44 DNA序歹'J的引物H-AP20 (5'-AAGCTTGTTGTGC-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝月交中切除含有H201 cDNA ( SEQ ID NO: 41的从卯2至1,096 的碱基位)的195-碱基对(bp)条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H201 cDNA, 然后除了这里不使用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20|iM dNTP 外，该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H201 cDNA。
2-12.TRG15
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 47 DNA序列的锚定引物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA，美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 48 DNA序歹'J的引物H-AP15 (5'-AAGCTTACGCAAC-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝胶中切除含有H151 cDNA ( SEQ ID NO: 45的从848至1,099 的碱基位)的252-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱HI51 cDNA， 然后除了这里不使用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20[iM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H151 cDNA。
2-13.TRG16
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 51 DNA序列的锚定引物H-Tl 1C
(5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 52 DNA序歹'J的引物H-AP13 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反 应。
自干燥的凝胶中切除含有H132 cDNA ( SEQ ID NO:49的从813至1,039 的碱基位)的227-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H132 cDNA, 然后除了这里不使用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20(iM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H132 cDNA。 2-14.TRG17
除了这里^吏用含有表示为SEQ ID NO: 55 DNA序列的锚定引物H-Tl 1G (5'-AAGCTTTTTTTTTTTG-3',脂Aimage试剂盒，Genhunter,公司，MA，美国) 和含有表示为 SEQ ID NO: 56 DNA序歹'J的引物 H-AP14 (5'-AAGCTTGGAGCTT-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝胶中切除含有H141 cDNA ( SEQ ID NO: 53的从235至419 的碱基位)的185-碱基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H141 cDNA， 然后除了这里不4吏用[a-35S]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20(iM dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增HI41 cDNA。
2-15.TRG 18
除了这里使用含有表示为SEQ ID NO: 59 DNA序列的锚定引物H-Tl 1C (5'-AAGCTTTTTTTTTTTC-3', RNAimage试剂盒，Genhunter,公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 60 DNA序歹'J的引物H-AP18 (5'-AAGCTTAGAGGCA-3')外，釆用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝胶中切除含有H181 cDNA ( SEQ ID NO: 57的从902至1,128 的碱基位)的227^咸基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H181 cDNA,
然后除了这里不使用[a-35s]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20^M dNTP外， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H181 cDNA。 2-16.TRG20
除了这里使用含有表示为SEQIDNO: 63 DNA序列的锚定引物H-Tl 1A (5'-AAGCTTTTTTTTTTTA-3'， RNAimage试剂盒，Genhunter，公司，MA,美 国)和含有表示为 SEQ ID NO: 64 DNA序歹'J的引物H-AP13 (5'-AAGCTTCGGCATA-3')外，采用同实施例2-1中相同的方法重复PCR反应。
自干燥的凝胶中切除含有H134 cDNA ( SEQ ID NO: 61的从232至417 的碱基位)的186-石威基对(bp )条带。提取的凝胶加热15分钟洗脱H134 cDNA, 然后除了这里不^f吏用[a画35s]-标记的dATP (1200 Ci/mmole)和20pM dNTP夕卜， 该PCR反应使用相同的引物在上述相同的条件下重复，以再扩增H134 cDNA。
实施例3:克隆
使用TA克隆系统(Promega,美国)，根据制造商的手册，分别将所有 如上述再扩增的H20-121产物、H93-811产物、Hl 17-321产物、H38-211产 物、H38-621产物、H96产物、H94产物、H42产物、H 109产物、H119产 物、H201产物、H151产物、H132产物、H141产物、H181产物和H134 PCR 产物插入pGEM-T EASY载体。 (步骤1 )连接反应
将所有在实施例2中再扩增的H20-121产物、H93-811产物、Hl 17-321产物、 H38-211产物、H38-621产物、H96产物、H94产物、H42产物、H109产物、 H119产物、H201产物、H151产物、H132产物、H141产物、H181产物和 H134PCR产物各2pL, lpLpGEM-TEASY载体(50ng) , lpLT4DNA连 接酶緩沖液(10x )和ljaL T4 DNA连接酶(3维斯单位/[iL; Promega)置入 0.5ml试管中，并且于其中加入蒸馏水至终体积为10pL。连接反应混合物在 14°C温育过夜。 (步骤2) TA克隆的转化
大肠杆菌JM109 (Promega， WI,美国)在10mL LB肉汤培养基(10g细 菌用胰酶解胨，5g细菌用酵母提取物，5g氯化钠)中培养，直到600nm光密 度达到大约0.3 ~ 0.6。温育的混合物在冰中保存约10分钟，然后4°C下10分 钟，4°C下4,000 rpm离心10分钟，然后弃上清液并收集细胞。收集的细胞沉 淀物暴露在10ml用冰预冷的O.IM的氯化钙中大约30分钟至1小时，以制备 感受态细胞。得到的产物在4°C下4,000rpm再次离心10分钟，然后弃去上 清液，并收集细胞，使其悬浮在2ml0.1M用冰预冷的氯化钙中。
将200|iL感受态细胞混悬液转移到新的小离心管中，于其中加入2(iL在 步骤1中制备的各连接反应的产物。得到的混合物在42°C水浴中温育90秒 钟，然后在0°C淬火。于其中加入800pL SOC培养基(2.0g细菌用胰酶解胨， 0.5g细菌用酵母提取物，1M的氯化钠lmL, 1M的氯化钾0.25mL， 97mL TDW, 2M的Mg2+ lmL, 2M的葡萄糖lmL ),得到的混合物在37°C 220rpm的旋转 震荡培养箱中培养45分钟。
用玻璃棒将25pL的X-gal (保存在40mg/ml的二曱基曱酰胺中)涂布在 补加氨苄青霉素、预先保存在37。C培养箱中的LB平板上，然后于其中添加 25pL各转化细胞，再次使用玻璃棒涂布，然后在37。C培养过夜。培养后，选 择3 ~4个成型的白色菌落，然后各选中的细胞在补加氨千青霉素的LB平板 上进行种子培养。为了构建质粒，那些被证明形成菌落的已将连接反应的产 物分别导入上述菌落中的菌林，称为转化的大肠杆菌菌株JM109/H20-121、 JM109/H93-811 、 JM109/H117-321 、 JM109/H38-211 、 JM109/H38-621 、 JM109/H96、 JM109/H94、 JM109/H42、 JM109/H109、 JM109/H119、 JM109/H201 、 JM109/H151、 JM109/H132、 JM109/H141、 JM109/H181和JM109/H134,选择 所述的菌抹在10mL极好的肉汤培养基(卯OmLTDW、 12g细菌用胰酶解胨、 24g细菌酵母提取物、4mL甘油、0.17MKH2PO4、 100ml 0.72g NK2HP04)中
培养。
实施例4:重组质粒DNA的分离
使用Wizard Plus MiniprepsDNA提纯试剂盒(Promege，美国)，根据 制造商的手册4艮据制造商的手册将各质粒DNA H20-121 、 H93-811 、 HI 17-321 、 H38隱211、 H38_621、 H96、 H94、 H42、 H109、 HI 19、 H201、 H151、 H132、 H141、 H181、和H134自转化的大肠杆菌菌株中分离出来。
确定将少量的各分离的质粒DNA用限制性酶ECoRI处理，然后在2%凝 胶中进行电泳以证明H20-121、 H93-811、 HI 17-321、 H38-211、 H38-621、 H96、 H94、 H42、 H109、 H119、 H201、 H151、 H132、 H141、 H181和H134的部 分序列被分别插入到质粒中。
实施例5: DNA碱基序列分析
5-1. TRG3
根据常规方法将在实施例2中获得的H20-121 PCR产物进行扩增、克隆， 然后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H20-121 PCT片段
进行测序。
该基因的DNA序列与SEQIDNO: 1的从1,342至1,599的核苷酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H20-121"。
使用5'-随机引物H-AP20和3'-锚定引物H-T11A,将上述获得的258-bp 的cDNA片段，即H20-121,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR )， 然后用电泳i正实。
如图l所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中为差异表达。在图1中可见，258-bp的cDNA片段 H20-121在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-2. TRG4
根据常规方法将在实施例2中获得的H93-811 PCR产物进行扩增、克隆， 然后再扩增。才艮据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H93-811 PCT片段
进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 5的从2，086至2,478的核苷酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H93-811"。
使用5'-随机引物H-AP9和3'-锚定引物H-T11G,将上述获得的393-bp 的cDNA片段，即H93-811,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR )， 然后用电泳i正实。
如图2所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图1中可见，393-bp的cDNA片段 H93-811在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-3. TRG5
根据常规方法将在实施例2中获得的H117-321 PCR产物进行扩增、克隆， 然后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物HI 17-321 PCT片段
进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 9的从933至1,224的核苷酸序列位置 相对应，在本发明中将该基因称为"H117-321"。
使用5'-随机引物H-AP11和3'-锚定引物H-T11C,将上述获得的292-bp 的cDNA片段，即H117-321,进行差异显示反转录-聚合酶链反应 (DDRT-PCR),然后用电泳证实。
如图3所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴
结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图3中可见，292-bp的cDNA片段 H117-321在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。 5-4. TRG6
根据常规方法将在实施例2中获得的H38-211 PCR产物进行扩增、克隆， 然后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H38-211 PCT片段
进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 13的从2,823-3,133的核苷酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H38-211"。使用5'-随机引物H-AP38 和3'-锚定引物H-T11A,将上述获得的311-bp的cDNA片段，即H38-211, 进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR),然后用电泳证实。
如图4所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图4中可见，311-bp的cDNA片段 H38-211在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组
织中非常罕见表达。 5-5. TRG7
根据常规方法将在实施例2中获得的H38-621 PCR产物进行扩增、克隆， 然后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH，美国)对产物H38-621 PCT片段
进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 17的从1,404-1,695的核苷酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H3 8-621"。
使用5'-随机引物H-AP38和3'-锚定引物H-T11G，将上述获得的292-bp 的cDNA片段，即H38-621,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR),
然后用电泳i正实。
如图5所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图5中可见，292-bp的cDNA片段 H38-621在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细月包中表达，^旦在正常组 织中非常罕见表达。
5-6. TRG9
根据常规方法将在实施例2中获得的H96PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。才艮据双脱氧《连终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H96 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 21的从1，225至1,499的核芬酸序列 位置相对应，在本发明中将该基因称为"H96"。
使用5'-随机引物H-AP9和3'-锚定引物H-T11A,将上述获得的275-bp 的cDNA片段，即H96,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)， 然后用电泳i正实。
如图6所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图6中可见，275-bp的cDNA片段 H96在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组织中 非常罕见表达。
5-7. TRG10
根据常规方法将在实施例2中获得的H94PCR产物进行扩增、克隆，然 后再次扩增。才艮据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒 (United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H94 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 25的从3,528至3，879的核苦酸序列 位置相对应，在本发明中将该基因称为"H94"。
使用5'-随机引物H-AP9和3'-锚定引物H-T11A，将上述获得的352-bp 的cDNA片段，即H94，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)， 然后用电泳i正实。
如图7所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图7中可见，352-bp的cDNA片段 H94在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组织中 非常罕见表达。
5-8. TRG11
根据常规方法将在实施例2中获得的H42PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H42 PCT片^殳进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 29的从83至229的核苦酸序列位置 相对应，在本发明中将该基因称为"H42"。
使用5'-随机引物H-AP4和3'-锚定引物H-T11C,将上述获得的147-bp 的cDNA片段，即H42，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR), 然后用电泳i正实。
如图8所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图8中可见，147-bp的cDNA片段 H42在宫颈癌、转移'淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组织中 非常罕见表达。
5-9. TRG12
根据常规方法将在实施例2中获得的H109PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。才艮据双脱氧《连终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物HI09 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 33的乂人284至495的核苷酸序列位置
相对应，在本发明中将该基因称为"H109"。
使用5'-随机引物H-AP10和3'-锚定引物H-T11G，将上述获得的212-bp 的cDNA片段，即H109,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR), 然后用电泳i正实。
如图9所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋巴 结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图9中可见，212-bp的cDNA片段 H109在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组织中 非常罕见表达。
5-10. TRG13
根据常规方法将在实施例2中获得的H119PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。才艮据双脱氧《连终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美国)对产物HI 19 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 37从1,004至1,235的核苷酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H119"。
使用5'-随机引物H-AP11和3'-锚定引物H-T11C，将上述获得的232-bp 的cDNA片段，即HI 19，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR )， 然后用电泳i正实。
如图10所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图10中可见，232-bp的cDNA片 ,殳HI 19在宫颈癌、转移'淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-11. TRG14
根据常规方法将在实施例2中获得的H201 PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。才艮据双脱氧《连终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美国)对产物H201 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 41的从902至1,096的核苦酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H201"。
使用5'-随机引物H-AP20和3'-锚定引物H-T11G,将上述获得的195-bp 的cDNA片段，即H201，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)，
然后用电泳i正实。
如图11所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图11中可见，195-bp的cDNA片 段H201在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-12. TRG15
根据常规方法将在实施例2中获得的H151 PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美国)对产物HI51 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 45的从848至1,099的核苦酸序列位 置相对应，在本发明中将该基因称为"H151"。
使用5'-随机引物H-AP15和3'-锚定引物H-T11A,将上述获得的252-bp 的cDNA片段，即H151，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)， 然后用电泳i正实。
如图12所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图12中可见，252-bp的cDNA片 段H151在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-13. TRG16
根据常规方法将在实施例2中获得的H132PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United
States Biochemical, Cleveland, OH，美国)对产物HI32 PCT片段进行测序。 该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 49的从813至1,039的核苷酸序列位
置相对应，在本发明中将该基因称为"H132"。
使用5'-随机引物H-AP13和3'-锚定引物H-T11C,将上述获得的227-bp
的cDNA片段，即H132,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR),
然后用电泳i正实。
如图13所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图13中可见，227-bp的cDNA片 段H132在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组
织中非常罕见表达。 5-14. TRG17
根据常规方法将在实施例2中获得的H141 PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物H141 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 53的从235至419的核苷酸序列位置 相对应，在本发明中将该基因称为"H141"。
使用5'-随机引物H-AP14和3'-锚定引物H-T11G，将上述获得的185七p 的cDNA片段，即H141,进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)， 然后用电泳i正实。
如图14所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图14中可见，185-bp的cDNA片 段H141在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-15. TRG18
根据常规方法将在实施例2中获得的H181 PCR产物进行扩增、克隆，然
后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH,美国)对产物HI81 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 57从卯2至1,128的核芬酸序列位置 相对应，在本发明中将该基因称为"H181"。
使用5'-随^L引物H-AP18和3'-锚定引物H-T11C，将上述获得的227-bp 的cDNA片段，即H181，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)， 然后用电泳i正实。
如图15所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细月包中差异表达。在图15中可见，227-bp的cDNA片 段H181在宫颈癌、转移'淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
5-16. TRG20
根据常规方法将在实施例2中获得的H134PCR产物进行扩增、克隆，然 后再扩增。根据双脱氧链终止法，使用测序酶2.0版本DNA测序试剂盒(United States Biochemical, Cleveland, OH，美国)对产物HI34 PCT片段进行测序。
该基因的DNA序列与SEQ ID NO: 61从232至417的核苷酸序列位置相 对应，在本发明中将该基因称为"H134"。
使用5'-随机引物H-AP13和3'-锚定引物H-T11A，将上述获得的186-bp 的cDNA片段，即H134，进行差异显示反转录-聚合酶链反应(DDRT-PCR)， 然后用电泳i正实。
如图16所示，差异显示(DD)表明该基因在正常外宫颈组织、转移淋 巴结组织和CUMC-6细胞中差异表达。在图16中可见，186-bp的cDNA片 段H134在宫颈癌、转移淋巴结组织和CUMC-6癌细胞中表达，但在正常组 织中非常罕见表达。
实施例6:全长TRG原癌基因的cDNA序列分析
6画1.TRG3
使用"P-标记的H20-121作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤维细胞 (human lung embryonic fibroblast) cDNA文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989) 。 乂人人胚肺成纤维细胞cDNA文库中获得将l，703-bp片段 插入到pCEV-LAC载体的全长TRG3 cDNA克隆，随后于2002年12月2日 保存在美国基因库数据库中，收录号为AY189688 (预定发布日期为2005年 4月8曰)。
插入到XpCEV载体的TRG3克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。包含TRG3基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接 酶连接以制备TRG3质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5a。
由l，703bp组成的TRG3的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 1 。
在SEQ ID NO: 1的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从113至1,522的核苦酸序列位置相对应，并编码由469个氨基酸组成 的SEQ ID NO: 2的蛋白质。
6-2.TRG4
使用"P-标记的H93-811作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤維细胞 cDNA文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )。从人胚肺成纤 维细胞cDNA文库中获得将2，576-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG4 cDNA克隆，随后于2002年12月2日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY189690 (预定发布日期为2005年4月8日)。插入到人pCEV载体的TRG4 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨苄青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体 (Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)的形式从噬菌体中分离出来。包含 TRG4基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG4质粒DNA， 然后用连"t妻的克隆转化大肠杆菌DH5 a。由2,576bp组成的TRG4的全长DNA 序列表示为SEQ ID NO: 5。在SEQ ID NO: 5的DNA序列中，估计本发明的 原癌基因的全长开放阅读框与从87至482的核苷酸序列位置相对应，并编码 由131个氨基酸组成的SEQ ID NO: 6蛋白质. 6隱3.TRG5
使用"P-标记的HI 17-321作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤维细胞 cDNA文库进行筛查(Miki，T.等人,Gene83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤 维细胞cDNA文库中获得将1 ，334-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG5 cDNA克隆，随后于2002年12月2日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY189689 (预定发布日期为2005年4月8日)。
插入到入pCEV载体的TRG5克隆用限制性酶Not I切割，并以氨节青霉 素抗性pCEV-LAC p蓝菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。包含TRG5基因的pCEV-LAC载体被T4 DNA连接 酶连接以制备TRG5质粒DNA,然后用连接的克隆转化转化大肠杆菌DH5 a。 由l,336bp组成的TRG5的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 9。
在SEQ ID NO: 9的DNA序列中，已证明本发明的原癌基因的全长开放 阅读框与从88至1,092的核芬酸序列位置相对应，并编码由334个氨基酸组 成的SEQ ID NO: IO蛋白质。
6-4.TRG6
使用"P-标记的H38-211作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤维细胞 cDNA文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )。从人胚肺成纤 维细胞cDNA文库中获得将3,309-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG6 cDNA克隆，随后于2002年12月5日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY191222 (预定发布日期为2005年4月8日)。插入到XpCEV载体的TRG6 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨千青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体 (Miki,T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)的形式从噬菌体中分离出来。
包含TRG6基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG6 质粒DNA，然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5a。
由3,309bp组成的TRG6的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 13。
在SEQ ID NO: 13的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从233-481的核苷酸序列位置相对应，并编码由82个氨基酸组成的SEQ IDNO:14蛋白质。
6-5.TRG7
使用3￥-标记的H38-621作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤维细胞 cDNA文库进行筛查(Miki， T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )。从人胚肺成纤 维细胞cDNA文库中获得将l，778-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG7 cDNA克隆，随后于2002年12月5日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY191223 (预定发布日期为2005年4月8日)。插入到XpCEV载体的TRG7 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨千青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体 (Miki，T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)的形式从噬菌体中分离出来。
包含TRG7基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连4妄以制备TRG7 质粒DNA，然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。由1,778bp组成的TRG7 的全长DNA序列表示为SEQIDNO: 17。
在SEQ ID NO: 17的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从42至1,422的核苦酸序列位置相对应，并编码由175个氨基酸组成 的SEQ ID NO: 18蛋白质。
6-6.TRG9
使用"P-标记的H96作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将1，582-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG9 cDNA克隆，随后于2003年4月9日保存在美国基因库数据库中，收录号为
AY272044 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到人pCEV载体的TRG9克隆用限制性酶Not I切割，并以氨卡青霉 素抗性pCEV-LAC p盆菌粒载体(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。包含TRG9基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接 酶连接以制备TRG9质粒DNA，然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由1，582bp组成的TRG9的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 21。
在SEQ ID NO: 21的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从17-1,576的核普酸序列位置相对应，并编码由519个氨基酸组成的 SEQ ID NO: 22蛋白质。
6-7.TRG10
使用32P-标记的H94作为探针对噬菌体人gtll人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将3，979-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG10 cDNA克隆，随后于2003年4月12日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277593 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG10克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG10基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG10 质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由3，979bp组成的TRG10的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 25。
在SEQ ID NO: 25的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从1,100至1,270的核苷酸序列位置相对应，并编码由56个氨基酸组 成的SEQ IDNO:26蛋白质。
6-8.TRG11
使用"P-标记的H42作为探针对噬菌体人gtll人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将235-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG11 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277594 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG11克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki， T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG11基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG11 质粒DNA,然后用连4妻的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由235bp组成的TRG11的全长DNA序列表示为SEQIDNO: 29。
在SEQ ID NO: 29的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从26至214的核苦酸序列位置相对应，并编码由62个氨基酸组成的 SEQ ID NO: 30蛋白质。
6-9.TRG12
使用3￥-标记的H109作为探针对噬菌体X gtll人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将510-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG12 cDNA克隆，随后于2003年，4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号 为AY277595 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG12克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG12基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG12 质粒DNA，然后用连^^的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由510bp组成的TRG12的全长DNA序列表示为SEQIDNO: 33。
在SEQ ID NO: 33的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅
读框与从80至475的核普酸序列位置相对应，并编码由131个氨基酸组成的
SEQ ID NO: 34蛋白质。 6-10.TRG13
使用"P-标记的HI 19作为探针对噬菌体入gtl 1人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将1,301-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG13 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277596 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG13克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG13基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG13 质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由1,301bp组成的TRG13的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 37。
在SEQ ID NO: 37的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从18至1,193的核香酸序列位置相对应，并编码由391个氨基酸组成 的SEQ ID NO: 38蛋白质。
6-11.TRG14
使用3￥-标记的H201作为探针对噬菌体人gtll人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将l，206-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG14 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277597 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG14克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG14基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG14 质粒DNA,然后用连^t妻的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由1,206bp组成的TRG14的全长DNA序列表示为SEQIDNO:41。
在SEQ ID NO: 41的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从18至1,202的核苷酸序列位置相对应，并编码由394个氨基酸组成 的SEQ ID NO: 42蛋白质。
6-12.TRG15
使用3￥-标记的H151作为探针对噬菌体X gtl 1人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki，T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将l，104-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG15 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277598 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG15克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG15基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG15 质粒DNA，然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由1，104bp组成的TRG15的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 45。
在SEQ ID NO: 45的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从1至1,104的核苦酸序列位置相对应，并编码由367个氨基酸组成的 SEQ ID NO: 46蛋白质。
6-13.TRG16
使用3￥-标记的H132作为探针对噬菌体X gtl 1人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将1，064-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG16 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277601 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到人pCEV载体的TRG16克隆用限制性酶Not I切割，并以氨节青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG16基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG16 质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由1,064bp组成的TRG 16的全长DNA序列表示为SEQIDNO: 49。
在SEQ ID NO: 49的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从92至1,064的核苷酸序列位置相对应，并编码由324个氨基酸组成 的SEQIDNO:50蛋白质。
6-14.TRG17
使用"P-标记的H141作为探针对噬菌体X gtl 1人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将432-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG17 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277599(预定发布日期为2005年3月31日)。插入到入pCEV载体的TRG17 克隆用限制性酶Notl切割，并以氨苄青霉素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体 (Miki,T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)的形式从噬菌体中分离出来。
包含TRG17基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG17 质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5ou
由432bp组成的TRG17的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 53。 在SEQ ID NO: 53的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从1至408的核苦酸序列位置相对应，并编码由135个氨基酸组成的 SEQ ID NO: 54蛋白质。
6-15.TRG18
使用"P-标记的H181作为探针对噬菌体X gtl 1人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将1,141-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG18 cDNA克隆，随后于2003年4月13日保存在美国基因库数据库中，收录号为 AY277600 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG18克隆用限制性酶Not I切割，并以氨千青霉 素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由1,141bp组成的TRG18的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 57。
在SEQ ID NO: 57的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅
读框与从20至1,141的核苷酸序列位置相对应，并编码由373个氨基酸组成
的SEQ ID NO: 58蛋白质。 6-16.TRG20
使用"P-标记的H134作为探针对噬菌体X gtl 1人胚肺成纤维细胞cDNA 文库进行筛查(Miki, T.等人，Gene 83: 137-146， 1989)。从人胚肺成纤维细 胞cDNA文库中获得将449-bp片段插入到pCEV-LAC载体的全长TRG20 cDNA克隆，随后于2003年IO月29日保存在美国基因库数据库中，收录号 为AY453397 (预定发布日期为2005年3月31日)。
插入到XpCEV载体的TRG20克隆被限制性酶Not I切割，并以氨千青霉
素抗性pCEV-LAC噬菌粒载体(Miki， T.等人，Gene 83: 137-146, 1989 )的形 式从噬菌体中分离出来。
包含TRG20基因的pCEV-LAC载体用T4 DNA连接酶连接以制备TRG20 质粒DNA,然后用连接的克隆转化大肠杆菌DH5 a。
由449bp组成的TRG20的全长DNA序列表示为SEQ ID NO: 61 。
在SEQ ID NO: 61的DNA序列中，估计本发明的原癌基因的全长开放阅 读框与从42至449核苷酸序列位置相对应，并编码由135个氨基酸组成的SEQ ID NO: 62蛋白质。
实施例7:多种细胞中TRG基因的RNA印迹分析
采用同实施例1中相同的方法，将总RNA样本从正常外宫颈组织、宫颈 癌组织、转移宫颈'淋巴结组织以及宫颈癌细月包系CaSki(ATCC CRL 1550)和 CUMC-6中4是取出来。
为确定各TRG基因的表达水平，取由组织和细胞系中提取的各总变性 RNA样本20iig，于1%曱醛琼脂糖凝胶中进行电泳，然后将得到的琼脂糖凝 胶转移到尼龙膜(Boehringer-Mannheim,德国)上。然后使印迹与"P-标记和 使用Rediprime II随机引物标记系统(Amersham,英国)制备的随机引物的 全长TRG cDNA探针进行杂交。重复两次RNA印迹分析，然后将得到的印 迹由密度计进行定量并用P-肌动蛋白进行标准化。
图17的上部显示的是确定TRG3原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达的 RNA印迹的结果。如图17所示，显示TRG3原癌基因的表达水平增加，也就 是说，大小为大约1.7kb的优势TRG3 mRNA转录物在宫颈癌组织以及宫颈癌 细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图17中，"正常"泳道代表正常外宫颈组 织，"癌"泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图17的下部显示的是由相同样
本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。 图33显示的是确定TRG3原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋"几、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图33的下部显示的是由 相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明|3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图33所示，显示TRG3 mRNA转录物(大小为大约1.7kb的优势 TRG3 mRNA转录物)在如心脏和肌肉的正常组织中表达，但是在如脑、大肠、 胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中罕 见表达。
图49显示的是确定TRG3原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 (Clontech)中是否表达的RNA印迹 的结果。图49的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动 蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图19a所示，显示TRG3 mRNA 转录物(大小为大约1.7kb的优势TRG3 mRNA转录物)在如早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
图18的上部显示的是确定TRG4原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈、淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达的 RNA印迹的结果。如图18所示，显示TRG4的表达水平增高，也就是说，大 小为大约3.0kb的优势TRG4 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫颈癌细胞系 CaSki和CUMC-6中过表达。图18中，"正常"泳道代表正常外宫颈组织，"癌" 泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及各"CaSki，，和 "CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图18的下部显示的是由相同样本和P-肌 动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。 图34显示的是确定TRG4原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech ) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图34的下部显示的是由 相同样本和p-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图34所示，显示TRG4 mRNA转录物(大小为大约3.0kb的优势 TRG4mRNA转录物)在如脑、心脏、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、 胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中表达。
图50显示的是确定TRG4原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562 、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361 (Clontech)中是否表达的RNA印迹 的结果。图50的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动 蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图50所示，显示TRG4 mRNA转 录物(大小为大约3.0kb的优势TRG4 mRNA转录物)在HeLa子宫癌细胞系、 慢性髓性白血病细胞系K-562和结肠癌细胞系SW480中为非常高的表达。
图19的上部显示的是确定TRG5原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈;休巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达的 RNA印迹的结果。如图19所示，显示TRG5原癌基因的表达水平增高，也就 是说，大小为大约1.4kb的优势TRG5 mRNA转录物在宫颈癌组织以及宫颈癌 细胞系CaSki和CUMC-6中为过表达。图19中，"正常，，泳道代表正常外宫颈 组织，"癌"泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及各 "CaSki，，和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图19的下部显示的是由相同样 本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。
图35显示的是确定TRG5原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)如 脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外 周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图35的下部显示的是由相 同样本和p-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹
结果。如图35所示，显示TRG5mRNA转录物(大小为大约1.4kb的优势TRG5 mRNA转录物)在如脑、心脏、肌肉和肾脏的正常组织中表达，但是在如大 肠、胸腺、脾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中罕见 表达。
图51显示的是确定TRG5原癌基因在人癌细胞系如HL-60、HeLa、K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA印迹结 果。图51的下部显示的是由相同样本和p-肌动蛋白探针杂交表明p-肌动蛋白 mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图51所示，显示TRG5 mRNA转录物 (大小为大约1.4kb的优势TRG5 mRNA转录物)在如早幼粒白血病细胞系 HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细胞白 血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、肺 癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
图20的上部显示的是确定TRG6原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达的 RNA印迹的结果。如图20所示，显示TRG6原癌基因的表达水平增高，也就 是说，大小为大约7.0kb的优势TRG6 mRNA转录物在宫颈癌组织以及宫颈癌 细胞系CaSki和CUMC-6中为过表达。图20中，"正常"泳道代表正常外宫颈 组织，"癌"泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图20的下部显示的是由相同样 本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。
图36显示的是确定TRG6原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)如 脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外 周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹结果。图36的下部显示的是由相同 样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。如图36所示，TRG6 mRNA转录物(大小为大约7.0kb的优势TRG6 mRNA转录物)显示在如脑、心脏、肌肉、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、 胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中无表达。
图52显示的是确定TRG6原癌基因在人癌细胞系如早幼粒白血病细胞系 HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细胞白 血病细胞系MOLT-4、伯基特'淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、月申 癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361(Clontech)中是否表达的RNA印迹的结 果。图52的下部显示的是由相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白 mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图52所示，显示TRG6 mRNA转录物 (大小为大约7.0kb的优势TRG6 mRNA转录物)在HeLa子宫癌细胞系和皮 肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
图21的上部显示的是确定TRG7原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈;休巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达的 RNA印迹的结果。如图21所示，显示TRG7原癌基因的表达水平增高，也就 是说，大小为大约2.0kb的优势TRG7 mRNA转录物在宫颈癌组织以及宫颈癌 细胞系CaSki和CUMC-6为过表达。图21中，"正常，，泳道代表正常外宫颈组 织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图17的下部显示的是由相同样 本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹。
图37显示的确定TRG7原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)如脑、 心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血 白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图37的下部显示的是由相同样 本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。 如图37所示，显示TRG7 mRNA转录物(大小为大约2.0kb的优势TRG7 mRNA 转录物)在如心脏、肌肉、肾脏和胎盘的正常组织中表达，并且同时大小为 大约2.4kb的优势TRG7 mRNA转录物也罕见表达，^f旦是其在如脑、大肠、胸
腺、脾脏、肝脏、小肠、肺和外周血白细胞的正常组织中无表达。
图53显示的是确定TRG7原癌基因在人癌细胞系如HL-60、HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA印迹的 结果。图53的下部显示的是由相同样本和p-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋 白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图53所示，显示TRG7 mRNA转录 物(大小为大约2.0kb的优势TRG7 mRNA转录物)在早幼粒白血病细胞系 HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细胞白 血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、肺 癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。同时，大小为大约 2.4kb的TRG7 mRNA转录物在人癌细胞系中也为过表达。
图22的上部显示的是确定TRG9原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈:林巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达的 RNA印迹的结果。如图22所示，显示TRG9原癌基因的表达水平增高，也就 是说，大小为大约2.4kb的优势TRG9 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫颈癌细 胞系CaSki和CUMC-6中为过表达。图22中，"正常"泳道代表正常外宫颈组 织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及各 "CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图22的下部显示的是由相同样 本和p-肌动蛋白探针杂交表明p-肌动蛋白mRNA是否转的RNA印迹结果。
图38显示的是确定TRG9原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)如 脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外 周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹结果。图38的下部显示的是由相同 样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明p-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。如图38所示，显示TRG9 mRNA转录物(大小为大约2.4kb的优势TRG3 mRNA转录物)在如心脏、肌肉、肾脏和胎盘的正常组织中罕见表达，但在 如脑、大肠、胸腺、月年脏、肝脏、小肠、肺和外周血白细胞的正常组织中几乎不表达。
图54显示的是确定TRG9原癌基因在人癌细胞系如HL-60、HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA印迹结 果。图54的下部显示的是由相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明p-肌动蛋白 mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图54所示，显示TRG3 mRNA转录物 (大小为大约2.4kb的优势TRG9 mRNA转录物)在早幼粒白血病细胞系 HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细胞白 血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、肺 癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。并且，同时大小为 大约2.0kb的TRG9 mRNA转录物也存在表达。
图23的上部显示的是确定TRG10原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图23所示，显示TRG3原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约6.0kb的优势TRG10 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图23中，"正常，，泳道代表正常外宫 颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及 各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图23的下部显示的是由相同 样本和p-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。
图39显示的是确定TRG10原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹结果。图39的下部显示的是由相 同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹 结果。如图39所示，TRG10mRNA转录物(大小为大约6.0kb的优势TRG10 mRNA转录物)显示在如心脏、肝脏、外周血白细胞和脾脏的正常组织中表
达，但在如脑、肌肉、大肠、胸腺、肾脏、小肠、胎盘和肺的正常组织中不 表达。
图55显示的是确定TRG10原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图55的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图55所示，显示TRG10 mRNA 转录物(大小为大约6.0kb的优势TRG10 mRNA转录物)在HeLa子宫癌细 胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562和淋巴母细胞白血病细胞系MOLT-4中 为非常高的表达，在早幼粒白血病细胞系HL-60、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、 结肠癌细胞系SW480、肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为高表达。 大小为大约3.0kb的TRG10 mRNA转录物也在癌细胞系中存在表达。
图24的上部显示的是确定TRG11原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹结果。如图24所示，显示TRGll原癌基因的表达水平增高，也 就是说，大小为大约1.5kb的优势TRGll mRNA转录物在宫颈癌组织、转移 宫颈癌组织以及宫颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图24中，"正常" 泳道代表正常外宫颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫 颈淋巴结组织以及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图24的下 部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转 录的RNA印迹结果。
图40显示的是确定TRG11原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图40的下部显示的是由 相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明|3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图40所示，显示TRG11 mRNA转录物(大小为大约1.5kb的优势 TRG11 mRNA转录物)在如心脏、肝脏的正常组织中表达，但在如脑、肌肉、 大肠、胸腺、脾脏、肾脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中几 乎不表达。
图56显示的是确定TRG11原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图56的下部显示的是由相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图56所示，显示TRG11 mRNA 转录物(大小为大约1.5kb的优势TRGllmRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为高表达。并且，大小为大约1.3kb 的TRG11 mRNA转录物在癌细胞系中罕见表达。
图25的上部显示的是确定TRG12原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图25所示，显示TRG12原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约5.0kb的优势TRG12mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图25中，"正常，，泳道代表正常外宫 颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及 各"CaSki"和"CUMC-6，，泳道代表子宫癌细胞系。图25的下部显示的是由相同 样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。
图41显示的是确定TRG12原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横统肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图41的下部显示的是由 相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印
迹结果。如图41所示，显示TRG12mRNA转录物(大小为大约5.0kb的优势 TRG12mRNA转录物)在如脑、心脏、肌肉、肾脏、肝脏、胎盘和外周血白 细胞的正常组织中罕见表达，但在如大肠、胸腺、脾脏、小肠和肺的正常组 织中几乎不表达。
图57显示的是确定TRG12原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图57的下部显示的是由相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图57所示，显示TRG12 mRNA 转录物(大小为大约5.0kb的优势TRG12 mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
图26的上部显示的是确定TRG13原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图26所示，显示TRG13原癌基因的表达水平增加， 也就是"i兌，在宫颈癌组织和宫颈癌细^^系CaSki和CUMC-6中，大小为大约 4.0kb的优势TRG13 mRNA转录物过表达。图26中，"正常，，泳道代表正常外 宫颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以 及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图26的下部显示的是由相 同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹 结果。
图42显示的是确定TRG13原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图42的下部显示的是由 相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印
迹结果。如图42所示，显示TRG13 mRNA转录物(大小为大约4.0kb的优势 TRG13 mRNA转录物)在如心脏和肌肉的正常组织中表达，但在如脑、大肠、 胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘和外周血白细胞的正常组织中罕见表 达。并且，同时大小为大约5.0kb的TRG13mRNA转录物罕见表达。
图58显示的是确定TRG13原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图58的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图58所示，显示TRG13 mRNA 转录物(大小为大约4.0kb的优势TRG13mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。同时大小为大约 5.0kb的TRG13 mRNA也为高表达。
图27的上部显示的是确定TRG14原癌基因正常外宫颈组织、宫颈癌组 织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否在表达 的RNA印迹的结果。如图27所示，显示TRG14原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约3.5kb的优势TRG14 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图27中，"正常"泳道代表正常外宫 颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及 各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图27的下部显示的是由相同 样本和|3-肌动蛋白4笨针杂交表明p-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。
图43显示的是确定TRG14原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图43的下部显示的是由
相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图43所示，显示TRG14mRNA转录物(大小为大约3.5kb的优势 TRG14 mRNA转录物)在如心脏和肌肉的正常组织中表达，但在如脑、大肠、 胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中罕 见表达。
图59显示的是确定TRG14原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K隱562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图59的下部显示的是由相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图59所示，显示TRG14 mRNA 转录物(大小为大约3.5kb的优势TRG14mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
图28的上部显示的是确定TRG15原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图28所示，显示TRG15原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约3.5kb的优势TRG15 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图28中，"正常"泳道代表正常外宫 颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及 各"CaSki，，和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图28的下部显示的是由相同 样本和p-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。
图44显示的是确定TRG15原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的 RNA 印迹的结果。
图44的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白 mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图44所示，显示TRG15 mRNA转录物 (大小为大约3.5kb的优势TRG15 mRNA转录物)在如心脏和肌肉的正常组 织中表达，但在如脑、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞的正常组织中非常罕见表达。同时大小为大约3.0kb和4.0kb的 TRG15 mRNA转录物也非常罕见表达。
图60显示的是确定TRG15原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图60的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图60所示，显示TRG15 mRNA 转录物(大小为大约3.5kb的优势TRG15 mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。同时，大小为大 约3.0kb和4.0kb的TRG15 mRNA转录物也为非常高的表达。
图29的上部显示的是确定TRG16原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图29所示，显示TRG16原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约4.5kb的优势TRG16 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中过表达。图29中，"正常，，泳道代表正常外宫 颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以及 各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图29的下部显示的是由相同 样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结 果。
图45显示的是确定TRG16原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)
如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和
外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图45的下部显示的是由 相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图45所示，显示TRG16mRNA转录物(大小为大约3.5kb的优势 TRG16mRNA转录物)在如脑和心脏的正常组织中表达，但在如肌肉、大肠、 胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中非 常罕见表达。同时大小为大约5.0kb的TRG16mRNA转录物也非常罕见表达。
图61显示的是确定TRG16原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K画562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图61的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图61所示，显示TRG16 mRNA 转录物(大小为大约4.5kb的优势TRG16 mRNA转录物)在HeLa子宫癌细 胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细胞白血病细胞系MOLT-4、结 肠癌细胞系SW480、肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表 达。同时，大小为大约5.0kb的TRG16 mRNA转录物也为高表达。
图30的上部显示的是确定TRG17原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈'淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图30所示，显示TRG17原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约1.3kb的优势TRG17 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细^^系CaSki和CUMC-6中为过表达。图30中，"正常"泳道代表正常外 宫颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移，，泳道代表转移宫颈淋巴结组织以 及各"CaSki，，和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图30的下部显示的是由相 同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹 结果。
图46显示的是确定TRG17原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)
如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和
外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹的结果。图46的下部显示的是由 相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图46所示，显示TRG17mRNA转录物(大小为大约1.3kb的优势 TRG17 mRNA转录物)在如脑、心脏和肌肉的正常组织中表达，但在如大肠、 胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中非 常罕见表达。
图62显示的是确定TRG17原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 M0LT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图62的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图62所示，显示TRG17 mRNA 转录物(大小为大约1.3kb的优势TRG17mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
图31的上部显示的是确定TRG18原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈;休巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图31所示，显示TRG18原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约2.4kb的优势TRG18 mRNA转录物在宫颈癌组织和宫 颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中为过表达。图31中，"正常，，泳道代表正常外 宫颈组织，"癌，，泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织以 及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图31的下部显示的是由相 同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹 结果。
图47显示的是确定TRG18原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech)
如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的認A印迹的结果。图47的下部显示的是由
相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印 迹结果。如图47所示，显示TRG18mRNA转录物(大小为大约2.4kb的优势 TRG18 mRNA转录物)在如脑、心脏、肌肉、肾脏、肝脏和胎盘的正常组织 中罕见表达，但在如大肠、胸腺、脾脏、小肠、肺和外周血白细胞的正常组 织中无表达。同时，大小为大约1.5kb的TRG18mRNA转录物也非常罕见表 达。
图63显示的是确定TRG18原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图63的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图63所示，显示TRG18 mRNA 转录物(大小为大约2.4kb的优势TRG18 mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。同时，大小约为 1.5kb的TRG18 mRNA转录物也为高表达。
图32的上部显示的是确定TRG20原癌基因在正常外宫颈组织、宫颈癌 组织、转移宫颈淋巴结组织和宫颈癌细胞系(CaSki和CUMC-6 )中是否表达 的RNA印迹的结果。如图32所示，显示TRG20原癌基因的表达水平增高， 也就是说，大小为大约1.3kb的优势TRG20mRNA转录物在宫颈癌组织以及 宫颈癌细胞系CaSki和CUMC-6中为过表达。图32中，"正常"泳道代表正常 外宫颈组织，"癌"泳道代表宫颈癌组织，"转移"泳道代表转移宫颈淋巴结组织 以及各"CaSki"和"CUMC-6"泳道代表子宫癌细胞系。图32的下部显示的是由 相同样本和(3-肌动蛋白探针杂交表明(3-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印
迹结果。
图48显示的是确定TRG20原癌基因在正常人12-泳道多组织(Clontech) 如脑、心脏、横紋肌、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝脏、小肠、胎盘、肺和 外周血白细胞组织中是否表达的RNA印迹结果。图48的下部显示的是由相 同样本和J3-肌动蛋白探针杂交表明P-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹 结果。如图48所示，显示TRG20 mRNA转录物(大小为大约1.3kb的优势 TRG20 mRNA转录物)在如脑、心脏、肌肉、大肠、胸腺、脾脏、肾脏、肝 脏、小肠、胎盘、肺和外周血白细胞的正常组织中非常罕见表达或无表达。
图64显示的是确定TRG20原癌基因在人癌细胞系如HL-60、 HeLa、 K-562、 MOLT-4、 Raji、 SW480、 A549和G361(Clontech)中是否表达的RNA 印迹的结果。图64的下部显示的是由相同样本和P-肌动蛋白探针杂交表明卩-肌动蛋白mRNA是否转录的RNA印迹结果。如图64所示，显示TRG20 mRNA 转录物(大小为大约1.3kb的优势TRG20 mRNA转录物)在早幼粒白血病细 胞系HL-60、 HeLa子宫癌细胞系、慢性髓性白血病细胞系K-562、淋巴母细 胞白血病细胞系MOLT-4、伯基特淋巴瘤细胞系Raji、结肠癌细胞系SW480、 肺癌细胞系A549和皮肤癌细胞系G361中为非常高的表达。
实施例8:对TRG原癌基因转化大肠杆菌后表达的蛋白质大小的确定
将SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO: 5、 SEQ IDNO: 9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQIDNO:21、 SEQ ID NO: 25、 SEQIDNO:29、 SEQ ID NO: 33、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 41 、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO: 53、 SEQ ID NO: 57和SEQ ID NO: 61的各TRG原癌基因插入pBAD/thio-Topo 载体(Invitrogen，美国)的多克隆位点，然后由各得到的pBAD/thio-T叩o载体 转化大肠杆菌ToplO (Invitrogen，美国)。将表达蛋白质，HT-硫氧还蛋白插入 pBAD/thio-T叩o载体多克隆位点的上游区。各转化的大肠杆菌菌抹在LB肉 汤培养基中培养同时震荡，然后各得到的培养物按1/100的比例稀释并再培养
3小时。于其中加入0.5mM左旋-阿拉伯糖(Sigma)以促进其蛋白质的生成。 在左旋-阿拉伯糖诱导前/后将大肠杆菌细胞在培养基中超声处理，然后经 超声处理的匀浆进行12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS-PAGE )。
图65显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG3载体转化的大肠杆菌 ToplO菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为67kDa的融合蛋白条带。67-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-石克氧还蛋白和分子量大约为52kDa的TRG3 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG3载体中。
图66显示的是确定在由pBAD/thio-T叩o/TRG4载体转化的大肠杆菌 ToplO菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为29kDa的融合蛋白条带。29-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为14kDa的TRG4 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG4载体中。
图67显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG5载体转化的大肠杆菌 T叩IO菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为52kDa的融合蛋白条带。52-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为37kDa的TRG5 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG5载体中。
图68显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG6载体转化的大肠杆菌 ToplO菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE的结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱 导后可以清楚的观察到分子量大约为24kDa的融合蛋白条带。24-kDa的融合 蛋白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为9kDa的 TRG6蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG6载体中。
图69显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG7载体转化的大肠杆菌ToplO菌林中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为35kDa的融合蛋白条带。35-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为20kDa的TRG7 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG7载体中。
图70显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG9载体转化的大肠杆菌 Top10菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为73kDa的融合蛋白条带。73-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为58kDa的TRG9 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG9载体中。
图71显示的是确定在由pBAD/thio-T叩o/TRG10载体转化的大肠杆菌 Top10菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为21kDa的融合蛋白条带。21-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为6kDa的TRG10 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG 10载体中。
图72显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG11载体转化的大肠杆菌 Top10菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为22kDa的融合蛋白条带。22-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为7kDa的TRG11 蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG 11载体中。
图73显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG12载体转化的大肠杆菌 Top10菌株中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为29kDa的融合蛋白条带。29-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为14kDa的 TRG12蛋白，将各蛋白插入pBAD他io-Topo/TRG 12载体中。
图74显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG13载体转化的大肠杆菌
ToplO菌林中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为55kDa的融合蛋白条带。55-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为40kDa的 TRG13蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG13载体中。
图75显示的是确定在由pBAD/thio-T叩o/TRG14载体转化的大肠杆菌 ToplO菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为58kDa的融合蛋白条带。58-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为43kDa的 TRG14蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG 14载体中。
图76显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG15载体转化的大肠杆菌 ToplO菌林中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为57kDa的融合蛋白条带。57-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为42kDa的 TRG15蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRGl 5载体中。
图77显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG16载体转化的大肠杆菌 ToplO菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为51kDa的融合蛋白条带。51-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为36kDa的 TRG16蛋白，将各蛋白被插入pBAD/thio-T叩o/TRG16载体。
图78显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG17载体转化的大肠杆菌 ToplO菌林中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为31kDa的融合蛋白条带。31-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为16kDa的 TRG17蛋白，将各蛋白插入pBAD池io-T叩o/TRG 17载体中。
图79显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG18载体转化的大肠杆菌
ToplO菌株中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为57kDa的融合蛋白条带。57-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为42kDa的 TRG18蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRGl8载体中。
图80显示的是确定在由pBAD/thio-Topo/TRG20载体转化的大肠杆菌 Top10菌抹中蛋白质表达模式的SDS-PAGE结果，其中在左旋-阿拉伯糖诱导 后可以清楚的观察到分子量大约为31kDa的融合蛋白条带。31-kDa的融合蛋 白包括分子量大约为15kDa的HT-硫氧还蛋白和分子量大约为16kDa的 TRG20蛋白，将各蛋白插入pBAD/thio-Topo/TRG20载体中。
工业可行性
如上所述，本发明的原癌基因，已知是与人类癌发生有关并同时表现出 诱导癌症转移的能力，可以有效的用于诊断包括子宫癌、白血病、淋巴瘤、 结肠癌、肺癌、皮肤癌等的多种癌症。
权利要求
1、一种人原癌蛋白，具有选自由SEQ ID NO2、SEQ ID NO6、SEQ ID NO10、SEQ ID NO14、SEQ ID NO18、SEQ ID NO22、SEQID NO26、SEQ ID NO30、SEQ ID NO34、SEQ ID NO38、SEQ IDNO42、SEQ ID NO46、SEQ ID NO50、SEQ ID NO54、SEQ ID NO58和SEQ ID NO62组成的组的氨基酸序列。
2、 一种人原癌基因，其编码权利要求1中限定的原癌蛋白。
3、 根据权利要求2所述的人原癌基因，其含有选自由与SEQ ID NO: 1从113至1,522核苦酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 5 从87至482核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 9从88 至1,092核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 13从233 至481核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 17从42至 1,422核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 21从17至 1,576核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 25从1100 至1，270核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 29从26 至214核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 33从80至 475核苷酸序列位置对应DNA序列、与SEQ ID NO: 37从18至1,193 核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 41从18至1,202 核苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 45从1至1,104核 苷酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 49从92至1,064核苷 酸序列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 53 乂人1至408核苷酸序 列位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 57从20至1,141核苷酸序列 位置对应的DNA序列、与SEQ ID NO: 61从42至449核苷酸序列位 置对应的DNA序列组成的组中的DNA序列。
4、 根据权利要求2所述的人原癌基因，其具有选自由SEQ ID NO.' 1、 SEQ ID NO: 5、 SEQIDNO:9、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 17、 SEQ ID NO: 21 、 SEQ ID NO: 25 、 SEQ ID NO: 29、 SEQ ID NO: 33 、 SEQ ID NO: 37、 SEQ ID NO: 41、 SEQ ID NO: 45、 SEQ ID NO: 49、 SEQ ID NO: 53 、 SEQ ID NO: 57和SEQ ID NO: 61组成的组的DNA序列。
5、 一种载体，其包括权利要求2至4中任一项限定的原癌基因。
6、 一种用于诊断癌症的试剂盒，其包括权利要求1中限定的原癌 蛋白。
7、 一种用于诊断癌症的试剂盒，其包括权利要求2至4中任一项 限定的原癌基因。
全文摘要
本发明公开了一种原癌基因和由该基因编码的蛋白质。已知本发明的原癌基因与人类癌发生有关，可有效的用于诊断包括子宫癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、肺癌、皮肤癌等的多种癌症。
文档编号C07K14/435GK101184773SQ200680018673
公开日2008年5月21日 申请日期2006年3月30日 优先权日2005年3月30日
发明者金弦起, 金振宇 申请人:金弦起