专利名称：α－地中海贫血基因诊断试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种疾病诊断试剂及其应用，特别是涉及一种为α-地中海贫血作基因诊断的试剂盒及其应用。
背景技术：
地中海贫血是一种遗传性溶血性贫血病，最初发现于地中海沿岸国家，故称之为地中海贫血(Thalassemia)。在非洲、欧洲等全世界热带地区和国家包括东南亚各国，我国南方各省，香港、台湾等均多见。
地中海贫血分为α-地中海贫血和β-地中海贫血两类，分别由α-珠蛋白基因和β-珠蛋白基因缺失、突变等缺陷所造成，呈现常染色体隐性遗传规律。
成人血红蛋白(HbA)由2条α-珠蛋白链和2条β-珠蛋白链与一个血红素分子结合而成，即α2β2，具有很好的输送氧气的功能。胎儿早期血红蛋白由2条ξ链和2条γ链组成(ξ2γ2)，后期ξ珠蛋白的基因表达逐渐关闭，α-珠蛋白基因开始表达，故胎儿血红蛋白(HbF)组成为α2γ2。出生后，γ-珠蛋白的链又逐渐被β-珠蛋白链取代，故HbA由α2β2组成。
α-地中海贫血患者α链和β链失去平衡，相对过多的β链聚合成β4聚体，但β4不稳定，容易解聚形成H包涵体沉积在红细胞内，附着在红细胞膜上，使红细胞变形性降低，易遭破坏产生溶血，患者表现为红细胞不均(又称为异型红细胞症)，中度或严重贫血，肝脾肿大。从分子病理学的角度来看，编码α-珠蛋白链的α-珠蛋白基因是位于人类16号染色体上的一个基因簇，从5’至3’依次为ξ-Ψξ(假ξ)-Ψα2-Ψα1-α2-α1-θ1，其中ξ产生胎儿血红蛋白的组成成分ξ珠蛋白链，在胎儿早期表达。后期至出生后，逐渐被α2和α1所代替。α2，α1是两个重要的功能基因，二者的序列99.99％都完全相同，但研究表明，α2基因的表达要比α1强。由于α1与α2之间的高度同源性，故两条染色体上的4个α基因之间很可能发生不等交换，造成例如一条染色体上三个α基因串联，而另一条染色体上只剩下一个α基因(-α3.7或-α4.2)等α基因的多种大片段缺失。导致我国α-地中海贫血的α基因的缺失，除3.7kb，-α3.7和4.2kb，-α4.2外，还有一种缺失范围长达20kb的包括α2，α1在内的严重缺失，称为东南亚型缺失(-SEA)。α-地中海贫血在临床上划分为4型静止型，轻型，标准型(血红蛋白病，HbH病)，以及Bart’s水肿胎儿(巴氏水肿胎儿)。静止型又称为地中海贫血2或α+-地中海贫血，基本无症状，是缺失一个α-基因的携带者(-α/αα)。轻型α-地中海贫血又称为α-地中海贫血1或α0-地中海贫血，有轻微贫血症状，多是因缺失2个α基因所致(--/αα，或-α/-α)；少数为非缺失型(-α/αTα)。HbH病是临床上最常见的α-地中海贫血类型，有明显甚至严重的贫血症状。患儿从1岁左右即出现贫血，严重者肝脾肿大及黄疸，面黄肌瘦并伴骨骼变化，靠输血维持生命。HbH病患者共缺失或相当于缺失三个α基因。其基因型为-α3.7/-SEA或-α4.2/--SEA或αTα/-SEA(αTα为非缺失型，在我国只发现两种突变αCSα(T-C)，αQZα(T-C)，其功能相当于缺失一个α基因，比缺失型少见得多)。巴氏水肿胎儿是最严重的一种，胎儿4个有功能的α基因全部缺失(-SEA/-SEA)，生下来就是死胎或很快死亡。其他国家人群中发现的2个α-基因缺失型，例如-Tai，-Phil等，均可导致巴氏水肿胎。
迄今为止，医学上对于α-地中海贫血尚无有效的根治方法，因此开展基因诊断、携带者检查及产前诊断，是预防新的患儿出生，阻断有害基因下传，提高人口素质的唯一有效措施。1980年起国际上开始应用限制性内切酶，Southern印迹杂交技术和放射性同位素标记的α、ξ珠蛋白基因探针进行杂交，根据显带图谱，可鉴别诊断α-地中海贫血1、α-地中海贫血2、HbH病和Bart’s水肿胎等。早期对非缺失型α-地中海贫血的基因诊断主要利用限制性内切酶酶切频段长度多态性(RFLP)连锁分析来作出的，有9个多态性位点能提供较好的多态信息。自1984年PCR技术问世后，该技术即被迅速广泛用于多种遗传病的基因诊断。1990年Lebo等应用PCR检测α-地中海贫血1，Dode和Baysal等则应用PCR检测α-地中海贫血2，引物的设计都是选在缺失基因片段两端断点的上、下游，故称gap-PCR。
我们在研究成功了3管PCR分别检测——SEA，-α3.7，-α4.2三种缺失的基础上，又将3个PCR合在一个反应管中进行，即多重PCR(mPCR)，共含7条引物。产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳分析，可为各种α-地贫作出基因诊断。但对于凝胶电泳这一步很难进行质控，检测灵敏度低，在临床实验室的推广应用中遇到困难。
实时荧光定量PCR(Real-Time PCR，F-Q-PCR)是很合适于临床实验室采用的检测外源性靶基因及人的致病基因及其突变的新技术。其中应用TaqMan技术的F-Q-PCR已开发出检测HBV，HCV，TB等体外基因扩增检测试剂盒，广泛用于临床标本的检测。具有闭管反应，防污染，特异性好，高通量等优点。但其需要双荧光标记的探针，价格较贵，反应条件优化较困难等。
发明内容
本发明的目的，在于克服上述缺陷，而提供一种α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用。
本发明的试剂盒，是利用另一类型的F-Q-PCR，即利用双链DNA(ds-DNA)特异的荧光素SYBR Green 1进行的F-Q-PCR，结合融解曲线分析(Melting Curve，MC)检测针对缺失型α-珠蛋白基因的gap-PCR产物；同时在各种缺失的共同缺失区段设计合成一对引物，其扩增产物(109bp片段)作为没有任何缺失的等位基因存在的标志(αα/，或αTα/)。这样就能为各种缺失型α-地贫作出基因诊断。检测αCSα和αQZα两种点突变单体型的F-Q-PCR的引物是根据ASA(Allele-SpecificAmplification)，即3’-碱基特异的PCR原理设计的，但在突变引物3’第2个碱基制造一个人为突变，以便提高其特异性，避免假阳性。
本发明的技术方案如下。
检测α-珠蛋白基因6种单体型αα/，-SEA/，-α3.7/，-α4.2/，αCSα/和αQZα/的F-Q-PCR可以分6管进行，也可以多重PCR方式进行。
PCR-1检测--SEA缺失，其2个引物序列是引物1，5’gta tcc tct gtc ctgacc gag aa 3’，引物2，5’aga tat atg ggt ctg gaa gtg tat c 3’，分别特异于20kb缺失片段上游断点的5’端和下游断点的3’端。从-SEA缺失等位基因可扩增出0.8kb片段，其CT值为25，Tm 83℃±1℃。
PCR-2检测-α3.7缺失，其2个引物序列是引物3，5’ctt tcc cta ccc agagcc agg 3’，引物4，5’gcc caa ggg gca aga agc atg 3’，从-α3.7/缺失等位基因可得到一条1.6kb产物，其CT值为22，Tm 88℃±1℃。
PCR-3检测-α4.2缺失，其2个引物序列是引物5，5’ttt gaa tga agt ccgagg cag 3’，引物6，5’ccc tgg gtg tcc agg agc aag cc 3’，从-α4.2/等位基因能扩增出1.5kb片段，其CT值为23，Tm 84℃±1℃。
PCR-4检测αα(包括αTα)等位基因，其2个引物序列是引物7，5’ctgcgg tgc acg cct ccc t 3’，引物8，5’gcc cat cgg gca gga gga acg gct a 3’，从αα或αTα等位基因能扩增出109bp片段，其CT值为20，Tm 81℃±1℃。
PCR-5检测αCSα等位基因，其2个引物是引物8和引物9，引物9的序列是，5’gct gac ctc caa ata ccg ac 3’，从αCSα等位基因能扩增出60bp片段，其CT值为21，Tm 78℃±1℃。
PCR-6检测αQZα等位基因，其2个引物是引物8和引物10，引物10的序列是，5’ctg ggt gca cgc ctc cac 3’，从αQZα等位基因能扩增出109bp片段，其CT值为20，Tm 81℃±1℃。
本试剂盒F-Q-PCR基本上是由引物，SYBR Genel，(NH4)2SO4，dATP，dCTP，dTTP，dGTP，deaza-dGTP，二甲基亚砜，β-巯基乙醇，小牛血清蛋白和Taq DNA聚合酶组成。
本试剂盒的优点是①检测特异性好，自动化程度高，效果准确可靠；②检测灵敏度高；③无PCR产物后处理，省时省力；④闭管操作，避免了扩增产物的污染；⑤无需荧光标记的探针，成本低廉；⑥通量高，能满足大量标本的快速检测。
图1为与PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析结果的示意图。
具体实施例方式
实施例1用本试剂盒PCR-1检测--SEA缺失型1)配置试剂优化的各试剂组份浓度如下引物 0.126μg/50μl反应体系(NH4)2SO440mmol/LdATP，dCTP，dTTP 0.2mmol/LdGTP，deaza-Dgtp 0.1mmol/LDMSO 10μl/50μl反应体系β-巯基乙醇0.06μlBSA0.6μl2)从外周血白细胞、绒毛或羊水细胞提取基因组DNA。
3)F-Q-PCR将Taq DNA聚合酶2.0U/管及10份已知-SEA阳性标本和2份已知的阴性DNA标本分别加到0.2ml的薄壁反应管腊面上，在ABI-5700或7000型F-Q-PCR仪上，循环条件为94℃，4min预变性后，采用Touch Down方式，即退火温度为65℃时进行2个循环(变性均为94℃，60sec；延伸均为72℃，60sec)，降为64℃下进行2个循环，63℃下进行30个循环，同时设定进行融解曲线分析从60℃-95℃。
4)运用仪器操作程序，调出荧光扩增曲线及MC，根据CT值及Tm值(图1，a，b)。10份已知-SEA阳性标本CT值均为25，Tm值均为83℃±1℃。与PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶电泳上分析得到的结果(图1，C)一致。
实施例2用本试剂盒PCR-1，-2，-3，-4检测缺失型α-地贫(1)配置试剂同实施例1，1；(2)DNA制备同实施例1，2；(3)F-Q-PCR每份DNA标本作4个F-Q-PCR，即PCR-1，-2，-3，-4。也可根据情况酌减。操作步骤同实施例1，3。
(4)据各PCR产物的CT值及Tm值，按照表1作出基因诊断。详见表1。
表1根据4个F-Q-PCR测得的CT值及Tm值作出基因诊断PCR-1 PCR-2PCR-3PCR-4标本号基因诊断CT Tm CT Tm CTTm CTTm1- - - - - - 2081 αα/αα or αα/αTα2- - 22 88 - - 2081 -α3.7/ααor-α3.7/αTα3- - - - 2383 2081 -α4.2/ααor-α4.2/αTα4- - 22 88 - - - - -α3.7/-α3.75- - - - 2383 - - -α4.2/-α4.26- - 22 88 2383 - - -α37/-α4.2725 83 - - - - - - --SEA/--SEA825 83 22 88 - - - - --SEA/-α3.7925 83 - - 2383 - - --SEA/-α4.210 25 83 - - - - 2081 --SEA/ααor--SEA/αTα
权利要求
1.一种α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用，其特征在于它是利用另一类型的F-Q-PCR，即利用双链DNA(ds-DNA)特异的荧光素SYBR Green 1进行的F-Q-PCR，结合融解曲线分析(Melting Curve，MC)，检测针对缺失型α-珠蛋白基因的gap-PCR产物；同时在各种缺失的共同缺失区段设计合成一对引物，其扩增产物-109bp片段作为没有任何缺失的等位基因存在的标志，即α α/，包括αTα/，为各种缺失型α-地贫作出基因诊断。
2.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用，其特征在于所述的检测αCSα和αQZα两种点突变单体型的F-Q-PCR的对引物，是根据ASA(Allele-Specific Amplification)，即3’-碱基特异的PCR原理设计，但在突变引物3’的第2个碱基制造一个人为突变，以提高其特异性，避免假阳性。
3.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用，其特征在于检测α-珠蛋白基因6种单体型α α/，--SEA/，-α3.7/，-α4.2/，αCSα/和αQZα/的F-Q-PCR可以分6管进行，也可以多重PCR方式(mPCR)进行。
4.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用，其特征在于可为αCSα和αQZα两种点突变单体型作出基因诊断。
5.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用，其特征在于钙试剂盒F-Q-PCR基本上是由引物SYBR Genel，(NH4)2SO4，dATP，dCTP，dTTP，dGTP，deaza-dGTP，二甲基亚砜，β-巯基乙醇，小牛血清蛋白和Taq DNA聚合酶组成。
6.根据权利要求1所述的α-地中海贫血基因诊断试剂盒及应用，其特征在于可应用于患者基因诊断，携带者筛查和产前基因诊断。
全文摘要
本发明公开了一种能对α－地中海贫血(α－地贫)作出基因诊断的试剂盒及其应用。该试剂盒诊断的原理是运用双链DNA特异荧光进行的实时荧光定量PCR(F－Q－PCR)结合溶解曲线分析(M.C.)技术检测α－地贫各种单体型，同时能检出没有任何缺失的等位基因(即αα/，包括α
文档编号C12Q1/68GK1570150SQ20041003775
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月12日 优先权日2004年5月12日
发明者刘敬忠 申请人:刘敬忠