专利名称：粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1的制作方法
技术领域：
本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因以及基于此基因通过生物技术方法改良小麦品质的应用。
背景技术：
小麦是世界上栽培面积最大、产量最高、地理分布最广的三大主要农作物之一，在食品加工及家畜饲料等方面用途广泛。胚乳贮藏蛋白(醇溶蛋白和谷蛋白)在面团中起“骨架”作用，并赋予面包、面条以及其他食品生产所需的粘弹性，其中高分子量谷蛋白亚基(HMW-GS)组成高分子聚合体，赋予面团弹性(Payne，1987；Shewry et al.，1992)。目前已清楚HMW-GS的编码基因位于第一部分同源群染色体长臂靠近着丝点的Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1三个位点上，每个位点有两个紧密连锁基因，分别编码一个分子量大的x-型亚基和分子量较小的y-型亚基，但由于存在基因沉默，有的位点y-型亚基或x-型亚基基因不表达，所以一个品种一般只有3-5个亚基，其中0-1种由Glu-A1编码(A1位点的Y型亚基基因总是处于“沉默”状态)、1-2种分别由Glu-B1和Glu-D1编码。不同小麦品种的HMW-GS组成是品种的遗传特性，不受环境的影响而发生变化。
虽然各位点均存在不同程度的等位基因变异，但Glu-D1位点变异较小，在面包小麦中仅检测到6个等位基因(Payne and Lawrence，1983)，因此普通小麦中D基因组的HMW谷蛋白基因资源十分有限。粗山羊草(Aegilops squarrosa或Triticum tauschii，又叫节节麦，DD，2n＝2x＝14)是普通小麦D基因组的祖先，一直被认为是普通小麦面包特性的主要贡献者。粗山羊草具有丰富的抗病虫和抗逆等基因，受到国内外的广泛重视，并正在育种计划中加以转移利用。近年来的研究表明，粗山羊草中的高分子量谷蛋白亚基变异十分丰富，而且其蛋白质亚基的组成和结构与面包小麦亦有很大差异(Lagudah and Hallroan，1988；Gianibelliet al.，2001；Yan et al.，2003)。因此，粗山羊草广泛的HMW谷蛋白基因变异为面包小麦品质改良提供了丰富的基因资源。最近的研究显示，来自粗山羊草的5t+10t亚基与面包小麦的5+10作用相似，对面包品质具有重要影响。通过粗山羊草与普通面包小麦杂交获得的稳定品系，其碾磨与烘烤品质与六倍体亲本相比都有很大提高(Tilley et al.，2000)。转移利用粗山羊草的高分子量谷蛋白基因已成为改良普通小麦品质的一条重要途径。
由于小麦高分子量谷蛋白亚基对品质具有重要作用，国内外都试图克隆优质HMW-GS基因，然后通过基因工程定向改良小麦品质。这已成为近10多年来的研究热点。迄今为止，在普通小麦中已有10余个基因被克隆和测序(Anderson et al.，1989；Forde et al.，1885；Sugiyama et al.，1985；Thompson et al.，1985；Halford et al.，1987；Reddy andAppels，1993)，并在转基因优质品种的培育方面取得重要进展。但在粗山羊草仅有少数HMW谷蛋白基因被克隆(Mackieet al.，1996；Gianibelli and Solomon，2003)。从粗山羊草中克隆新的基因对小麦品质的改良具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的在于从粗山羊草中克隆得到一个编码高分子量谷蛋白亚基HMW-GS12.1t的基因1Dy12.1t，通过常用基因工程技术，可培育优质转基因小麦，从而改善小麦品质。
本发明采用的技术方案是一种粗山羊草高分子量谷蛋白的1Dy12.1t基因，其特征在该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第858位到2807位所示的核苷酸序列。
上述的粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因具有的核苷酸序列还可以是序列表中SEQ ID NO.1第858位到2807位中因一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。
目前分离谷蛋白基因主要采用建库筛选和PCR方法，本发明通过等位基因特异PCR技术，结合单、双向凝胶电泳和毛细管电泳方法，在粗山羊草中分离了一个新的HMW-GS12.1t亚基及其基因1Dy12.1t，该基因序列结构与优质基因1Dy10具有高度同源性，可以在小麦品质改良中发挥重要作用。
基因结构特征粗山羊草高分子量谷蛋白亚基的单、双向凝胶电泳和毛细管电泳鉴定图谱如图1、图2所示，粗山羊草TD-159只有一个y-型亚基即HMW-GS12.1t，x-型亚基沉默，这在六倍体种中非常罕见。为了克隆编码HMW-GS12.1t的基因即1Dy12.1t基因，根据蛋白质N-端保守序列和已发表的基因序列设计AS-PCR引物，引物结构如图3所示，其中引物P1+P2用于扩增1Dy12.1t基因的编码区，引物P3+P4用于扩增1Dy12.1t基因上游启动子序列，分别获得了1947bp和1200bp单一扩增产物，它们正好相对于y-型HMW谷蛋白1Dy12.1t基因的编码区和上游启动子大小，而且从叶片和种子DNA获得的结果一致，说明所设计的引物特异性高。
两单一片段经克隆测序与连接后获得了1Dy12.1t基因共2807bp如序列表SEQ ID NO.1所示的编码全序列。该基因包括一个无内含子的1950bp可读框(编码648个氨基酸残基)和857bp的上游序列。1Dy12.1t基因上游区包括一些典型的真核基因序列，如一个TATA盒，一个CCACC序列，分别存在于启始密码ATG上游第85-91bp和4-8bp的位置。另外，还有三个与其它植物基因相似的类CCAAT序列CCAAT(74-78bp)，CCAT(116-120bp)和CAAAT(190-195bp)。在启始密码ATG上游第209-246bp，有一个完全保守的38bp增强子序列5’-GTTTTGCAAAGCTCCAATTG CTCCTTGCTTATCCAGCT，该序列由Thomas和Flavell在1990年鉴定，是基因表达的主要调节因子。从-447 to-424bp还存在一个24bp序列，叫做-300因子，它在其它贮藏蛋白基因中是保守的。
由DNA序列推导出的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示，该氨基酸序列显示，1Dy12.1t亚基与其它y-型HMW谷蛋白亚基相似，前面是21个信号肽残基，然后与其它HMW谷蛋白亚基一样，有三个明显的结构区域104个残基的非重复N-端区、481个残基的中央重复区和42个残基的非重复C-端区。1Dy12.1t亚基有7个半胱氨酸残基N-端5个、C-端1个、重复区末端靠近C-端1个。重复区由六肽(PGQGQQ)和九肽(GYYPTSLQQ)组成的典型y-型HMW谷蛋白结构(无三肽重复)。
1Dy12.1t亚基基因与优质亚基基因1Dy10同源性较高，而与劣质亚基1Dy12基因存在很大差异。与1Dy10亚基相比，整个编码区只有7个氨基酸的差异，即第41(lysine/glutamic acid)，第81(isoleucine/valine)，第285(glutamine/arginine)，第462(tyrosine/serine)，第499(proline/serine)，第503(glutamine/proline)和第630(leucine/valine)七个氨基酸的替换。因此，1Dy12.1t基因很可能对小麦品质改良有重要作用。
HMW-GS对面包烘烤品质所起的重要作用已被众多的研究者所证实(Wrigley，1996)。具有1Dx5+1Dy10亚基(由1D染色体上Glu-D1位点上的基因编码)的品种面包烘烤品质明显优于其它亚基组合。研究发现以1或2*亚基代替N，以7+8亚基代替7+9亚基，以5+10亚基代替2+12亚基将显著改善小麦的烘烤品质。一般认为具有1Dx5+1Dy10亚基组合(品质评分为4)的品种具较好的烘烤品质，其次是1Ax1、1Ax2、1Bx17+1By18以及1Bx7+1By8(品质评分均为3)，而具有亚基组合2+12的品种烘烤品质较差(Gianibelli et al。2001)。经调查，我国推广品种中5+10、17+18等优质亚基组合的频率很低，这可能是造成我国小麦品质普遍较差的重要原因之一。因此，改善麦谷蛋白的高分子量亚基构成，将是改良我国小麦品种烘烤品质的重要途径。研究显示，通过优质谷蛋白基因(包括从粗山羊草获得的优质谷蛋白基因)的转化，培育转基因小麦可显著改善面粉品质。
图1粗山羊草TD-159高分子量谷蛋白亚基单、双向凝胶电泳鉴定图谱A-SDS-PAGEB-A-PAGEC-A-PAGE x SDS-PAGE图2粗山羊草TD-159高分子量谷蛋白亚基毛细管电泳鉴定图谱；图3AS-PCR引物P1+P2和P3+P4扩增区域示意图。
具体实施例方式
实施例1粗山羊草TD-159高分子量谷蛋白HMW-GS12.1t亚基的鉴定(1)植物材料粗山羊草TD-159；(2)HMW-GS提取①SDS-PAGE电泳样品制备半粒种子扎碎后将面粉放入1ml离心管，然后加入0.3ml 55％异丙醇，涡旋1分钟，65℃水浴振荡30分钟，10000rpm离心10分钟，弃上清。上述处理面粉的操作重复3次，用滤纸吸去残余上清，将醇溶蛋白去除干净；加0.1ml 55％异丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1％二硫苏糖醇(DTT，新鲜加入)，充分混合，65℃水浴充分振荡30分钟；加0.1ml 55％异丙醇，0.08M Tris-HCL，pH8.0，含1.4％新鲜混合的4-乙烯基吡啶，混合并在65℃水浴中振荡30分钟，12000rpm离心10分钟；将0.06ml上清转入新管，加0.06ml样品缓冲液(2％SDS，0.02％溴酚蓝，0.08M Tris-HCl，pH8.0，40％甘油)，65℃水浴中振荡30分钟，12000rpm离心10分钟，作SDS-PAGE上样用。
②A-PAGE电泳样品制备余下上清液转入新管，加0.3ml冷丙酮将谷蛋白沉淀15分钟，12000rpm离心10分钟，弃上清。室温干燥谷蛋白后用50μl样品缓冲液(6M尿素，30％甘油和25mM乙酸)，充分混合，12000rpm离心10分钟，取8-10ul作A-PAGE上样用。
③毛细管电泳样品制备如上所述，去掉醇溶蛋白往离心管沉淀中加入50％正丙醇含新鲜加入的1％DTT 800μl，45℃震荡提取30分钟，12000rpm离心10分钟，取上清液600ul转入干净1.5ml离心管中，加入预冷分析纯丙酮至终浓度40％，室温静置沉淀30分钟，12000rpm离心15分钟，所得沉淀即为HMW-GS。室温干燥后加入300μl 20％乙氰和0.1％三氟乙酸(TFA)，充分溶解、离心后即可进行CE分析。
(3)用四种方法分别对HMW谷蛋白亚基进行鉴定①SDS-PAGE电泳利用Boi-Rad Mini-PROTEAN 3电泳槽、4％浓缩胶、12％分离胶，磷酸-甘氨酸缓冲液系统，10mA电泳2小时，0.1％考马斯亮蓝R-250染色，25％甲醇和乙酸7％脱色，电泳图谱如图1中的A图所示。
②A-PAGE电泳电泳槽同上，利用5％浓缩胶和10％分离胶，0.375％双丙烯酰胺，2M尿素，0.1％抗坏血酸，0.0007％硫酸亚铁，冰醋酸-甘氨酸缓冲液系统pH3.1，恒压500V，电泳1～2小时。1％考马斯亮蓝R-250染色，电泳图谱如图1中的B图所示。
③双向A-PAGE×SDS-PAGE电泳A-PAGE后，染色1小时，按泳道将胶条切下，做方向标记，在20-50ml孵育液(2％SDS，40％甘油，62.5mM Tris-HCl，pH6.8)中孵育30分钟，然后放在SDS-PAGE胶上(方法同①，在分离胶上端留1cm空)，先15毫安电泳，待样品进入分离胶后加大至30毫安(电压80-100伏)，电泳2.5小时。1％考马斯亮蓝R-250染色24小时，电泳图谱如图1中的C图所示。
④高效毛细管电泳(HPCE)采用Bio-Rad公司生产的BioFocus 3000型高效毛细管电泳仪系统。弹性石英毛细管柱由河北省永年光导纤维厂生产，内径为50μm、长度为25.5cm(检测长度20cm)，外层涂有聚酰亚胺保护层，内壁均未涂层。电泳缓冲液为100mm磷酸-甘氨酸缓冲液(pH2.50，含20％乙氰和0.05％羟脯氨酰甲基纤维素HPMC)。毛细管柱冲洗方法新毛细管预处理为H2O 5min；1M NaOH 5min；H2O 5min；1M H3PO45min；Buffer30min。样品间冲洗程序1M H3PO44min；H2O 2min；Buffer 3min。电泳参数运行电压12.5kV，毛细管温度35℃，样品槽温度15℃，进样8kV，5sec，电极由+向-，电泳图谱如图2所示。
实施例2粗山羊草TD-159高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因的鉴定
(1)亚基转膜与N-端测序将双向电泳凝胶上的蛋白点切下，回收纯化后利用毛细管电泳检测纯度，然后通过Bio-Rad MiniTrans-Blot电转印到PVDF膜上，进行蛋白质N-端测序。
(2)AS-PCR引物设计根据所得到的HMW谷蛋白N-端序列和已发表的相关基因保守序列设计AS-PCR引物，用以扩增y-型HMW亚基基因的编码区和上游序列。引物结构如图3所示，引物序列如下①编码区PCR引物P15″-ggCTAgCCgACAATgCgTCg-3″P25″-CTATCACTggCTAgCCgACAATg-3″②上游PCR引物P35″-gAACATAAgAggTTAAACATAggAggAg-3″P45″-ACCACAgTTTgCTCATATTgTCTTg-3″(3)叶片与种子基因组DNA提取选取硬粒小麦品种Simeto饱满种子，用7％次氯酸钠消毒10分钟，25℃条件下浸种催芽过夜，黑暗25℃培养7～8天。用0.1克黄化苗按CTAB法提取总DNA。
取20mg砸碎的种子提取gDNA，于1.5ml eppendorf离心管内，加入100μl提取缓冲液(200mM Tris-Hcl，pH7.5，288mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)浸解。再加入700μl提取缓冲液，涡旋20sec后，12000rpm离心5min。取上清，加入700μl氯仿∶异戊醇(24∶1)，12000rpm离心10min。保留上清，加入700μl异丙醇，沉淀2min，12000rpm离心15min，弃上清，干燥后向沉淀中加入40μl TE缓冲液(10mM Tris-HCl，pH8.0，1mM EDTA，pH8.0)，溶解24小时后，电泳检测DNA浓度，-20℃保存。
(4)HMW-GS编码基因的PCR扩增引物由上海Sangong公司合成；PCR用酶购自TaKaLa宝生物工程公司；PCR回收Kit购自上海Sangong公司；T-Vector连接Kit为Promega产品。
PCR反应体系
①编码区PCR体系和程序A.50ul体系La Taq酶 2.5U2×GC Buffer II(MgCl2+Plus) 25μldNTP 0.4mM每条引物 0.5μM模板DNA100ng灭菌蒸馏水 50μlB.反应程序94℃变性2分钟；94℃变性45秒，63℃退火1分钟，72℃延伸2分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖胶检测PCR产物。
②上游PCR体系和程序A.50ul体系Taq酶 2.5U10×PCR Buffer(MgCl2+Plus)5μldNTP 0.4mM每条引物 0.5μM模板DNA100ng灭菌蒸馏水 50μlB.反应程序94℃变性2分钟；94℃变性45秒，64℃退火1分钟，72℃延伸1.5分钟，共35个循环；最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶检测PCR产物。
Southern杂交利用HMW-GS基因克隆制备探针进行Southern杂交，鉴定PCR产物。
PCR产物的回收①将所需的电泳凝胶切下放于1.5ml离心管中，加入700μl Binding Buffer，并于50℃-60℃水浴使琼脂糖凝胶充分溶解；②将UNIQ-10柱放入2ml收集管中，将凝胶溶解物转移到UMQ-10柱中，室温放置2分钟后以8000rpm离心1分钟；③取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500ul Binding Buffer，8000rpm离心1分钟；④取下UNIQ-10柱，去掉管中液体，加入500ul Wash Buffer，8000rpm离心1分钟；重复一次；⑤取下UNIQ-10柱，去掉管中液体，将UNIQ-10柱放入同一收集管中，让离心管盖开着，室温12000rpm离心1分钟；⑥将UNIQ-10柱放入一新1.5ml离心管中，在柱子膜中央加30μl水到UNIQ-10柱中，室温或37℃放置2分钟；⑦室温12000rpm离心1分钟后即得到回收产物，可立即使用或-20℃保存。
(5)HMW-GS编码基因的PCR克隆和鉴定①连接反应体系2*rapid ligation buffer 5μlpGEM-T Vector 0.5μlT4 DNALigase1μlPCR回收产物 3.5μl共10ul体积，4℃连接过夜。
②连接产物转化大肠杆菌DH-5α感受态细胞A.大肠杆菌感受态细胞DH-5α的制备划板复壮宿主菌后，挑一单菌落于20ml的LB(Tryptone 10g/L；Yeast extract 5g/L；NaCl 5g/L；pH7.0)液体培养基中，37℃摇至OD600＝0.3-0.4，取出置于冰上20分钟。将菌液移至一灭菌的50ml离心管中，4℃4000rpm离心10分钟，回收细胞。将细胞沉淀以10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬，并置于冰上30分钟。4℃4000rpm离心10分钟，弃上清，用4ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2重悬菌体，加入灭菌甘油至终浓度30％，分装后存于-70℃。
B.重组质粒向宿主菌的转化取100ul DH-5α感受态细胞0.5ml的离心管中，加入10ul的连接产物并轻旋以混匀内含物，置于冰上30分钟。42℃热激90秒，置于冰上1-2分钟。加入400ul 37℃预热的LB培养基，37℃ 150rpm，摇培45分钟。取150ul菌液铺于涂有IPTG和X-Gal的LB平板上(Amp80ul/ml)，37℃倒置培养12-16小时。
③质粒的提取A.挑取单菌落于10ml LB(Amp 80ul/ml)液体培养基，37℃培养过夜。将菌液移至1.5ml的离心管中，12000rpm离心2分钟，弃上清，收集菌体；B.加入100ul冰预冷的溶液I(50mM葡萄糖、25mM Tris-HCl pH8.0、10mMEDTApH8.0)，充分悬浮菌液，室温放置5分钟；
C.加入新鲜配制的200ul的溶液II(0.2MnaOH、1％SDS)，轻摇菌液，冰上放置5分钟；D.加入150ul冰预冷的溶液III(60ml 5M乙酸钾、11.5ml冰乙酸、28.5ml双蒸水)清摇菌液，冰上放置5分钟，12000rpm离心10分钟，移上清至一新离心管；E.加入等体积的酚/氯仿(1∶1)抽提一次，12000rpm离心5分钟，移上清至一新离心管；F.加入2倍体积的无水乙醇，振荡，室温放置5分钟，12000rpm离心10分钟；G.用75％乙醇洗涤沉淀两次，每次12000rpm离心5分钟；H.吹干，溶于灭菌双蒸水或TE缓冲液(含0.02mg/mlRNase)，做电泳检测。
④重组质粒PCR法鉴定与序列测定A.按前述PCR反应体系和程序进行重组质粒鉴定；B.经鉴定的质粒进行DNA序列测定，由TaKaRa Biotech公司完成，得到了1Dy12.1t基因共2807bp，如序列表中SEQ ID NO.1所示的编码全序列，该核苷酸序列包括一个无内含子的1950bp可读框(编码648个氨基酸残基)和857bp的上游序列。
实施例3粗山羊草TD-159高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因的表达与鉴定(1)PCR产物的纯化回收以粗山羊草T151的基因组DNA为模板，扩增1Dy12.1t基因的PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳(稳压50v)1小时，在紫外灯下将DNA条带切下，用DNA凝胶纯化试剂盒(Agarose Gel DNA Purification Kit，Takara)将特异扩增条带纯化回收。
(2)PCR产物和表达载体PET-30a(Novagen)的双酶切将回收的PCR产物和PET-30a质粒都用EcoR I(TaKaRa)及Xho I(TaKaRa)进行双酶切，酶切2小时后将酶切产物用Agarose Gel DNA Purification Kit(TaKaRa)回收。
(3)连接与鉴定将待插入片段的双酶切产物和PET-30a质粒的双酶切产物按质量比3∶1的比例混合，加入T4 DNA连接酶(Promega)，16℃连接，反应过夜。
取连接产物加入大肠杆菌DH-5α感受态中进行转化，并进行蓝白筛选和卡那霉素(Kan)抗性筛选，挑白色单菌落于含Kan(10ug/ml)的LB培养基中在37℃下培养过夜，碱裂解法小量制备质粒，对质粒进行酶切鉴定(EcoR I和Xho I)，以确定插入片段已连接到表达载体上。
(4)转化及蛋白质表达取已制备的含插入片段的PET-30a质粒加入大肠杆菌BL-21(DE3)感受态中转化，挑取白色单菌落于含Kan(10ug/ml)的LB培养基中培养过夜获得饱和培养物，取饱和培养物100ul加入10ml含Kan(10ug/ml)LB培养基中37℃培养2小时，向其中加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)使其在菌液中终浓度为1mmol/L，对培养物进行诱导，继续培养三小时。
(5)表达蛋白提取与鉴定表达培养结束后，取菌液提取蛋白进行SDS-PAGE(方法同实施例1中所述)鉴定或者免疫印迹杂交鉴定(Immunobloting)，可以确定1Dy12.1t基因编码的蛋白已经表达。
实施例4粗山羊草TD-159高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因的应用通过基因表达和免疫印迹杂交鉴定，证实1Dy12.1t基因可在E.coli高效表达，并具有功能活性。利用基因工程技术对高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因加以转移利用，如通过基因枪、花粉管通道、农杆菌转化等方法转化该基因，进而培育品质优良的转基因小麦。
序列表<210>1<211>2807<212>DNA<213>Triticum tauschii
<220>
<221>CDS<222>(858)..(2807)<223>
<400>11 GAACATAAGA GGTTAAACAT AGGAGGAGGA TATAATGGAC AATTAAATCC5051 ACATTACTTG AACCCATTTG GGAAGTGGAA AAAATCCCCT ATTCTGGTGT100101 AAATCAAACT AATTGACGCG AGTTTTCTCT GAAGATTCTA TGTTAATTTT150151 AGACATGAAT GACCAAAGGT TTCAGTTAGT TGAGTTTTGT CATCGAAAGG200201 TGTTTACATA AGTCCAAAAA TTCTACCAGC TTTTGGTACG GCGCGTCACA250251 GAACAGATAA ATGGTGTGAG TCATTGGATA GATATTATGA GTCATAGCAT300301 GGATTTGTGT TGCCTGGAAA TCTAACTATG ACAAGAAACA AAACATAAAT350351 GGGCTTTTGA AAGATGATTT ATCAACTTAC CTTATCCATG CAAGCTACCT400401 TCCACTAGTC GACATGCTTA GAAGCTTTTA GTGACCGCAG ATTTGCAAAA450451 GCAATGGCTA ACAGACACCC AAACCCCAAG AAGCATAACC ACTTCTCTTA500501 GATAAAAATA GCAGATCGAT ATACAAACGT CTACACTTCT GCAAACAATA550551 CCCAGAAGCC AGAATTAGGA TTGAACCGAT TACGTGGCTT TAGCAGACCG600601 TCCAAAAATC TGTTTTGCAA AGCTCCAATT GCTCCTTGCT TATCCAGCTT650651 CTTTTGTGTT GGCAAATTGT TCTTTTCCAA CCGACTTTAT TCTTTTCACA700701 TTTCTTCTTA GGCTGAACTA ACCTCGCCGT GCACACAACC ATTGTCCTGA750751 ACCTTCACCA CGTCCCTATA AAAGCCCGAC CAATCTCCAC AATTTCGTCA800801 TCACCCACAA CACCGAGCAC CACAAAATAG AGATCGATTC ACTGACAGTC850851 CACCGAGATG GCTAAGCGGT TGGTCCTCTT TGCGGCAGTA GTCATCGCCC900901 TCGTGGCTCT CACCACTGCT GAAGGTGAGG CCTCTAGGCA ACTACAGTGT950951 GAGCGCGAGC TCCAGGAGAG CTCGCTCAAG GCATGCCGGC AGGTTGTGGA10001001CCAACAGTTG GCCGGTCGGC TGCCATGGAG CACGGGGCTC CAGATGCGAT10501051GCTGCCAGCA GCTCCGAGAT GTTAGCGCCA AGTGCCGCTC CGTCGCCATC11001101AGCCAAGTCG CAAGACAATA TGAGCAAACT GTGGTGCCGC CCAAGGGCGG11501151ATCCTTCTAC CCTGGTGAGA CCACGCCACT GCAGCAACTC CAACAAGGAA12001201TATTTTGGGG AACATCTTCA CAAACAGTAC AAGGGTATTA CCCAGGCGTA12501251ACTTCTCCTC GGCAGGGGTC ATATTATCCA GGCCAAGCTT CTCCACAACA13001301GCCAGGACAA GGGCAACAGC CTGGCAAATG GCAAGAACCA GGACAAGGGC13501351AACAATGGTA CTACCCAACT TCTTTGCAGC AGCCAGGACA AGGGCAACAG14001401ATAGGAAAAG GGCAACAAGG GTACTACCCA ACTTCTCTGC AGCAGCCAGG14501451ACAAGGGCAA CAAGGGTACT ACCCAACTTC TCTGCAGCAC ACAGGACAAA15001501GGCAACAACC AGTACAAGGG CAACAACCAG AACAAGGGCA ACAACCAGGA15501551CAATGGCAAC AAGGGTACTA TCCAACTTCT CCACAACAGC TAGGACAAGG16001601GCAACAACCA GGACAATGGC AACAATCAGG ACAAGGGCAA CAAGGGCACT16501651ACCCAACTTC TCTACAACAG CCAGGACAAG GGCAACAAGG GCATTACCTA17001701GCTTCTCAGC AGCAGCCAGG ACAAGGGCAA CAAGGGCACT ACCCAGCTTC17501751TCAGCAGCAG CCAGGACAAG GGCAACAAGG GCACTACCCA GCTTCTCAGC18001801AGCAGCCAGG ACAAGGGCAA CAAGGGCACT ACCCAGCTTC TCAGCAAGAG18501851CCAGGACAAG GGCAGCAAGG GCAAATCCCA GCTTCTCAGC AGCAGCCAGG19001901ACAAGGGCAA CAAGGGCACT ACCCAGCTTC TCTGCAGCAA CCAGGACAAG19501951GGCAACAAGG GCATTACCCA ACTTCTCTAC AGCAGCTAGG ACAAGGGCAA20002001CAAACAGGAC AGCCAGGACA AAAGCAACAA CCAGGACAAG GGCAACAAAC20502051AGGACAAGGG CAACAGCCAG AACAAGAGCA ACAACCAGGA CAAGGGCAAC2100
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权利要求
1.一种粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因，其特征在该基因具有序列表中SEQ ID NO.1第858位到2807位所示的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因，其特征在于所述基因具有的核苷酸序列还可以是序列表中SEQ ID NO.1第858位到2807位中因一个或多个核苷酸的缺失、插入或替换而形成的具有功能活性的等位基因。
3.一种含有权利要求1或2所述的粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因的质粒。
4.一种含有权利要求1或2所述的粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因的植物表达载体。
5.权利要求1或2所述的粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.1t基因在培育转基因小麦方面的应用。
全文摘要
本发明属于生物基因工程技术领域，特别涉及一种粗山羊草高分子量谷蛋白1Dy12.文档编号C12N15/82GK1570112SQ20041003761
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月27日 优先权日2004年4月27日
发明者晏月明, 郑继刚, 胡英考, 姜怡, 肖英华, 余建中 申请人:首都师范大学