专利名称：耳聋相关基因突变的检测方法
技术领域：
本发明涉及耳聋相关基因突变的检测方法。更具体地说，本发明涉及检测与人类遗传性耳聋相关的GJB3基因250G→A突变的方法。
背景技术：
连接蛋白是形成缝隙连接的蛋白单位，在脊椎动物细胞之间的通讯中起着关键作用，最近几年，研究表明连接蛋白与人类疾病关系密切，连接蛋白基因突变影响许多组织系统，并且同一基因突变与不同的疾病有关系，伴有β-连接蛋白突变的患者可以引起听觉系统，外周神经和皮肤的病变。
缝隙连接位于细胞之间接触的区域，在不同的组织中广泛分布。离子和其他小分子(＜1kDa)，比如第二信使可以直接通过缝隙连接，在两个细胞的细胞质之间进行交流，所以缝隙连接在细胞间通讯中非常重要。它们包括从几十到上千个跨膜半通道，也称连接小体，这些连接小体与相邻细胞同样的连接小体结合形成亲水性通道，使得细胞相互接触。连接小体由六个跨膜蛋白(即连接蛋白)形成。有20种不同类型的连接蛋白，根据不同的分子量和同源性，可以分成α、β、γ和未分类的。大多数连接蛋白基因成群存在，就像在13号染色体长臂上GJB2、GJB6和GJA3所形成的那样，α和β-连接蛋白基因组结构非常相似，有两个外显子，第一个是非编码区，第二个外显子包含整个编码区。连接蛋白的亚单位可以形成相同或不同的连接小体。因此连接小体可以由相同的连接蛋白形成，也可以由不同的连接蛋白亚单位形成。另外，连接细胞的两个连接小体可以是相同的(同类型通道)，也可以是不同的(杂合类型通道)。
连接蛋白有四个跨膜区，连接蛋白的羧基和氨基端与第二、第三跨膜区之间的环均位于细胞质内。最近电子晶体学研究发现，连接小体中六个连接蛋白的四个跨膜段形成两个同心环。内环形成孔，外环面对细胞膜的脂质层。第三跨膜区和两个细胞外区形成孔壁，前者使通道具有水通透性，后者参与两个细胞连接小体的相互作用。连接蛋白不同区域之间的相互作用对于缝隙连接通道的通透性是至关重要的。连接蛋白序列的主要可变性位于细胞质内区域，参与通道活性的调节。
缝隙连接表现出对分子大小和电荷的选择性，对于形成连接小体的连接蛋白亚单位来说具有特异性。缝隙连接通道的开口可以通过几种因素来调节，一些连接蛋白通过磷酸化，电压、酸化或几种其它因素来调节。缝隙连接通透性的调节有三种不同的形式(快速、中等和长期)，长期调节因素似乎最易受到突变的影响。
内耳中的缝隙连接位于Corti’s器的支持细胞之间，在耳蜗侧壁的细胞中也有发现。已经在所有内耳细胞中检测到有Cx26表达。内耳中的缝隙连接被分成两个系统上皮细胞缝隙连接系统和结缔组织缝隙连接系统。两种系统对维持内淋巴中K+离子高浓度有重要作用，这对于维持听觉系统的正常功能至关重要。Corti’s器毛细胞受到声音刺激后，K+离子流入毛细胞中，然后通过缝隙连接返回到内淋巴中，维持内淋巴电位。
对于连接蛋白基因的不同突变是如何引起耳聋的，现在仍然不很清楚。尽管对于隐性遗传的病例，大多数突变导致缺少一定的连接蛋白，有些突变改变了在特定位置的氨基酸，可能会出现显性失活效应。连接蛋白突变会影响耳蜗和Corti’s器缝隙连接的正常模式，可能会导致在缝隙连接中出现不同类型的连接小体(由于Cx30可能仍将存在而形成同类型缝隙连接)，而耳蜗中异常的缝隙连接模式(可能是由于缺少某一种类型的连接蛋白或者存在异常的连接蛋白)会影响K+离子循环途径，这将会影响内淋巴电位，最终导致毛细胞失去功能。GJB3(Cx30)在耳蜗螺旋缘和螺旋韧带中表达，并且在听神经中也有表达，所以除了耳蜗的功能障碍，还可能会影响声音信息的神经传导。
GJB3结构与功能在结构上与其它连接蛋白相似，GJB3基因是连接蛋白家族中的一个成员，编码缝隙连接的CX31成分，六个连接蛋白分子组装成半通道或连接小体，与相邻细胞的对应部分组成一个完整的细胞内通道。连接蛋白家族具有高度的序列保守性，有四个跨膜域并由一个细胞质内环和两个细胞外环连接在一起。在已知的突变中可以引起耳聋和皮肤疾病，但与GJB2相比，所报道的GJB3的突变较少，GJB3基因突变不仅可以引起显性或隐性形式遗传的感音神经性耳聋，而且还与皮肤疾病以及外周神经病有关。
1998年，我国夏家辉教授最早报道了两个引起显性遗传形式高频听力下降的GJB3突变，他们应用同源EST搜索和巢式PCR的方法克隆出GJB3基因，并将GJB3基因定位在1p33-p35，在42个遗传性疾病的家系中进行筛查，在一个浙江的耳聋家系中发现了一个错义突变，位于GJB3基因编码区的第547个碱基由G突变成A，使得连接蛋白Cx31的第183号氨基酸由谷氨酸变成赖氨酸，同时他们还在一个湖南家系中发现了一个无义突变，GJB3的第538个碱基由C变成T，导致在第180号氨基酸位置编码终止，他们还应用RT-PCR的方法发现在小鼠内耳组织中有gjb3表达，这进一步验证了GJB3与感音神经聋有关。2000年，Liu等报道了两个引起隐性遗传耳聋的GJB3突变，他们筛选了25个患有隐性遗传耳聋的中国四川家系，在其中两个家系中发现了两个GJB3突变，一个是在423-425三个碱基缺失(423-425delATT)，导致第141编码氨基酸-异亮氨酸缺失；另一个是第423个碱基由A变成G，使得141号氨基酸由异亮氨酸变成缬氨酸。141位的异亮氨酸位于连接蛋白的第三个保守跨膜区，对于缝隙连接孔壁的形成是非常关键的。2001年，Lopez-Bigas在一个患有外周神经病和感音神经性聋的家系中发现了一个突变，在196-198有三个碱基缺失(GACdel)，导致在66位天冬氨酸缺失。他们还在小鼠耳蜗和听神经中发现有gjb3表达。
连接蛋白基因突变的发现开辟了一个令人惊奇的新领域，为耳聋患者打开一扇新的诊断、治疗的大门。与缝隙连接蛋白的多功能特性一致，同一种连接蛋白的不同突变可以引起不同组织的疾病。另外，不同连接蛋白的突变可以引起同样的或相似的疾病。虽然大多数语前聋都是由于缺少某种特定的连接蛋白(Cx26和Cx30)所致，但成年发病的耳聋则主要是由于在几种具有显性阴性效应的连接蛋白错义突变的结果。几种引起常染色体显性遗传性耳聋的突变明显是影响到氨基酸残基，这些氨基酸残基对于连接蛋白正确的组装或门控极性(gating polarity)都至关重要，对于野生型连接蛋白通道的功能有优势抑制作用。其中有一些氨基酸改变在它们所引起的疾病表型上表现出很大的变异性，这可能是由于与其它连接蛋白或其它因素相互作用的结果，这些其它的连接蛋白或因素具有补偿有害作用的效果。小鼠模型的发展和在人类发现的突变发生的研究，将可以更好的理解这些疾病的病理生理。现在对于连接蛋白基因突变所引起的疾病分子基础的理解将被用作对耳聋病人及其家庭成员的诊断工具。未来的研究将集中在治疗的发展，能够预见，将对几年以前还没有能够解决的一些慢性疾病制定出预防和治疗措施。
目前，通过国内外同行的研究仅发现了5个GJB3基因突变位点，通过发现新的突变位点有利于进一步认识GJB3基因对于正常听觉生理功能意义，更加深入的了解其与耳聋的关系。在以前所发现的5个突变位点中，其中4个突变位点是在中国人群中发现的，而我们此次又再次在中国人群中发现GJB3基因新的突变位点，这提示可能在中国人群GJB3突变发病率较其他人群高，并且有可能存在着突变热点，这将有利于将来在临床上开展聋病患者的GJB3突变筛查工作，为耳聋患者诊断和治疗提供服务。
发明内容
发明人选取GJB3基因作为研究对象，通过在89名各种感音神经性耳聋患者和103名正常听力对照组进行筛查，发现一个与耳聋有关的GJB3基因新的突变位点(250G→A，V84I)。这一突变位点在103名对照组中均没有发现，说明这一突变位点与耳聋有关，而且这一突变位点位于Cx31的第二跨膜域(如图3所示)。连接蛋白家族中其它成员Cx26和Cx32在同样位置的突变均有与疾病有关的报道，说明这一位点对于Cx31是非常重要的。基于该发现，完成了本发明。
因此，根据本发明，提供了1、一种耳聋相关基因的检测方法，该方法包括检测GJB3基因第250个碱基的改变或由该碱基改变引起的表达产物的改变。
2、根据以上第1项的检测方法，其中所述第250个碱基的改变为G突变为A。
3、根据以上第1项的检测方法，其中所述表达产物为连接蛋白Cx31。
4、根据以上第1项的检测方法，其中所述表达产物的改变为该GJB3基因编码的蛋白的第84位氨基酸由缬氨酸改变为异亮氨酸。
5、根据以上第1项的检测方法，其中该方法通过PCR扩增-直接测序法来进行。
6、根据以上第5项的检测方法，其特征在于包括如下步骤A对于GJB3基因的编码区设计引物，进行PCR扩增，或者对于GJB3基因第250个碱基附近设计引物，进行PCR扩增；BPCR反应后直接测序，将所得到的序列与Genbank中的序列比较确定GJB3突变位点。
7、根据以上第6项的检测方法，其特征在于进一步包括如下步骤C按正常阅读框进行翻译以确定GJB3基因突变位点。
8、根据以上第1项的检测方法，其中通过GJB3基因的探针与从体外样品分离的DNA杂交来检测所述碱基的改变。
9、根据以上第1项的检测方法，其中通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。
10、一种检测GJB3基因250G→A突变位点的试剂盒，其包括扩增用引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。
11、根据以上第1项的检测方法在耳聋的诊断或治疗中的应用。
正常的GJB3基因的碱基序列如序列表中序列1所示，其编码的Cx31蛋白的氨基酸序列如序列2所示，突变的GJB3基因的碱基序列如序列表中序列3所示，其氨基酸序列如序列4所示。如序列表中所示，250G→A的突变导致了密码子由GTC变为ATC，其编码的第84位的缬氨酸变为异亮氨酸。
图1给出了GJB3编码区氨基酸与核酸碱基的对照图，并示出了突变位点。检测该突变可用本领域的任何检测点突变的方法来进行，例如PCR-测序法，用标记的DNA探针，或用限制性片段长度多态性方法。因此，在本文实施例中所用的测序法只是示例性的，不是限制性的。
PCR(聚合酶链反应)是公知的方法。在发明人进行的实验中，收集耳聋遗传资源，建立遗传性耳聋资源库。通过聋病门诊收集各种感音神经性耳聋患者，在患者自愿的前提下，签署知情同意书后，留取5-10ml血样，并建立门诊病历资料库，详细记录患者病情、家系中的发病情况以及联系方式。然后，应用酚氯仿抽提的方法提取基因组DNA，定量后入库，-20℃保存，每份DNA样品均详细对应于登记的患者临床资料。然后，应用在线引物设计软件Primer3设计引物，包含GJB3整个编码区，应用PCR扩增。PCR产物直接测序测序引物与PCR扩增引物相同，正反向测序，应用ABI公司3730DNA测序仪(测序图谱如图2所示)。得到的序列与Genebank中的序列比较确定GJB3突变位点。按正常阅读框进行翻译以确定Cx31的突变位点。
本发明还提供一种检测耳聋相关基因GJB3-250G→A突变位点的试剂盒，其内含有装在一个或分装在多个容器内的用以检测GJB3基因250G→A突变的成分，与之同时提供的可以是经政府药物管理机构审核的、有关药品或生物制品的制造、使用及销售信息。例如，采用PCR扩增后，直接检测样品中GJB3基因250G→A突变位点的试剂盒，可含有扩增引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液等的一种或多种。本领域技术人员已知，以上组分仅是示意性的，例如，所述的引物可以依据已知的核苷酸序列设计，通常为15-30个碱基，GC含量为45-50％左右，在适当的温度下与末端特异性结合，其可以利用专门的计算机程序设计，所述的用于PCR反应的DNA聚合酶是能够用于PCR扩增的酶。使用方法如下PCR扩增用软件Primer3对GJB3基因的编码区设计PCR引物，反应条件为94℃预变性5分钟，94℃变性30秒，退火温度58℃30秒，72℃延伸40秒，35个循环，反应结束后再72℃延伸7分钟，4℃保存。
PCR产物纯化将含有PCR产物的MultiScreen-PCR板抽真空，加入去离子水，静置，随后将MultiScreen-PCR板置于混合器上震荡，纯化后的PCR产物重新溶解后转移至另一洁净的96孔板中。
测序反应及验证以PCR引物作为测序引物进行测序反应，在ABI9700热循环仪上进行测序反应。反应结束后，延伸产物上样于ABI PRISM 3730DNA序列分析仪。将所得到的测序图谱进行分析，与Genebank中的标准序列比较可以发现突变位点。该试剂盒可简便快捷地检测GJB3-250G→A突变位点，从而应用于耳聋相关基因的检测和耳聋治疗方法中。
上述突变也可以用杂交探针来检测，所用的杂交探针可以是与正常的GJB3核苷酸序列杂交，或与突变的核苷酸序列杂交，或与它们的互补序列杂交的探针。这些探针可以用放射性同位素，发色物质或荧光物质标记。在进行探针检测前，用PCR扩增。尤其，利用等位基因特异探针，可以筛查已被确定的突变是否存在。
该突变位点的发现为耳聋的诊断和治疗提供了基础。本发明因此还涉及所述检测方法在耳聋的诊断或治疗中的应用。例如，在检测为发生了250G→A突变之后，可以将正常基因导入携带突变基因的细胞并在其中表达，它可与内源性突变基因发生重组，从而可进行基因治疗。而且，发明人对不同连接蛋白氨基酸序列进化研究的结果表明，该突变位点具有高度保守性，因此本发明的发现具有重大意义。
附图简述图1是GJB3编码区氨基酸与核酸碱基的对照突变位于GJB3的第二跨膜区，第250个碱基。用方框圈起来的是突变的碱基和氨基酸。
图2是GJB3测序结果，上方为正常对照序列，下方为突变序列，箭头所指为突变位点(250G→A，V84I)。
图3是CX31结构示意图， 表示突变位于第二跨膜阈(M2)。
图4是不同连接蛋白氨基酸序列进化研究(提示突变位于高度保守区域)多种连接蛋白氨基酸序列序列比对，箭头所指为Val84位点，可见所有连接蛋白中该位点均为缬氨酸(Val)，说明为高度保守区。
图5是PCR反应过程示意图，示出了反应温度和时间。
图6是实施例2中电泳条带图。
实施例1待测血样提取与GJB3基因编码区的PCR扩增一、待测对象血样DNA的制备1、研究对象聋病门诊收集的各种感音神经性聋患者89例，其中非综合征型耳聋83例，其中有家族史者10例，散发73例，耳聋6例。正常对照103例。对所有参加者详细调查其病史以及家族史，并对其进行体格检查，耳科检查包括耳镜检查、听力学评估。在签署知情同意书以后每人采集血样5-10ml。
2、基因组DNA提取采用酚氯仿抽提法。
第一天l、抗凝血用PBS作1倍稀释。
2、在离心管中加入2倍体积的淋巴分离液(18℃-28℃)，上面铺一层1倍体积已稀释的血液，室温1000×g，离心20分钟。
3、吸弃上清，小心吸出中间有核细胞层，转入5mlEp管中，5000×g，离心10分钟，然后用PBS洗一次。5000×g，离心10分钟。
4、将细胞悬于2mlTE缓冲液中，加10％的SDS至终浓度0.5％(100μl)，蛋白激酶k 100-200μg/ml(10mg/ml)，50℃水浴3-5小时。
5、用酚氯仿提取。用等体积的饱和酚，加入混匀，5000×g，离心10分钟。
6、吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积酚∶氯仿混合物，混匀，5000×g，离心10分钟。
7、吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入等体积氯仿∶异戊醇混合物，混匀，5000×g，离心10分钟。
8、吸上清液至新离心管中，弃下层沉淀，加入1/10体积的乙酸钠，混匀。
9、加入2.5倍体积的无水乙醇。
10、-20℃沉淀DNA过夜。
第二天11、高速离心，10000×g，10分钟，4℃。
12、弃上清，加入75％乙醇2ml，高速离心10000×g，5分钟13、弃上清，吹干。
14、用TE缓冲液溶解，(200μl TE/5ml全血，400TE/10ml全血)15、分装。1％琼脂糖电泳和分光光度计定量。
二、GJB3基因编码区的PCR扩增1.引物序列上游引物CX31-F5’-TTCATTCATACGATGGTTTTTCC-3’(nt3513-nt3535)下游引物CX31-R5’-TCACTCAGCCCCTGTAGGAC-3’(nt4477-nt4458)注GJB3基因序列检索号NT0045112.PCR反应体系的建立(附表1)附表1GJB3基因的PCR反应体系
其中缓冲液、dNTP、Taq酶从宝生物公司购得。引物由上海生工公司合成。
反应条件PCR反应在ABI公司9700热循环仪上进行，反应过程(包括温度和时间)如图5所示。
实施例2GJB3基因编码区PCR扩增产物的纯化和定量PCR产物的纯化——96孔板法1.向装有PCR产物的96孔板中加入50ul无菌水，混匀。
2.将其转移到Millipore纯化板中，放到真空泵上抽滤约3分钟，看到纯化板中没有水即可。
3.向纯化板中再次加入50ul的去离子水，继续抽滤，直到纯化板中没有水为止。
4.将纯化板从真空泵上取下，向板中加入20ul的去离子水，静止15分钟，再震荡15分钟，然后吸到一新96孔板内。
5.保存在-20度冰箱中。
电泳定量1、样品准备PCR产物(2ul)+上样缓冲液(6ul)共8ul×96取一96孔点样板，每孔先加上样缓冲液6ul，在从装有PCR产物的腔板中，每孔用排枪移出PCR产物(2ul)，转移到点样板上、混匀、离心(腔板孔号要与96孔点样板一一对应)。
2、流程1)配胶(0.8％琼脂糖)称取2.4g琼脂糖，悬浮于300ml 0.5×TBE中(500ml锥形瓶)。
2)溶胶微波炉中高火加热至沸，持续沸腾数分钟，注意不要沸出，其间取出混匀。
3)凉胶待胶完全溶解，从微波炉中取出，凉至60℃左右，加入1滴EB(约10ul，10mg/ml)，摇匀。
4)铺胶平板两端用胶布封严，把250ml胶液全部倒入平板，插入梳尺。
5)上胶将平板放入已盛有电泳液(0.5×TBE，液面距胶面1至2mm)的电泳槽中，拔下梳尺。
6)加样用排枪按规定格式加样，最后用单枪加入DNA标准品。
7)走胶盖上电泳槽盖，检查正负级，开启电泳仪，调节电泳电压。
8)定量当溴酚蓝走离加样孔1.5至2cm处，关闭电泳仪，小心取胶，放入摄相仪照相，进行定量。定量marker为DL2000，如图6所示，经过电泳后，有6条带可见，片段长度分别是2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp，DL2000的总浓度是300ng/5ul。电泳时取5ul DL2000，因此每条带的含量为50ng。PCR产物电泳时取3ul(PCR产物)+5ul(上样缓冲液)进行电泳。根据PCR产物电泳后的灰度值与DL2000的灰度值的比较判断PCR产物的含量。
实施例3纯化的GJB3基因编码区PCR扩增产物的直接测序1.PCR产物DNA模板的纯度与用量要求DNA纯度OD260/OD280＝1.6～2.0。
DNA浓度PCR产物10ng/μL。
DNA用量PCR产物100-200bp 1-3ng200-500bp 3-10ng500-1000bp 5-20ng1000-2000bp10-40ng＞2000bp 40-100ng2.测序反应(1)、测序反应所需试剂应为新鲜配制，需要经高压灭菌的试剂必须灭菌后方可使用。测序反应所需的器材(如384孔板、tip头等)同样应为洁净无菌的。
(2)、为了保证测序样本及反应试剂的新鲜，加样时应在冰上操作。
(3)、目前的反应体系为5ul，各种试剂加入量如下
*BigDye 3.1为美国应用生物系统公司(ABI)生产的一种用于测序反应的荧光染料。
(4)、样品放于PCR仪上做如下反应
(5)、反应完的样品要及时从PCR仪上取下，短时间内要进行纯化的样品放置于4℃冰箱中，超过一天以上才能纯化的样品放置于-20℃冰箱冷冻。
3.测序反应物的纯化和测序(1)向每孔中加入20μL80％乙醇，4,000rpm离心30min；将样品板放在折好的纸巾上，在离心机中倒甩，倒甩时速率不能超过1,000rpm；(2)在每孔中加入30ul 70％乙醇，4,000rpm离心10min，倒甩；(3)重复第2步的操作；(4)重复第2步的操作；(5)将样品板放于干净的抽屉中，避光干燥30min；(6)加入5ul甲酰胺，封膜，离心后置于-20℃冰箱中；(7)上机器前95℃变性5分钟，放置冰上2分钟，离心后上样。测序图如图2所示。
实施例4突变位点进化研究突变分析应用DNAStar5.0(Lasergene inc.)软件包中的SeqmanTM软件进行序列对比分析。将测序得到的序列与NCBI检索到的标准序列进行比对，找出突变序列，发现了突变位点(250G→A，V84I)。
进化研究在数据库中找出各种不同的28种连接蛋白氨基酸序列，应用ClustalX软件进行比对分析。通过研究发现V84位点位于第二跨膜区，在连接蛋白家族中高度保守，参看图4。
实施例5检测耳聋相关基因GJB3-250G→A突变位点试剂盒及其应用1、试剂盒含有(1)扩增用引物上游引物CX31-F5’-TTCATTCATACGATGGTTTTTCC-3’(nt3513-nt3535)下游引物CX31-R5’-TCACTCAGCCCCTGTAGGAC-3’(nt4477-nt4458)注GJB3基因序列检索号NT004511(2)PCR扩增用Taq酶5U/ul(3)10×缓冲液(含15ml MgCl2)(4)dNTP2mM(5)Big-Dye mix2、使用方法主要包括如下步骤A提取待测血样的DNA，利用上述引物，进行PCR反应；BPCR反应产物纯化后直接测序，将所得的序列与Genebank中的标准序列比较确定突变位点的存在。
C按正常阅读框进行翻译以确定Cx31氨基酸突变位点。
具体方法参见实施例1、2、3。
应该理解的是，在阅读了本发明的上述内容以后，本领域普通技术人员在不偏离本发明的范围的情况下可以对本发明做各种改动，因此这种改动或其等效形式同样落在本申请权利书所限定的范围内。
序列表SEQUENCE LISTING<110>解放军总医院，北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>耳聋相关基因突变的检测方法<130>
<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>813<212>DNA<213>人<220>
<221>CDS<222>(1)..(810)<223>
<400>1atg gac tgg aag aca ctc cag gcc cta ctg agc ggt gtg aac aag tac 48Met Asp Trp Lys Thr Leu Gln Ala Leu Leu Ser Gly Val Asn Lys Tyr1 5 10 15tcc aca gcg ttc ggg cgc atc tgg ctg tcc gtg gtg ttc gtc ttc cgg 96Ser Thr Ala Phe Gly Arg Ile Trp Leu Ser Val Val Phe Val Phe Arg20 25 30gtg ctg gta tac gtg gtg gct gca gag cgc gtg tgg ggg gat gag cag144Val Leu Val Tyr Val Val Ala Ala Glu Arg Val Trp Gly Asp Glu Gln35 40 45aag gac ttt gac tgc aac acc aag cag ccc ggc tgc acc aac gtc tgc192Lys Asp Phe Asp Cys Asn Thr Lys Gln Pro Gly Cys Thr Asn Val Cys50 55 60tac gac aac tac ttc ccc atc tcc aac atc cgc ctc tgg gcc ctg cag240Tyr Asp Asn Tyr Phe Pro Ile Ser Asn Ile Arg Leu Trp Ala Leu Gln65 70 75 80ctc atc ttc gtc aca tgc ccc tcg ctg ctg gtc atc ctg cac gtg gcc288Leu Ile Phe Val Thr Cys Pro Ser Leu Leu Val Ile Leu His Val Ala85 90 95tac cgt gag gag cgg gag cgc cgg cac cgc cag aaa cac ggg gac cag336Tyr Arg Glu Glu Arg Glu Arg Arg His Arg Gln Lys His Gly Asp Gln100 105 110tgc gcc aag ctg tac gac aac gca ggc aag aag cac gga ggc ctg tgg384Cys Ala Lys Leu Tyr Asp Asn Ala Gly Lys Lys His Gly Gly Leu Trp115 120 125tgg acc tac ctg ttc agc ctc atc ttc aag ctc atc att gag ttc ctc432
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权利要求
1.一种耳聋相关基因的检测方法，该方法包括检测GJB3基因第250个碱基的改变或由该碱基改变引起的表达产物的改变。
2.根据权利要求1的检测方法，其中所述第250个碱基的改变为G突变为A。
3.根据权利要求1的检测方法，其中所述表达产物为连接蛋白Cx31。
4.根据权利要求1的检测方法，其中所述表达产物的改变为该GJB3基因编码的蛋白的第84位氨基酸由缬氨酸改变为异亮氨酸。
5.根据权利要求1的检测方法，其中该方法通过PCR扩增-直接测序法来进行。
6.根据权利要求5的检测方法，其特征在于包括如下步骤A对于GJB3基因的编码区设计引物，进行PCR扩增，或者对于GJB3基因第个250碱基附近设计引物，进行PCR扩增；BPCR反应后直接测序，将所得到的序列与Genbank中的序列比较确定GJB3突变位点。
7.根据权利要求6的检测方法，其特征在于进一步包括如下步骤C按正常阅读框进行翻译以确定GJB3基因突变位点。
8.根据权利要求1的检测方法，其中通过GJB3基因的探针与从体外样品分离的DNA杂交来检测所述碱基的改变。
9.根据权利要求1的检测方法，其中通过限制性片段长度多态性来检测所述碱基的改变。
10.一种检测GJB3基因250G→A突变位点的试剂盒，其包括扩增用引物，dNTP，用于PCR反应的DNA聚合酶及其缓冲液。
11.根据权利要求1的检测方法在耳聋的诊断或治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种耳聋相关基因的检测方法，该方法包括检测GJB3基因第250个碱基的改变或由该碱基改变引起的表达产物的改变。本发明进一步涉及检测上述基因突变位点的试剂盒及应用。另外本发明还涉及上述该检测方法的应用。
文档编号C12Q1/68GK1690222SQ20041003737
公开日2005年11月2日 申请日期2004年4月30日 优先权日2004年4月30日
发明者王秋菊, 沈岩, 韩东一, 杨伟炎, 李庆忠 申请人:中国人民解放军总医院, 北京诺赛基因组研究中心有限公司