一管式检测突变位点的不同突变类型的制作方法
【专利摘要】本发明基于我公司的发明德歌等温扩增技术（专利申请号：201210474669.5）实现一管式检测不同突变位点的不同突变类型（也包括同一突变位点的不同突变类型）的方法或理论，检测基因突变就要将覆盖突变点的引物设计到结构上的必要引物片段上，从而实现一管式检测不同突变位点的不同突变类型（也包括同一突变位点的不同突变类型）。
【专利说明】一管式检测突变位点的不同突变类型
【技术领域】
[0001]一管式共用引物法检测不同突变位点不同突变类型(也包括同一突变位点的不同突变类型)，此发明可以应用于等温扩增检测【技术领域】，也可以应用于PCR检测等领域，检测结核杆菌、乙型肝炎病毒、HIV病毒等基因突变或耐药检测。
【背景技术】
[0002]目前在行业应用最广范的耐药检测是药敏实验和基因芯片技术，药敏实验耗时太长，基因芯片虽然能实现高通量检测但是制备成本及检测费用均较昂贵，灵敏度低，不宜大面积推广。因此急需一种检测成本低、灵敏度高切实可行的方法。
【发明内容】
[0003]本发明的目的是:提供一种同时一管式检测不同突变位点不同突变类型(也包括同一突变位点的不同突变类型)的核酸扩增检测方法。
[0004]本发明的技术方案是:依据我们公司的德歌等温扩增核心反应结构(见附图1)，引物Ftl为变值，两个Ftl可以是同值也可以是不同值，但不能产生二聚体的任何引物片段(当然也可以是O值，即没有F。)，为提高反应效率F。可以设为目标DNA扩增区段内片段。
[0005]1、一管式共用引物法检测同一突变位点的不同突变类型:
突变点可以设计到引 物B或A上，如果设计到引物B上，为提高反应效率只能在Ac区两端加入其它引物(见附图2)，当然为了加快反应可以加入更多的引物，前提是不能引起二聚体，而不能在DNA的B。区再加入其它引物结构，要保证引物B是反应的必要引物片段(也就是没有引物B，扩增反应不可能发生)。为了加快反应H)可以取反应区段的DNA片段，如A片断。当然也可以个别取A值，个别取O值。
[0006]如果DNA片断B两侧仍有其它突变位点，而且相距很近，无法保证引物B的特异性，就如同我们权利要求5中的情况，要保证引物A及为加快反应另外加入的引物的特异性，通过联合保证特异性的方法保证特异性。也就是引物B的对向引物特异性保证了，此结构只能和目标DNA扩增，前提是引物B不能和反应区段内的其它DNA位点吻合，而和目标DNA以外的DNA片段吻合却不会引发扩增反应。以上就是我们检测同一突变位点的不同突变类型及联合保证特异性的核心理念。
[0007]具体的引物设计可以参考我们的另一个专利(申请号:201210474669.5):一管式共用引物法检测同一突变位点的不同突变类型，此处共用引物就是非覆盖突变位点的引物。
[0008]2、一管式检测不同突变点位点的不同突变类型:
我们假定同时检测结核分枝杆菌516、526、531三个突变位点，突变类型如下:D516V (A — T)、D516G(A — C)、H526Y(C — T)、H526D (C — G)、S531L(C — T)、S531W(C — G)，这几种突变都会导致利福平耐药，我们无须确定基因突变是以上哪种类型，只要检测出以上一种突变存在即可检测出利福平耐药，那么引物结构设计(见附图3)，其中BI为覆盖531突变位点引物，B2为覆盖526突变位点引物，B3为覆盖516突变位点引物，如图的引物结构，如果516、526、531均未突变，这个结构就不会发生扩增反应，如果有一点突变和设计引物吻合，就会发生扩增反应，就可以判断有基因突变，利福平耐药，这样一管就可以实现是否有基因突变的检测，当然为了加速反应，还可以在3’ -5’ AC侧加入对应引物(见附图4)，以加快解链和合成链的作用，原理同上，应不能在覆盖突变位点侧加入其它引物，以保证此侧为必要反应条件。
[0009]本发明以我们公司发明的德歌等温扩增系列新方法(专利申请号:201210474669.5)为基础，单独针对一个突变点而言，主要目的是保证覆盖突变点引物为必要反应条件为原理，从而实现了一管式同时检测不同突变位点的不同突变类型，所有的引物结构仍依托于德歌等温扩增的核心反应结构，只是在核心反应结构上的变通，专业人士应该明白，任何其它的变通形式均在我们核心结构的保护范围。
[0010]3、引物设计实例
将覆盖突变点的引物和对向引物中的H)均设计成引物A为保证C和G的含量并在5’端加入了两个T
D516V (A — T)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGAGCCAATTCATGGT
D516G (A — C)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGAGCCAATTCATGGC
H526Y (C — T)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGTCGGGGTTGACCT
H526D (C — G)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACTGTCGGGGTTGACCG
S531L(C — T)引物:TTCACGCTCACGTGACAGA`CCAAGCGCCGACTGTT
S531ff(C — G)引物:TTCACGCTCACGTGACAGACCAAGCGCCGACTGTG
共用引物 A-A:TTCACGCTCACGTGACAGACCACGCTCACGTGACAGAC
用我公司专利(专利号201210380093.6)中的2号指示剂反应阳性和阴性见附图5。
[0011]4、本发明的有益的积极效果:
WHO 2009年报告全球新发结核病440万，其中多耐药结核为42万，广泛耐药结核占多耐药结核的10% ;我国调查显示初治结核耐药率为10%左右，复治结核患者耐药率高达35%以上。耐药结核已经成为严重的公共卫生威胁。南非一组53名艾滋病合并耐药结核患者，死亡52名，其中70%在30天内死亡；耐药结核治疗与患者管理十分困难，治疗费用远远高于普通结核，同时由于人口流动，耐药结核患者难于发现，管理存在盲区，对社会人群造成严重威胁。不仅在肺结核领域，在乙肝治疗中，也出现耐药，乙肝(乙型病毒性肝炎)耐药性主要是指体内乙肝(乙型病毒性肝炎)病毒发生变异，导致起初选择的乙肝(乙型病毒性肝炎)治疗药物不再发挥任何的治疗功效。还有艾滋病领域都出现了类似问题。那么开发一种简单快速、灵敏度高的检测方法迫在眉睫，本技术为检测耐药找到了一种切实可行的方法。
[0012]本发明专利内容采用我公司发明的等温扩增技术对不同突变点不同突变类型进行检测(也包括同一突变位点的不同突变类型)，检测敏度更高，检测时间短、操作简便、同时又可以实现高通量检测，不但适合大医院使用也可以在中小医院使用，对肺结核感染提供了快速的分子诊断。同时，它也可以对多种在耐多种药物型结核病、乙肝病、艾滋病等患者中最为常见的基因突变进行检测，疾病耐药的早期诊断有助于即时对患者实施高强度的治疗方案，从而有助于控制疾病的传播。[0013]最后应说明的是:以上实施例仅用于说明而非限制本发明的应用，本领域的技术人员应当理解:本发明也可用于其他的核酸等温扩增及产物检测，包括但不限于环介导等温扩增、PCR、滚环扩增、依赖解旋酶的等温扩增、链替代扩增、切刻内切酶核酸等温扩增；同时，本领域的技术人员也应当理解:可以对本发明进行修改或者等同替换，在不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求保护范围中。
【专利附图】
【附图说明】
图1为设计核心结构；
图2为提高反应效率增加其它引物结构；
图3为一管式检测不同突变位点的不同突变类型引物设计结构举例；
图4为提高反应效率增加其它引物结构；
图5为 可视化指示剂阳性及阴性颜色对比结果。
【权利要求】
1.基于我公司德歌等温扩增技术(专利申请号:201210474669.5)的核心反应结构三(见说明书)，实现一管式检测同一突变位点的不同突变类型，将突变点设计到结构中必要的引物片段上，同时根据结构三的变通形式实现一管式检测不同突变位点的不同突变类型。
2.根据权利I要求我们保护的是我们检测突变的引物设计结构(见说明书)，包括在此结构上的任何变通形式，无论在非覆盖突变引物侧加入几个引物或加入任何引物结构，这些都是我们专利的保护范围，当然这些所有的结构在我们(专利申请号:201210474669.5)中已经提请保护，在此我们只是公开检测突变的应用方法。
3.本专利的核心是覆盖突变点的引物侧所有的引物都是必要引物，而不能加入其它引物结构，如果DNA中不存在设计突变位点的突变类型对应此种突变类型的扩增反应不会发生，只要目标DNA中只要有与设计的突变类型吻合的突变位点那么理论上将发生扩增反应，我们一管式检测不同突变类型不是要确定其中存在哪种突变类型，而是要确定只要存在设计突变类型当中的一种，即证明一种或几种药耐药。
4.针对几个基因突变位点过近导致引物长度无法保证情况下的引物设计，覆盖突变点的引物可以适当缩短，可以短到失去特异性，但覆盖突变点引物设计不能短到和目标DNA反应区段其它位点碱基吻合，那么可以通过联合保证特异性的方法，覆盖突变的引物可以不具有特异性，非覆盖突变点的对向引物特异性必须保证，那么非覆盖突变点的对向引物只有联合覆盖突变点的引物才能发生扩增反应，因为具有特异的非覆盖突变点引物只能和目标DNA发生扩增反应，从而保证了整个反应的特异性，也就是说如果引物设计中有一条引物失去了特异性，但联合却具备特异性也在本专利的保护范围(不限于检测基因突变)。
5.此类结构也可以应用于其它方式的核酸扩增均在本专利保护范围。
6.此方法 主要应用于各种突变耐药基因(如肺结核、乙肝、艾滋病等)的检测。
【文档编号】C12Q1/70GK103865982SQ201210532462
【公开日】2014年6月18日 申请日期:2012年12月12日 优先权日:2012年12月12日
【发明者】曲海涛, 王德国, 张文超 申请人:哈尔滨德歌生物科技有限公司