与大白菜cca1基因编码区突变相关的功能性标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于蔬菜育种及分子遗传学领域，具体涉及两个与大白菜光周期调控关键 基因 CCAl编码区突变的功能性分子标记及其应用。
【背景技术】
[0002] 大白菜（Brassica rapa L. ssp pekinensis)是十字花科重要的蔬菜作物，原产于 中国，在世界各地尤其是东南亚广泛种植。目前，已经育成了适合春、夏、秋不同季节栽培的 大白菜新品种，使得大白菜实现了周年供应，这对保证蔬菜市场供应、稳定物价起到了积极 的作用。
[0003] 在不同季节栽培的大白菜品种中，春白菜对品种耐抽苔性的要求最高，主要是因 为春白菜栽培季节面临前期环境低温和后期环境日照较长的影响。如果春白菜品种的耐 抽苔能力不强，则前期低温极易使幼苗通过春化，导致后期叶球内短缩茎较长、甚或已经抽 薹，从而影响产品的商品价值和品质。所以，春白菜育种的关键是拥有极耐抽薹的育种材料 以及获得与耐抽苔特性紧密连锁的分子标记，以提高春白菜的育种效率。
[0004] 目前，与大白菜抽薹开花相关的分子标记报道主要有：【卓祖闯.大白菜耐抽薹性 状遗传规律分析及其分子标记的筛选.西北农林科技大学硕士学位论文；郁有健.大白菜 抽薹开花相关基因 SNP分析与晚抽苔开花性状QTL定位.东北农业大学硕士学位论文；高 颖，罗双霞，王彦华，顾爱侠，赵建军，陈雪平，申书兴.大白菜抽薹开花时间与SSR和InDel 标记的关联分析.园艺学报.2012, 39(6) : 1081-1089】，但上述研宄所得到的标记要么是数 量性状位点，要么连锁程度不够紧密，很难用于育种辅助选择。因此，有必要寻找基于抽薹 开花途径关键基因突变的位点特异性分子标记，以提高选择的精准度。
[0005] 大白菜与模式植物拟南芥亲缘关系较近，同属于芸薹属，因此拟南芥抽薹开花机 制研宄的有关结果可以为大白菜相关研宄提供借鉴。对模式植物拟南芥的研宄结果表 明：植物开花受四条途径控制，即自主途径、赤霉素途径、春花途径和光周期途径。四条途 径并非彼此相互独立，而是通过一些整合基因形成一个复杂的调控网络，协同控制拟南芥 的开花【徐雷，贾飞飞，王利琳.拟南芥开花诱导途径分子机制研宄进展.西北植物学 报.2011，31 (5) : 1057-1065】。在光周期控制的开花途径中，起关键作用的是光受体及其 介导的信号传导，拟南芥基因组中的光受体有3类，即光敏色素、隐花色素和向光色素，其 中光敏色素和隐花色素参与光周期调节的植物开花【赵淑清，罗志鹏，李昱.拟南芥光 周期调控开花的研宄进展.山西大学学报（自然科学版）.2009, 32 (2) :308-314】，其中 的光周期调节涉及相互连锁的反馈环（Pruneda-Paz and Kay, An expanding universe of circadian networks in higher plants. Trends Plant Sci. 2010,15 :259-265)，起 关键作用的是光周期调控因子CCA1、LHY和T0C1。已有研宄表明，CCAl是一个MYB类 转录因子，其突变后直接影响拟南芥感受光周期的响应能力，减少拟南芥的昼夜节律振 幅、缩短了光周期。所以，研宄CCAl基因对了解光周期依赖的植物开花途径有重大意 义。对CCAl的结构分析表明：N端第11-82位氨基酸残基是MYB结构域，与DNA结合有关 (Zhi-Yong Wang, David Kenigsbuch, Lin Sun,Eitan HareI, May S.Ong, Elaine M. Tobin, A Myb-Related Transcription Factor Is Involved in the Phytochrome Regulation of an Arabidopsis Lhcb Gene, The Plant Cell, 1997, 9, 491-507) ;N 端第 136-316 位氛 基酸残基与蛋白二聚化有关；C端是磷酸化调节区（Xavier Daniel, Shoji Sugano, Elaine M. Tobin, CK2phosphorylation of CCAlis necessary for its circadian oscillator function in Arabidopsis，PNAS，2004, 101:3292 - 3297).因此关键区域氨基酸突变都有 可能影响上述功能区，从而影响其介导的光周期开花响应。
[0006] 大白菜全基因测序工作已经完成【Wang et al.，2011，the genome of the mesopolyploid crop species Brassica rapa. Nature Genetics. 43(10):1035-103)】， 通过与拟南芥全基因比较，其相关功能基因的预测和注释也已完成并制作成BRAD数据库 【Cheng F, Liu S, Wu J, Fang L, Sun S, Liu B, Li P, Hua ff, Wang X. BRAD, the genetics and genomics database for Brassica plants. BMC Plant Biol. 2011, 11:136】，其中对开花基 因的注释有专门的检索菜单。在大白菜基因组中有一个拷贝的CCAl编码基因，位于第五 染色体。我国有适合不同季节栽培的大白菜种质资源，其抽薹开花性状差异较大，其中不 乏长、短日照条件下开花时间存在显著差异的材料，但至今未见有关光周期响应调节因子 CCAl突变与开花时间的有关报道。
[0007] 插入/缺失多态性（Insertion/Deletion，InDel)标记是由于同一位点处的DNA 序列在不同个体间发生了核苷酸片段的插入/缺失，根据目标位点两侧的序列设计特异引 物进行PCR扩增，扩增片段的长度多态性即是InDel标记。由于这种标记直接位于功能基 因内部，有可能导致所编码蛋白的结构变异和功能差异，因此又称为功能性标记。InDel标 记的检测手段因插入片段大小而定，插入片段较大的（大于50bp) -般采用操作简单的琼 脂糖凝胶顶用分离、而插入片段较小的（小于30bp) -般采用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，前 者操作简单、后者操作繁琐。然而高分辨率琼脂糖可以实现4-6bp差异片段的检测。
[0008] 鉴于在模式植物拟南芥中发现的CCAl突变对抽薹开花时间影响的相关结果，推 测在大白菜中也存在类似突变控制的晚开花突变体资源，因此，有必要对我国丰富的大白 菜资源在CCAl位点进行筛查，以发现各位点可能存在的突变类型；同时针对突变位点与野 生型的序列差异，开发与突变体检测有关的位点特异性分子标记。
【发明内容】
[0009] 针对目前大白菜在CCAl基因位点突变体鉴定方面的空白，本发明的目的是提供 一种与大白菜CCAl基因编码区突变相关的功能性标记，以及用于鉴别上述功能性标记的 引物。
[0010] 为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
[0011] 本发明首先对两份开花时间存在显著差异的大白菜自交系材料Hel02(长、短日 照下开花早）和06-247(长、短日照下开花晚）进行全基因组重测序，从测序结果中分析发 现二者光周期响应因子CCAl编码区存在差异，即易抽薹大白菜资源Hel02中获得的CCAl 基因编码区存在小片段插入突变，与BRAD数据库中Chiifu401大白菜的CCAl相比，其在编 码区330bp和1416bp之后分别插入6个碱基。因此，可以开发成用于大白菜CCAl基因编 码区突变检测的功能性标记。
[0012] 与大白菜CCAl基因编码区突变相关的功能性标记，包括：与区分5'端6bp插 入相关的功能性标记，分别命名为5-InDel-W150(野生型）和5-InDel-ml56(突变体）， 5-InDel-W150(野生型）的片段大小为 150bp，如 SEQ ID No.l 所示，5-InDel-ml56(突变 体）的片段大小为156bp，如SEQ ID No. 2所示；
[0013] 与区分3'端6bp插入相关的功能性标记，分别命名为3-InDel-W133(野生型）和 3-InDel-ml39(突变体），3-InDel-W133(野生型）的片段大小为133bp，如SEQIDNo·3所 示，3-InDel-ml39(突变体）的片段大小为139bp，如SEQ ID No. 4所示。
[0014] 用于鉴别5'端6bp插入相关的功能性标记的引物为：
[0015] 正向引物 PF5 :5' -CTAAAGGTGTACCAGTGGCTCAA-3' ；（如 SEQ ID No. 5 所示）。
[0016] 反向引物 PR5 :5' -CAAGGGACTCTTTTCCATCATTC-3' ；（如 SEQ ID No. 6 所示）。
[0017] 用于鉴别3'端6bp插入相关的功能性标记的引物为：
[0018] 正向引物 PF3 :5' -TTTACATATAAGAGAGAGGAGGGTCA-3' ；（如 SEQ ID No. 7