专利名称：产生高组分冠菌素的菌株及其发酵生产冠菌素的方法
技术领域：
本发明涉及微生物及其发酵生产化合物的领域。具体地说，涉及用于发酵生产冠菌素的新菌株，以及利用该菌株发酵生产冠菌素的方法。
背景技术：
冠菌素是重新命名的中文名称，上世纪90年代我国植物病理学家曾称它为冠毒素，现在知道冠菌素除了对植物有毒素一面，还有更重要的一面是对植物具有极高的生理活性，因此称为冠菌素更为合适。英文名为coronatine。1977年Ichikara等发现丁香假单胞菌绛红致病变种(Psendomonas syingae pv.alropurea)，能导致Lolium multiflorum发生褪色斑，造成这种褪色斑的原因是该菌产生的一种化合物所致，Ichihara将这种化合物命名为coronatine，这是因为该菌的旧名称为Ps.corofaciens var.aropurpurea，取其种名的词头组成。后来还有多人在不同植物类似病斑中分离出病原菌，也产生coronatine。
1995年以来，Mittal等发现冠菌素与脱落酸和茉莉酸，尤其是与茉莉酸有类似的生理功能，但其活性几乎是茉莉酸的100-1000倍，以我们生产的冠菌素所作的棉花试验为例，将冠菌素配成1ppm-10-6ppm的溶液浸泡棉花种子，9天后测定种子萌发的主根长、下胚轴长、侧根数、发芽率等，发现10-2ppm的浓度尚有抑制作用，只有在10-4ppm的浓度才表现出促进生长作用。有关资料表明冠菌素还使红豆杉中的抗癌物-紫杉醇的量提高10倍，它作为除草剂活性强于茉莉酸，有可能成为新型除草剂的主导化合物。其它与茉莉酸类似的功能，如促进植物合成乙烯，促进和解除休眠、器官分化、不定根形成、叶片和果实脱落、诱导花形成等等，活性均高于茉莉酸。由于冠菌素具有高效的植物生长调节功能、对人畜无害、不污染环境，有望取代目前化学合成的同类型制剂，是今后值得重视的绿色产品。
冠菌素的结构如图1，它有一个含氨基酸的冠烷酸(coronamine acid)和一个聚酮结构的冠菌酸(coronafacine acid)组成，两个组分以酰胺键连接。单独的冠菌酸也具活性，但没有冠菌素活性高。
虽然对冠菌素有一些零散的研究，但国际上没有冠菌素产品，这是由于自然界中的野生菌株产生冠菌素的量很少，日本北海道大学市原狄民等从250升发酵液中得到的冠菌素、冠菌酸和冠烷酸共200毫克，其中冠菌素只有60毫克。因此市原狄民认为冠菌素产量如此之低，不可能通过发酵法生产。市原狄民等(1998年)化学合成的方法是成功的，大概需要15步反应，但费用很高，不适于工业化生产。
本发明采用自然筛选，人工诱变等手段，获得了一株能发酵产生高组分冠菌素的微生物菌株，利用该菌株可以发酵生产高含量的冠菌素，实现了冠菌素的工业化生产。
发明内容
本发明提供一株新的能发酵产生高组分冠菌素的菌株，即丁香假单胞菌(Psendomonas syringae)Y-2018菌株。丁香假单胞菌Y-2018已于2004年3月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.1105。
本发明还提供了一种工业化生产冠菌素的发酵和提取方法，该方法包括将丁香假单胞菌Y-2018菌株经斜面菌种培养，摇瓶种子培养，及发酵培养获得含有冠菌素的发酵液，经浓缩、溶媒萃取、脱色、浓缩萃取液，再经硅胶柱层析(或不经硅胶柱层析)得到提取液，使其结晶，重结晶，得到晶粉和不结晶的母液。
一.菌株选育第一阶段首先从27株野生假单胞菌中筛选，得到一株产冠菌素较高的011菌株，经多次紫外线等的诱变获得一株比出发菌株产量提高39％的156号菌株。
第二阶段将较高产的156菌株经亚硝基胍等诱变，获得不需要经过低温发酵的343和422菌株。获得的突变株可以在26℃下培养。由于低温培养，需使用大量的冷水降温，而突变株克服了野生菌株必需低温才能积累冠菌素的弱点，使正常发酵方法成为可能，省去大量用水和电耗。
第三阶段将不需低温的343菌株再经紫外线和亚硝基胍等多次反复诱变，获得了一株既不需低温又能耐有机氮的774菌株。因为使用有机氮会使菌体生长良好，从而合成较多的冠菌素，但是野生菌株不耐有机氮，不论前期供有机氮，还是中后期供应，都会抑制冠菌素的积累。通过诱变克服了这种缺陷，不仅使菌量增加，也使冠菌素积累成为可能。紧接着通过亚硝基胍和激光等的反复诱变，获得Y-2018菌株，使原来产量不到10ug/mL提高到40ug/mL以上。
丁香假单孢菌Y-2018菌株在菌落和菌体形态上与野生菌没有什么不同，菌落为稀薄的乳白色，小而光滑，在对光照射下呈现黄绿色荧光；菌体为小杆菌，两端钝圆。Y-2018与野生菌的不同处是该突变株改变了对生态条件的要求并使目前冠菌素的产量提高了4.3倍。
二.冠菌素的发酵生产1.斜面菌种的制备取Y-2018菌株接种到斜面培养基上，26～28℃培养2天。
斜面培养基组分为葡萄糖1g，牛肉浸膏0.3g，蛋白胨0.5g，琼脂1.5g，水100mL，pH7.4，121℃灭菌30分钟。
2.种子液的培养制作500mL锥形瓶装100mL种子培养基，培养基成分为白砂糖1-2g，玉米浆2g，硫酸铵0.1g，酵母膏0.1g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁0.08g，水100mL，pH7.4，121灭菌30分钟。
接入斜面菌种，26～28℃摇床培养24小时，回转摇床速度为160r/min。
种子液的扩大培养，例如3000mL锥形瓶或种子罐可按类似方法进行。种子罐需加0.03-0.09％的泡敌。
3.发酵培养先后使用过两种发酵培养基一号培养基(不含有机氮)白砂糖1.5-5.0g，氯化铵0.1-0.3g(或硫酸铵0.12-0.36g)，硝酸钾0.01-0.05g，磷酸氢二钾0.1-0.5g，磷酸二氢钾0.10-0.40g，水100mL，pH7.0-7.6。
二号培养基(含有机氮)白砂糖1.5-4.5g，玉米浆2-5g，豆饼粉0.6-1.5g，硫酸铵0.04-0.2g(或氯化铵0.03-0.18g)，硝酸钾0.01-0.3g，磷酸氢二钾0.05-0.2g，水100mL，pH7.0-7.4。
将种子液以2％接种量分别接入以上两种发酵培养基中。扩大培养包括发酵罐培养，可按类似方法进行，发酵罐培养需加0.03-0.09％泡敌。不论摇床或发酵罐，发酵周期均为96小时左右。二种培养基都可在26～28℃和18℃培养，18℃适于野生菌菌株，26～28℃适于突变株。发酵过程和结束均用高压液相色谱外标法测定，根据冠菌素峰面积换算出它们的产量。
4.冠菌素提取发酵液经96小时左右的培养，营养成分已接近耗尽，冠菌素已积累最高，称为成熟发酵液，应结束发酵进行提取。冠菌素提取主要包括酸化、大孔树脂吸附、洗脱、浓缩洗脱液、溶媒萃取、萃取液脱色、浓缩、柱层析、提取液浓缩结晶等。
成熟发酵液可用硫酸、盐酸、磷酸等调节发酵液至pH5-2，然后过滤除菌体(或不除菌体)流经大孔树脂吸附柱，去除大量水分、矿物质、残糖、蛋白质及大部分色素，用75-80％丙酮洗脱被树脂吸附的冠菌素，回收丙酮后，已浓缩20倍以上的洗脱液调酸至pH5-2，进行溶媒(乙酸乙酯、乙酸丁酯等)萃取，萃取液脱色、回收溶媒成为浓缩的萃取液，柱层析后或不柱析让其自然结晶(必要时可进行重结晶)，得到晶粉和不结晶的母液，用高效液相色谱法测出晶粉纯度和母液中冠菌素含量。
本发明的有益效果本发明获得的突变株具有较高冠菌素产量，并且该菌株不需要低温培养，克服了野生菌株必需低温才能积累冠菌素的弱点，省去了低温培养时用于降温的大量用水和电耗，使正常发酵方法成为可能。此外，突变株可以使用有机氮培养基进行发酵，使用有机氮不仅使菌量增加，而且可以合成较多的冠菌素，但是野生菌株不耐有机氮，有机氮抑制冠菌素的积累。
图1冠菌素结构。从左至右分别为冠菌素，冠烷酸和冠菌酸。
图2液谱外标测产法模式图(图2-1为标样已知浓度得出的峰面积图，图2-2为样品测峰面积图从标样中求浓度)。
图3冠菌素的气谱图(上为标准样，下为样品)。
图4冠菌素的质谱图(左为标准样，右为样品)。
图5冠菌素的核磁共振图(说明冠菌素的重要功能基团与化学结构图相符)。
图6土豆块法(中间为处理，左右为对照)。
图7大豆苗法(图7-1左为处理苗矮于右的对照苗，图7-2左处理苗出现黄斑)。
具体实施例方式
实施例一取Y-2018菌株和出发菌株011斜面菌种，接入斜面培养基上，26～28℃培养2天待用。斜面培养基为葡萄糖1g，牛肉浸膏0.3g，蛋白胨0.5g，琼脂1.5g，水100mL，pH7.4，121℃灭菌30分钟。
制作500mL锥形瓶装100ml种子培养基2瓶，一瓶接入Y-2018菌株，一瓶接入出发菌株011，26℃摇床培养24小时，回转摇床速度为160r/min，摇瓶种子长好后待用。种子培养基为白砂糖1g，玉米浆2g，硫酸铵0.1g，酵母膏0.1g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁0.08g，水100mL，pH7.4，121灭菌30分钟。
制作两种发酵培养基，一是不含有机氮的1号培养基，配方为白砂糖1.5g，氯化铵0.1g，硝酸钾0.03g，磷酸氢二钾0.36g，磷酸二氢钾0.40g，水100mL，pH7.0-7.6。
二是含有机氮的2号培养基，配方为白砂糖2.5g，玉米浆3g，豆饼粉0.6g，硫酸铵0.2g，硝酸钾0.05g，磷酸氢二钾0.2g，水100mL，pH7.0-7.4。
两种发酵培养基各12瓶(500mL锥形瓶装100mL)，每种长好的种子培养液，按2％的接种量接入两种发酵培养基，即Y-2018菌株接1号6瓶，接2号6瓶，011菌株接1号6瓶，2号6瓶，然后两种发酵培养基分放26℃和18℃摇床，在相同的转速下，培养96小时，取出分别用高效液相色谱外标法测定它们的产量(见图2)，3瓶重复的平均结果如下表(单位为ug/mL)
从上表可以看出突变株Y-2018已经脱离了必须在18℃的环境条件，而且在有机氮存在的培养基上比没有有机氮的培养基已有提高，表明有着继续提高的潜力，出发菌株011必须低温，而且有机氮培养基将极大地降低冠菌素的积累。
实施例二本试验所用培养基的配方与实施例一相同。
将Y-2018菌株在4℃冰箱保存的菌种接入斜面培养基上，28℃培养48小时，使其活化。接着接两菌环到500mL锥形瓶装100mL的种子培养基内，接种3瓶，26℃摇床培养24小时。种子长好后，接入500mL锥形瓶装100mL的发酵培养基(2号培养基)内，接种量2％，共100瓶，28℃摇床培养4天，合并100瓶得10L发酵液，用高效液相色谱法测出冠菌素峰面积，如实施例1从标样中求出冠菌素浓度为36ug/mL，10L冠菌素总量为360mg。将发酵液调至pH3过滤，然后流过400mL体积的大孔树脂(扬州制药厂，型号YPR-II)柱，使冠菌素吸附在树脂上，用水清洗树脂间隙中的杂质，然后用75-80％丙酮洗脱，回收丙酮，留下的水溶液约300mL调pH 3后用400mL乙酸乙酯萃取，活性炭脱色，回收乙酸乙酯，留下浓缩的萃取液10mL，拌入硅胶、烘干、装到硅胶柱上，用三氯甲烷甲醇洗脱，收集含冠菌素的那部分溶剂，蒸去有机溶剂得到提取液，由于冠菌素量少，杂质多，无法结晶，只有1.7mL母液，取0.1mL母液用甲醇稀释成100mL，高效液相色谱法测得峰面积，如实施例1相同办法求出冠菌素浓度为168ug/mL，10L发酵液得到冠菌素168mg，收率为47％。
实施例三按实施例二的种子培养方法，得到对数生长的种子(500mL锥形瓶装100mL)3瓶，然后制作3000mL锥形瓶装1000mL种子培养基3瓶，分别将100mL长好的种子接入，26℃摇床培养18-20小时待用。接着制作发酵罐的发酵培养基(即2号培养基)，并加入0.03％的泡敌，200L发酵罐制备150L发酵培养液，经灭菌冷却至28℃，接入3瓶3000mL装的1000mL长好的种子，26℃培养4天，通风量0-16小时为0.8v.v.m，17-80小时为1.2v.v.m，81-96小时为0.9v.v.m。成熟发酵液经高效液相色谱测定，同实施例1法求出冠菌素含量为41.42ug/mL，150L总含量为6.213g。发酵液调pH3，经7.0kg大孔树脂(生产厂、型号同实施例2)柱吸附，14L80％丙酮洗脱，得洗脱液15L，这样就使发酵液浓缩10倍。然后回收丙酮，留下含冠菌素水溶液约3L，调pH3后，乙酸乙酯萃取3次，得到萃取液3.6L，用30g活性炭脱色，再回收乙酸乙酯，得到棕色的浓缩萃取液约50mL，在常温下挥发使其结晶，分离出母液。粗结晶再用乙酸乙酯溶解、蒸发使其重新结晶，得到晶粉1.54g，晶粉经气谱-质谱联机检测和核磁共振检测，分子量与化学结构完全相符(见图3、4、5)，并测得相对纯度为94％，1.54g晶粉中纯冠菌素为1.45g，占总量的23.3％。留下不结晶的母液18mL，取0.1mL稀释500倍，高效液相色谱法测出浓度为187.6ug/mL，推算出18mL母液中含冠菌素1.69g，占总量27.2％，晶粉和母液中冠菌素相加，收率为50.5％。
实施例四生物测定是冠菌素的定性检测之一，也是将结晶和母液再进行确认。
一.土豆块法将冠菌素配制成10-15-10-21的溶液，涂于1cm3的小土豆块上，将涂有各种浓度的小土豆块，放置在25℃黑暗保湿的温箱中2-3天，取出检查，在涂有10-18-10-21浓度冠菌素的土豆块上，可以发现表面有增生的不规则突起，而不涂冠菌素只涂清水的小土豆块与浓度大于10-18的小土豆块，则仍保持原状或发生腐烂，表明冠菌素浓度大时有抑制作用，只有稀释到一定浓度后才具刺激生长作用(见图6)。
二.大豆苗法预先在花盆里种上大豆，待大豆出苗长到10cm左右高时，将配制出高于10-6浓度的冠菌素涂于略加檫伤的叶子上，或从叶脉处注射冠菌素溶液，让豆苗继续生长，一星期后可以发现涂过或注射过冠菌素溶液的豆苗，生长严重受阻，豆苗比对照(不涂冠菌素溶液的苗)明显矮化，叶面上还出现黄斑。证明冠菌素具有抑制生长作用(见图7)。
权利要求
1.一株生产高组分冠菌素的微生物菌株，它是丁香假单胞菌(Psendomonas syringae)Y-2018 CGMCC NO.1105菌株。
2.一种冠菌素的工业化生产方法，包括将权利要求1所述的菌株经斜面菌种培养，摇瓶种子培养及通气发酵，获得含有冠菌素的发酵液，经浓缩、萃取、层析得到提取液，使其结晶，重结晶，得到晶粉和不结晶的母液。
3.根据权利要求2所述的方法，其中斜面菌种培养的培养基为葡萄糖1g，牛肉浸膏0.3g，蛋白胨0.5g，琼脂1.5g，水100mL，pH7.4，121℃灭菌30分钟。
4.根据权利要求2所述的方法，其中斜面培养的温度为26～28℃。
5.根据权利要求2所述的方法，其中种子培养基成分为白砂糖1-2g，玉米浆2g，硫酸铵0.1g，酵母膏0.1g，磷酸氢二钾0.15g，硫酸镁0.08g，水100mL，pH7.4，121灭菌30分钟。
6.根据权利要求2所述的方法，其中摇瓶种子培养的温度为26-28℃。
7.根据权利要求2所述的方法，其中发酵培养基为不含有机氮培养基，配方白砂糖1.5-5.0g，氯化铵0.1-0.3g(或硫酸铵0.12-0.36g)，硝酸钾0.01-0.05g，磷酸氢二钾0.1-0.5g，磷酸二氢钾0.10-0.40g，水100mL，pH 7.0-7.6。
8.根据权利要求2所述的方法，其中发酵培养基为含有机氮培养基，配方为白砂糖1.5-4.5g，玉米浆2-5g，豆饼粉0.6-1.5g，硫酸铵0.04-0.2g(或氯化铵0.03-0.18g)，硝酸钾0.01-0.3g，磷酸氢二钾0.05-0.2g，水100mL，pH7.0-7.4。
9.根据权利要求2所述的方法，其中发酵培养时加入0.03～0.09％泡敌，培养温度26～28℃。
全文摘要
本发明提供一株新的能发酵产生高组分冠菌素的菌株，即丁香假单胞菌(Psendomonas syringae)Y－2018菌株，保藏号为CGMCC NO.1105，该菌株不需要低温培养，克服了野生菌株必需低温才能积累冠菌素的弱点。本发明还提供了一种工业化生产冠菌素的方法，包括将丁香假单胞菌Y－2018菌株经斜面菌种制备，摇瓶种子培养及通气发酵，获得含有冠菌素的发酵液，经浓缩、萃取、结晶、重结晶，得到晶粉和不结晶的母液。该方法可以使用有机氮培养基进行发酵，并且使用有机氮不仅使菌量增加，而且可以合成较多的冠菌素，从而克服了野生菌株不耐有机氮，有机氮抑制冠菌素积累的缺陷。
文档编号C12P1/04GK1570083SQ20041003769
公开日2005年1月26日 申请日期2004年4月29日 优先权日2004年4月29日
发明者蔡祝南 申请人:蔡祝南, 北京金贝尔生物工程研究所