一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器的制作方法

专利名称：一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术，特别是一种利用重组杆状病毒在昆虫体内高效表达外源基因，生产重组蛋白并提早有效表达时间的新型高效昆虫杆状病毒生物反应器。
背景技术：
现有的昆虫杆状病毒包括BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等，昆虫宿主包括家蚕(Bombyx mori)、野蚕(Bombyx mandarina)、蓖麻蚕(Philosamia cynthia ricim)、樟蚕(Dictyoplocajapanica)、樗蚕(Philosamia cynthia pryeri)、柞蚕(Antheraea pernyi)、日本柞蚕(Antheraea yamamai)、野天蚕(Antheraea polyphymus)、苜蓿尺蠖(Atographa califorica)、茶尺蠖(Ectropis obliqua)、甘兰夜蛾(Mamestrabrassicae)、斜纹夜蛾(Spodoptera littoralis)、秋粘虫(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、行军虫(Thaumetopoea wilkinsoni)、棉铃虫(Heliothis armigera)、美国棉铃虫(Heliothis zea)、烟青虫(Heliothis assulta)、烟草夜蛾(Heliothis virescens)、东方粘虫(Pseudaletia separata)、舞毒蛾(Lymantria dispar)等。
杆状病毒表达系统这一生物反应器是八十年代建立起来的。自从1983年首次利用杆状病毒表达系统高效表达了人的α-干扰素以来(Smith，Mol.CellBiol.，32156-2165，1983)，已有数十个外源基因得到了高效表达，仅我国就有α-干扰素(杨冠珍等，生物化学与生物物理学报，22355-361，1990)、慈菇蛋白酶抑制剂(季平等，蚕业科学，21223-227，1995)、马立克氏病毒糖蛋白B(肖庆利等，蚕业科学，23104-108，1997)等多种。昆虫杆状病毒表达载体系统是当今基因工程四大表达系统之一，相对于原核表达系统而言，杆状病毒表达系统是一种真核表达系统，具有真核蛋白翻译后加工、修饰和转运体系，表达产物在生物活性、抗原性和免疫原性方面接近天然产物。美国食品和药品管理局对杆状病毒表达系统的评价为“FDA认可杆状病毒表达系统生产的产品，它提供了新兴生物制药业的前景，尤其对于人类疾病治疗和疫苗的开发，改善人类的健康和提高数百万人的生活质量更是如此”(Patterson R M，Environ.Health Perspect，1995，103756～759)。利用此系统来生产重组蛋白的优点在于1.这一表达系统的表达效率极高，产量可达毫克级/虫的水平。因而可大大降低生产成本并使许多贵重的重组蛋白的大规模生产成为可能；2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使其在生化性质和生物活性等与天然产品相似，这为表达出的重组蛋白具有正常的生物学活性提供了保证。目前，杆状病毒表达系统，尤其是其中的家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统是世界上最具有商业开发价值的真核生物个体表达系统之一。
杆状病毒的DNA复制和基因表达是一个级联事体，后一时相的基因表达依赖前一时相基因的表达，其极早期基因的产物IE-1能反式调节迟早期、晚期、晚晚期基因的表达。杆状病毒极早期基因ie-1因其具有与真核生物相似的启动子元件，在病毒感染宿主后借助宿主细胞的转录翻译系统就能表达而不需相关病毒因子的参与(吕鸿声，昆虫病毒分子生物学，农业科技出版社，1998)。根据BmNPV和AcMNPV的ie-1基因启动子序列设计引物从BmNPVZJ-8株和AcMNPV C6株基因组中扩增该病毒株ie-1基因启动子。现在的杆状病毒表达系统所用的表达载体一般以多角体基因启动子启动外源基因表达，该晚期启动子活性虽强，但产物在寄主细胞被破坏的情况下难以修饰完善，而使用早期启动子可以使外源基因在病毒感染的极早期就得到表达，寄主细胞较少受病毒影响，表达产物可以得到很好的修饰。另外，用ie-1启动子还可构建成组成型的稳定表达载体(Jarvis DL，et al，Biotechnology(NY)，1990，8(10)950-955)。虽然ie-1启动子是杆状病毒极早期启动子中活性最强的一个，但它的活性相对于多角体基因启动子显然偏低。因此，寻找一种增强元件来增强ie-1启动子的转录活性从而使外源基因获得更加高效的表达是既具有理论价值又可在实际生产中具有广阔应用前景的途径。
在Autographa californica multinucleocapsid nucleopolyhedrovirus(AcMNPV)基因组中散在着8个同源重复区序列(Kool，M-，et al，J.Gen.Virology，742661-2668，1993)。家蚕BmNPV基因组内发现与AcMNPV相似的同源重复区(hr1、hr2L、hr2R、hr3、hr4L、hr4R及hr5)。家蚕BmNPV的hr各含平均长度75bp的同源核苷酸序列2～8个。所有这些同源重复序列都含有长30bp回文基序，在这基序核心有一个EcoRI或EcoRI类似的内切位点。BmNPV hrs的同感序列与AcMNPV具有95％的保守性。
BmNPV ZJ-8株hr3具有杆状病毒同源重复区的结构特点1.hr3含有3个72bp EcoRI微小片段，各个片段有30bp不完全回文序列，每个回文序列有2～3bp不对称碱基，以中心EcoRI位点计两侧底8位碱基必不对称；2.在回文序列的两侧对称位置还有一段可形成茎环结构的13bp保守序列TTTGAAAAACAAA，且该茎环结构和回文序列的相对位置亦十分保守；3.富含A+T达70％左右。BmNPV ZJ-8株hr3和AcMNPV同源序列可从30bp的回文序列扩展到两侧72bp，同源性达90％以上，并且回文序列的两侧对称位置以中心EcoRI位点计包括第8位在内的2～3bp不互补，另外hr3在同种不同株之间的差异主要表现在数量上，差异明显小于异种之间，这种结构上的保守性必定对应功能的特异性。
家蚕BmNPV hr3富含A+T和茎环结构都是DNA复制起始点的特征(张志芳等，中国科学(B).25(1995)949-955)。通过凝胶阻滞测定与足迹法分析发现在病毒感染过程中有病毒编码蛋白和病毒诱导蛋白与hr3特异性结合，这说明BmNPV ZJ-8株hr3在该病毒生命循环过程中扮演重要角色。Lu等报道BmNPV ZJ-8株hr3可以作为组成型增强子增强外源基因蚕蛾细胞质肌动蛋白基因的表达，mRNA分析表明这种增强作用表现在转录水平而不是复制水平，只在hr3和该基因的启动子顺式连接时具有增强子功能，在有BmIE-1作为反式激活因子的条件下可以增强外源基因蚕蛾细胞质肌动蛋白基因的表达量达1000倍左右(Lu M，et al，J Biol Chem.1997，272(49)30724-30728)。
本发明的内容本发明的目的是提供一种利用重组杆状病毒在昆虫体内高效表达外源基因，生产重组蛋白并提早有效表达时间的新型高效昆虫杆状病毒生物反应器。通过这种生物反应器的工作，可以大量、廉价地生产重组蛋白，以用于医药、食品、饲料、酶制剂等工农业生产中。
本发明的目的是按如下的技术方案实现的。本发明新型高效昆虫杆状病毒生物反应器，具有以下工作步骤(1)、将含有早期启动子、外源基因和增强子的表达盒的杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA进行重组；(2)、用重组病毒感染昆虫宿主和细胞；(3)、培养被感染的昆虫宿主或细胞使其进行重组蛋白的表达；收集含有重组蛋白的昆虫体或细胞；(4)、亦可利用所述的启动子、增强子组合经抗性筛选，直接在细胞中稳定表达。
所述的杆状病毒是下列的一种BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TeNPV。
所述的昆虫宿主是下列的一种家蚕、野蚕、蓖麻蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉粘虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫、或舞毒蛾；
所述的昆虫细胞是下列的一种Sf-9，Sf-21，Hi5，S2，Bm5，BmN，Tn细胞。
所述的昆虫宿主是家蚕，所述的细胞为昆虫细胞，所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒或AcMNPV。
所述的杆状病毒运载载体的早期启动子ie-1和病毒增强子的组合驱动外源基因的表达，两侧为病毒DNA的同源序列，用以进行同源重组获得表达用重组病毒。
其稳定表达为，将上述早期启动子ie-1和病毒增强子的组合驱动外源基因表达的表达盒构建于抗性基因的通用载体中，以在昆虫或昆虫细胞中进行稳定表达或瞬时表达。
所述的重组病毒是通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。所述的早期启动子是来源BmNPV或AcMNPV的ie-1启动子；所述的增强子是来源于BmNPV的同源重复区3(hr3)；所述的重组是指将外源基因转移到家蚕杆状病毒亲本株的基因组上，替代病毒基因组上的Polyhedrin基因，然后通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带外源基因的重组家蚕杆状病毒rBmNPV；所述感染是将得到的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹；在感染3-6天后收集含表达产物的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆。
含有早期启动子、外源基因和增强子的表达盒可提早以及提高外源基因在杆状病毒表达系统中的表达量，应用于杆状病毒基因工程杀虫剂中则可更快、更加有效地杀灭害虫，上述表达盒并可应用于转基因昆虫的外源基因表达。所述的载体含有上述早期启动子ie-1和病毒增强子的表达盒可用于昆虫细胞的外源基因稳定表达或瞬时表达。
本发明首先通过分别将BmNPV、AcMNPV的ie-1基因启动子控制下的荧光素酶基因克隆在hr3的上游，构建成瞬时表达报告质粒，在秋粘虫sf-21细胞系、家蚕Bm5、BmN细胞系以及家蚕五龄幼虫中瞬时表达和稳定表达，通过检测荧光素酶活性研究hr3对ie-1启动子的增强功能活性及其宿主特异性。结果显示在上述4种宿主中hr3能使同源的Bmie-1启动子控制下的外源基因分别增强1970、2421、683及1059倍；能使异源的Acie-1启动子控制下的外源基因分别增强6462、4046、6980及605倍。证实了hr3具有超强的增强子活性。在采用杆状病毒表达系统，应用昆虫幼虫及蛹作为生物反应器大规模生产重组蛋白的应用中，联合使用ie-1启动子及hr3增强子，在家蚕(Bm)-家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统中，通过同源重组，将外源基因重组进家蚕杆状病毒BmNPV，获得重组家蚕杆状病毒rBmNPV，使其在不同发育阶段的家蚕(幼虫、蛹等)中繁殖，在以家蚕作为宿主的生物反应器中生产重组蛋白，结果显示可使外源基因表达量提高32.37％，并可明显提早外源基因的表达。在同源重组所使用的杆状病毒转移载体中，可将连接好ie-1启动子和hr3增强子的外源基因构建到各种杆状病毒同源重组载体(如AcRP23-lacZ，AcRP6-SC，AcUW1-lacZ，BacPAK8，Bac to Pac，Bacmid，BlueBacII(pETL)，p2Bac，p2Blue，p89B310，pAc360、373，pAcAB3、4，pAcAS3，pAcC129、C4、DZ1，pAcGP67，pAcIE1，pAcJP1，pAcMLF2、7、8，pAcMP1、2，pAcRP23、25，pAcRW4，pAcsMAG，pAcUW1、21、2A、2B、3、31、41、42、43、51，pAcVC2、3，pAcYM1，pAcJcC5，pBac1、2，pBlueBacIII，pBlueBacHis，pEV55、mXIV，pIEINeo，pJVETL，pJVNhe1，pJVP10，pJVrsMAG，pMBac，pP10，pPAK1，pPBac，pSHONEX 1.1，pSYN XIV VI+，pSYNVI+wp，pSYNXIVVI-，pVL1391、1392、1393，pVL941、945、985，pVTBac，pBM030，pUAC-5)上。同样，利用别的杆状病毒表达系统，如AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TnNPV等也可按同样的方法表达生产重组蛋白。
本发明还提供一种联合使用ie-1启动子与hr3增强子，以在杆状病毒生物反应器中大幅提早并提高外源基因表达量。
综上所述，通过本发明，可以大量、廉价地生产重组蛋白，以用于医药、食品、饲料、酶制剂等工农业生产中。
附图(表)说明

图1为hr3增强子的核苷酸序列图，图2为瞬时表达报告质粒的构建图，表1为hr3对同源的BmNPV ie-1启动子的增强活性表，表2为hr3对异源的AcMNPV ie-1启动子的增强活性表，表3为两种不同表达策略对表达农药降解酶OPD效率比较表，表4为稳定表达细胞系的荧光素酶活力表。
实施例本实施例为利用重组杆状病毒在昆虫体内更加高效地表达外源基因，生产重组蛋白并提早有效表达时间的新型高效昆虫杆状病毒生物反应器。
本实施例所用材料如下1.菌株、病毒株与载体大肠杆菌株E.coli TG1和DH5α购自Promega公司；运载载体pVL1393、昆虫(家蚕)细胞BmN、家蚕核型多角体病毒亲本株BmNPV-ZJ8由中国科学院上海生化所吴祥甫研究员惠赠；家蚕品种JY1由中国农业科学院蚕业研究所农业部家蚕生物技术重点开放实验室保存。
2.酶与试剂限制性内切酶、连接酶为Invitrogen公司产品。
3.生化试剂IPTG、X-Gal、SDS为Sigma公司产品。Lipofectin、低融点琼脂糖LMP、PCR试剂盒、T4DNA连接酶、RNA酶、Proteinase K、细胞培养基TC-100、胎牛血清及其他试剂购于Invitrogen公司。
培养基大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)；家蚕细胞培养基为TC-100。
4.载体pUL220(含荧光素酶基因)(雷向东等，1993，1994)为中科院上海生化所吴祥甫先生惠赠。杆状病毒转移载体pVL1393-appA与pVL1393-opd均为本实验室保存。AppA是一种来源于大肠杆菌的新型高效植酸酶。Opd是一种来源于Pseudomonas sp.92的有机磷农药降解酶。pCI-Neo载体源于Promega公司。
本实施例所用常规基因克隆操作如下1酶切与连接反应酶切反应纯化后DNA用BamHI和EcoRI双酶切分析，反应总体积为50μl，其中纯化的PCR产物10μl，10×酶相应缓冲液5μl，两种酶各为1μl，无菌水补足体积。37℃反应2小时以上。将转移质粒pGEM-3Z作同样酶切反应。反应结束后于65℃灭活10分钟。
连接反应连接总体积15μl，PCR产物8μl，载体1μl，5×T4 DNA连接缓冲液3μl，T4 DNA连接酶1μl，无菌水补足体积，12～14℃连接过夜。
2.肠杆菌的遗传转化用75mM CaCl2制备大肠杆菌TG1感受态细胞。取步骤4中制备的连接混合物5μl，加到200μl感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30分钟，42℃热激2分钟，迅速置于冰上1～2分钟，加入已温育至37℃的LB培养基500μl，37℃培养1小时，取100～200μl涂布于含100μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。
3.质粒DNA的制备(1)从转化的LB平板上挑取单个菌落，接种于3ml含100μg/ml Amp的LB培养基中，37℃培养过夜。
(2)取1.5ml菌液于小离心管中，3500rpm离心4min，去上清。
(3)加入Solution I 150μl，混匀后置于冰上15min。
(4)加入Solution II 300μl，氯仿150μl，轻轻混匀后静置5min。
(5)加入Solution III 450μl，混匀后置于冰上15min。
(6)11000g离心10min，上清移入新管。
(7)加入异丙醇450μl，混匀后置于4℃ 15min。
(8)11000g离心6min，去上清。
(9)加入TER 250μl，混匀后置于37℃ 20min。
(10)加入PPt Buffer 300～350μl，混匀后静置15min。
(11)11000g离心6min，去上清。
(12)加入75％乙醇400μl。
11000g离心3min，倒掉乙醇，抽干后加入0.1×TE Buffer 40μl溶解，于-20℃保存。
本实施例具有以下工作步骤步骤(1)、将含有早期启动子、外源基因和增强子的表达盒的杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA进行重组；包括以下实验过程实验一、ie-1启动子的克隆1.游离病毒基因组DNA的制备取AcMNPV和BmNPV病毒感染的细胞上清或离心后的病蚕血淋巴150μL，加入150μL 0.5mol/L的NaOH溶液后混匀，室温下放置5min；再加入20μL 8mol/L的NH4Ac溶液，混匀后放置5min，用等体积的酚和氯仿分别抽提一次，酒精沉淀后用20μL 1×TE缓冲液溶解DNA。
2.据已报道的AcMNPV和BmNPV ie-1基因启动子序列设计两条引物，上游引物(F)5’TAGAATTCATCCCAACGGCGCAGTGTAC3’；下游引物(R)5’ATGGATC CAATAGTCGTTTGGTTCACG 3’。由上海生物工程公司合成。
3.用方法1中制备的病毒基因组DNA作为模板进行PCR反应，扩增ie-1启动子序列。PCR反应体系如下

PCR反应过程94℃变性10分钟；94℃ 1分钟，56℃ 1分钟，72℃ 1分钟，共28个循环。最后延伸反应5分钟。
4.将PCR扩增的ie-1启动子序列产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出约360bp的片段。在紫外灯下用灭菌手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用Geneclean试剂盒进行纯化。方法如下切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5ml小离心管中，加入3倍(v/w)体积的6M NaI，37℃将凝胶溶解后，加入10μl玻璃奶(Glass milk)，混匀后室温下放置5分钟，使DNA充分吸附在玻璃奶上，12,000rpm离心5秒钟，再用New Wash溶液洗三次，每次均将沉淀弹起，并离心。最后将沉淀晾干后加入30μl 0.1×TE Buffer溶解DNA，离心后取上清。
5.以BamHI和EcoRI双酶切纯化后的PCR产物，同时以BamHI和EcoRI双酶切pGEM-3Z载体。灭活后将ie-1启动子片段与酶切后的载体用T4 DNA连接酶过夜连接。转化感受态大肠杆菌TG1后挑取单菌落在液体LB培养基中培养，抽提质粒DNA通过酶切与PCR两种方法以鉴定重组子。将鉴定正确的重组子命名为pBmIE-1和pAcIE-1。
实验二、增强子hr3的克隆1.从BmNPV基因组中用SmaI分离出25kb的片段，2.用PstI酶解得到PstIK片段，12.5kb的PstID片段，5.3kb和2.0kb的片段(两端应为SmaI和PstI末端)，3.用经PstI酶切的pUC19载体从中克隆出PstIK片段，得到重组质粒pBhr3，4.将PstIK片段用DraI酶切，所得的DraI片段即为含有hr3的651bp序列，将次片段克隆进pUC19的SmaI位点。
5.测序证实已正确克隆出具有3个EcoRI位点的hr3增强子序列。hr3的核苷酸序列如图1所示。
6.将pUC19中的hr3克隆进pSK载体中。
实验三、报告质粒的构建1.由BamHI将Luciferase基因约1.8Kb从pUL220中亚克隆到实验一所得的pBmIE-1和质粒的ie-1启动子的下游，命名为pBmIE-1Luc和pAcIE-1Luc。
2.以pBmIE-1Luc或pAcIE-1Luc为模板，可用扩增ie-1启动子的引物扩增出360bp左右的片段。用XbaI酶解pBmIE-1Luc或pAcIE-1Luc电泳分析时可见3Kb左右和1.8Kb左右的两条片段，以确证基因插入方向，证明Luciferase处于ie-1启动子控制下。
3.用XbaI/HindIII酶切位点将原克隆在pSK-hr3中的hr3序列约0.7Kb亚克隆到pBmIE-1和pAcIE-1，命名为pBmIE-1hr3和pAcIE-1hr3。
4.以BamHI位点将Luciferase基因亚克隆到pBmIE-1hr3和pAcIE-1hr3，构建成pBmIE-1Luchr3和pAcIE-1Luchr3载体。此载体用XbaI/HindIII进行酶解电泳分析可见3.0Kb、1.8Kb、0.7Kb三条带，证明hr3序列处于Luciferase基因下游，pBmIE-1Luchr3和pAcIE-1Luchr3构建成功。pBmIE-1Luchr3和pAcIE-1Luchr3示意简图如图2所示。
实验四、报告质粒在昆虫细胞系及家蚕幼虫中的瞬时表达1.接种106细胞于15cm2培养瓶中，贴壁培养过夜。
2.除去含FBS的培养基，用不含FBS的培养基洗细胞三次，加1.5mL无FBS培养基。
3.在100μL反应体系中加入2μg质粒DNA和适量的Lipofectin，轻轻混匀，静置15min。在昆虫细胞中瞬时表达时将此100μL液体逐滴加入培养瓶中，边滴边摇匀；若在家蚕活体中进行瞬时表达分析，则将此100μL液体以20μL/头的量注射入家蚕体内，继续饲养48h后取家蚕血淋巴。
4.4h后倾去原无FBS培养基，补加3mL含FBS培养基。27℃培养48h。
5.转染48h后，冰上收集细胞或家蚕血淋巴，转移到1.5mL离心管中，4℃以12000r/min离心5min6.去上清，沉淀用冰冷的1×PBS洗涤后，加入500～1000μL裂解缓冲液(Promega公司产品，型号为E4030)冻融一次充分裂解细胞7.离心后取上清测定荧光素酶活力。取15μL荧光素酶分析试剂于测定管中，将制备的细胞抽提物，根据要求用原液或用细胞裂解液作适当稀释后，取一定体积放入上述测定管中，用Tip头快速抽吸2～3次使之混匀，置于液体闪烁仪中测定CPM值，测定温度为25℃，荧光素酶活力以15s内的光亮子数表示(Idahl LA，et al，Anal Biochem，1986，155177-181)。
8.为避免因宿主细胞数量差异而导致的Luciferase表达量的偏差，本实验在尽量保持细胞状态一致的基础上用细胞裂解液上清的总蛋白含量进行校正。将牛血清白蛋白配制成标准浓度蛋白质(0.5mg/mL)，用酶标仪对细胞抽提物进行蛋白质定量。
重组报告质粒pBmIE-1Luc和pBmIE-1Luchr3以及pAcIE-1Luc和pAcIE-1Luchr3在家蚕BmN细胞系、家蚕Bm5细胞系、秋粘虫sf-21细胞系以及五龄幼虫中均有瞬时表达，而且结果显示hr3能显著增强ie-1启动子的活性，具体结果如表1、2所示。
步骤(2)、用重组病毒感染昆虫宿主和细胞；包括以下实验过程实验五、杆状病毒表达转移载体以及重组病毒的构建5.1用于表达广适性、高比活appA植酸酶的转移载体构建5.1.1将pBmIE-1中的ie-1启动子以BamHI和EcoRI双酶切纯化后连接同样双酶切的pKS载体中，得到pKSBmIE-15.1.2以BamHI和EcoRV双酶切pKSBmIE-1纯化后连接到同样双酶切的带有appA基因的杆状病毒转移载体pVL1393-appA中得到质粒载体pVL1393-ie1-appA5.1.3将pUC19中的hr3通过公用酶切位点酶切、补平后转入pKS后可用PstI切出hr3片段5.1.4将hr3通过PstI切出纯化后接入pVL1393-ie1-appA的PstI位点中，通过EcoRI酶切鉴定hr3的方向后得到正向接入hr3的杆状病毒转移载体pVL1393-ie1-appA-hr3，命名为pie1-appA-hr35.2用于表达有机磷农药降解酶的转移载体构建5.2.1以BamHI和EcoRV双酶切pKSBmIE-1纯化后连接到同样双酶切的pBacPAK8中，以ie-1启动子替代原多角体启动子得到pBacPAK8-ie15.2.2以BamHI和XhoI双酶切pBacPAK8-ie1，将所分离、纯化的opd片段克隆入同样双酶切的pVL1393-opd中，得到pBacPAK8-ie1-opd5.2.3将hr3以XhoI+XbaI切出并分离、纯化后接入同样双酶切的pBacPAK8-ie1-opd中，得到杆状病毒转移载体pBacPAK8-ie1-opd-hr3，并命名为pie1-opd-hr35.3用于表达appA植酸酶和有机磷农药降解酶的转移载体构建5.3.1家蚕核多角体野生病毒和BmBacPAK6的繁殖及病毒DNA的制备按Invitrogen公司产品说明配制1×TC-100培养基，用2N NaOH将pH调至6.22，过滤除菌后的培养基补加10％胎牛血清，27℃下培养家蚕细胞Bm-5。用家蚕核多角体病毒亲本株BmNPV-ZJ8感染对数生长期的细胞约50ml，感染复数为1，3～4天后收集病毒感染液，离心(5000rpm×10min)，除去沉淀，上清用25000rpm离心1小时，除上清，用1ml病毒DNA抽提液(1000ml中含Tris 12.1g，EDTA 33.6g，KCl 14.1g，pH7.5)悬浮病毒粒子沉淀，转移至1.5ml离心管中，加入蛋白酶K至终浓度为50μg/ml，50℃保温2小时，再加入35％的Sarkorsel至终浓度为1％，继续于50℃保温2小时，分别用等体积的苯酚、苯酚∶氯仿(1∶1)氯仿依次抽提，将上层水相转移到一个新管中，加入1/10体积的3M NaCl，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置2小时以上沉淀病毒DNA，5000rpm离心10分钟，沉淀用75％乙醇洗一次，冷冻干燥。溶解在100μl TE Buffer中，放4℃保存备用。
5.3.2共转染接种大约1×106细胞于15cm2培养瓶中，细胞贴壁后，除去含胎牛血清(FBS)培养基，用不含FBS的培养基洗三次，加1.5ml无FBS培养基。向灭菌管中依次加入1μg野生家蚕杆状病毒或线形化的亲本病毒DNA，2μg重组转移质粒pie1-appA-hr3或pie1-opd-hr3 DNA和5μl脂质体，用无菌双蒸水补足体积到60μl，轻轻混匀，静置15分钟后，逐滴加入到培养瓶中进行共转染。27℃培养4小时后补加1.5ml无血清培养基和300μl FBS。27℃恒温培养4～5天，收集上清液用于重组病毒的筛选。
5.3.2重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ie1-appA-hr3或ie1-opd-hr3)的筛选和纯化接种适量细胞(约70～80％)于35mm小平皿中，细胞贴壁后，吸去培养基，将共转染上清进行不同浓度稀释，取1ml共转染液加到贴壁细胞中，分布均匀。27℃感染1小时后，吸去感染液，将2％低融点琼脂糖凝胶于60℃水浴中融化，冷至40℃与40℃预热的2×TC-100培养基(含20％FBS)混合均匀，每平皿加4ml胶，待凝固后用Parafilm封口，27℃倒置培养3～5天，显微镜观察。将不含有多角体的空斑挑选出来，重复以上步骤，经过2～3轮的纯化获得纯的重组家蚕杆状病毒rBmNPV。
5.3.3重组病毒rBmNPV在家蚕细胞中的扩增将重组家蚕杆状病毒rBmNPV(ie1-appA-hr3或ie1-opd-hr3)感染正常生长的BmN细胞，培养3天后收集上清液，上清液中即含有大量的重组病毒rBmNPV。
步骤(3)、培养被感染的昆虫宿主或细胞使其进行重组蛋白的表达；收集含有重组蛋白的昆虫体或细胞；包括以下实验过程实验六、appA和opd基因在家蚕中的表达本实验所用的家蚕高表达品种为JY1(由本实验室保存)。JY1品种家蚕饲养按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行。五龄饷食后24h选择平均体重相同的15头家蚕为一组，每头蚕接种约1.0×105rBmNPV，即5μl接种液中含2.0×107pfu/ml的rBmNPV(ie1-appA-hr3或ie1-opd-hr3)，分别以多角体启动子控制下的含有appA和opd基因的重组病毒感染家蚕幼虫作为实验对照。在病毒感染后分别按24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h时取血样并测定appA或opd酶活力，重复三次。108h时每ml蚕血淋巴appA酶活力达到8340.50单位，比常规的以极晚期启动子控制下的表达量高36.63％。Opd酶的表达时相结果由表3所示，从感染病毒36h开始，开始表达，随着时间的增加，所表达的酶活也随之增加，在病毒感染后108小时达最高，每ml蚕血淋巴opd酶活力达90423.55单位。采用以ie1-opd-hr3表达盒进行外源基因表达策略时，外源基因的表达量比常规的以极晚期启动子控制下的表达量高32.37％。
步骤(4)、亦可利用所述的启动子、增强子组合经抗性筛选，直接在细胞中稳定表达，包括以下实验过程。
实验七、ie-1-hr3表达盒的稳定表达实验将Neo选择标记由BamHI-NotI酶解从pCI-Neo中获得，将上述pBmie-1-luc-hr3、pAcie-1-luc-hr3报告质粒用NotI等酶解，通过连接补平后连接的克隆策略，获得可用抗生素G418筛选的稳定表达载体pBmie-1-luc-hr3-Neo、pAcie-1-luc-hr3-Neo。
将上述两稳定表达的报告质粒用前述方法分别转染Sf和Bm细胞，并通过由G418浓度从低到高的三轮筛选获得稳定表达的细胞系，裂解抗性细胞，测定细胞裂解液中的光量子数，结果列于表4。
权利要求
1.一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器，具有以下工作步骤(1)、将含有早期启动子、外源基因和增强子的表达盒的杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA进行重组；(2)、用重组病毒感染昆虫宿主和细胞；(3)、培养被感染的昆虫宿主或细胞使其进行重组蛋白的表达；收集含有重组蛋白的昆虫体或细胞；(4)、亦可利用所述的启动子、增强子组合经抗性筛选，直接在细胞中稳定表达。
2.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述的杆状病毒是下列的一种BmNPV、AcMNPV、ApNPV、BsSNPV、CfMNPV、EoSNPV、HaNPV、HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、SlMNPV、SeMNPV、TeNPV。
3.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述的昆虫宿主是下列的一种家蚕、野蚕、蓖麻蚕、樟蚕、樗蚕、柞蚕、日本柞蚕、野天蚕、苜蓿尺蠖、茶尺蠖、甘兰夜蛾、秋粘虫、粉纹夜蛾、行军虫、棉铃虫、美国棉粘虫、烟青虫、烟草夜蛾、东方粘虫、或舞毒蛾；所述的昆虫细胞是下列的一种Sf-9，Sf-21，Hi5，S2，Bm5，BmN，Tn细胞。
4.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述的昆虫宿主是家蚕，所述的细胞为昆虫细胞，所述的杆状病毒是家蚕杆状病毒或AcMNPV。
5.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述的杆状病毒运载载体的早期启动子ie-1和病毒增强子的组合驱动外源基因的表达，两侧为病毒DNA的同源序列，用以进行同源重组获得表达用重组病毒。
6.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于其稳定表达为，将上述早期启动子ie-1和病毒增强子的组合驱动外源基因表达的表达盒构建于抗性基因的通用载体中，以在昆虫或昆虫细胞中进行稳定表达或瞬时表达。
7.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于，所述的重组病毒是通过口食或透过表皮来感染1-5龄的昆虫幼虫或蛹体。
8.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于所述的早期启动子是来源BmNPV或AcMNPV的ie-1启动子；所述的增强子是来源于BmNPV的同源重复区3(hr3)；所述的重组是指将外源基因转移到家蚕杆状病毒亲本株的基因组上，替代病毒基因组上的Polyhedrin基因，然后通过空斑筛选技术和PCR检测技术，获得携带外源基因的重组家蚕杆状病毒rBmNPV；所述感染是将得到的重组家蚕杆状病毒感染家蚕细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫或蛹；在感染3-6天后收集含表达产物的家蚕幼虫或蛹的体液或组织匀浆。
9.按照权利要求1所述的生物反应器，其特征在于含有早期启动子、外源基因和增强子的表达盒可提早以及提高外源基因在杆状病毒表达系统中的表达量，应用于杆状病毒基因工程杀虫剂中则可更快、更加有效地杀灭害虫，上述表达盒并可应用于转基因昆虫的外源基因表达。
10.按照权利要求6所述的生物反应器，其特征在于所述的载体含有上述早期启动子ie-1和病毒增强子的表达盒可用于昆虫细胞的外源基因稳定表达或瞬时表达。
全文摘要
本发明是一种新型高效昆虫杆状病毒生物反应器，具有以下工作步骤(1)将含有早期启动子、外源基因和增强子的表达盒的杆状病毒转移载体与杆状病毒DNA进行重组；(2)用重组病毒感染昆虫宿主和细胞；(3)培养被感染的昆虫宿主或细胞使其进行重组蛋白的表达；收集含有重组蛋白的昆虫体或细胞；(4)亦可利用所述的启动子、增强子组合经抗性筛选，直接在细胞中稳定表达。通过本发明生物反应器可以大量、廉价地生产重组蛋白以用于医药、食品、饲料、酶制剂等工农业生产中。
文档编号C12N15/866GK1696294SQ200410037750
公开日2005年11月16日 申请日期2004年5月11日 优先权日2004年5月11日
发明者张志芳, 陈寅, 沈桂芳 申请人:中国农业科学院生物技术研究所