专利名称：鼠源epor胞外区与人源nok胞内区嵌合受体及编码基因与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及编码基因与应用，特别涉及一种鼠源EPOR(红细胞生成素受体)胞外区与人源NOK(带激酶功能域的新型癌基因)胞内区嵌合受体及编码基因与可表达该受体的细胞系。
背景技术：
蛋白酪氨酸激酶受体(PTKR)在各种细胞调控水平及肌体不同发育阶段中起着重要作用，比如参与细胞的增殖、分化及抗凋亡等过程。典型的PTKR结构表现为细胞脂质双分子层上的单跨膜蛋白，分为胞外区、跨膜区及胞内区。胞外区具有相应配体的特异性识别位点，在结合配体过程中起重要作用。胞内区含有酪氨酸激酶功能域，参与胞内的信号转导及受体、衔接蛋白的磷酸化过程，特别是有丝分裂原的信号转导。PTKR在细胞内的异常表达常会导致遗传疾病及肿瘤。因此，PTKR蛋白的表达在肌体内受到严格调控。目前为止，至少有18种PTKR与肿瘤转化有关，可作为癌基因。重要的实例包括成纤维生长因子受体(FGFR)、表皮生长因子受体(EGFR)、血小板来源的生长因子受体(PDGFR)、胰岛素受体(InsR)和肝细胞生长因子受体(Met)等。
研究显示部分PTKR异常剪接变异体与肿瘤的发生相关。比如从人骨肉瘤及乳腺癌细胞可分离到缺少全部跨膜区的可溶性FGFR3分子。而在胃癌细胞中，一种符合蛋白编码的49氨基酸的缺失可导致Ron酪氨酸受体的组成性激活。最近从脑垂体肿瘤中人们分离到一种新型FGFR4剪接变异体，被称做ptd-FGFR4。这种剪接变异体缺少几乎全部的FGFR4受体胞外区，并且不包含信号肽，导致该成熟蛋白仅在胞浆表达。过量表达ptd-FGFR4可导致细胞转化。通过转基因方式在小鼠体内进行组织特异性表达可形成垂体瘤。另外，利用N端和C端特异性抗体，人们发现部分恶性肌骨骼瘤临床病人样品中也有N端缺失的Met受体表达。
红细胞生成素(EPO)及其受体(EPOR)在正常的骨髓红系祖细胞的增殖与分化过程中起关键作用。EPOR是一个典型的I类细胞因子受体超家族成员。这类分子胞外区的氨基端通常有四个半胱氨酸残基，而胞外区的的羧基端近跨膜区位置通常有一个色氨酸-丝氨酸-X-色氨酸-丝氨酸基序(WSXWS motif)。该基序在特异性配体识别过程中起重要作用。该类受体胞内区近跨膜区常有保守的脯氨酸富含功能域，简称为Box1，而远跨膜区位置常有不保守的Box2功能域。EPOR的活化通常需要形成同源二聚体，并通过Boxl和Box2激活胞浆内的衔接蛋白如JAK2等，使STAT5等转录因子磷酸化，作用于靶基因启动子从而调控下游基因的表达。目前，人们在研究新型细胞因子受体的功能过程中，常把EPOR的胞外区与新型受体的胞内区进行融合。该嵌合受体的优势在于可以利用EPO配体及其受体的特异性作用来研究未知受体胞内的功能，特别是嵌合受体的活化可以激活哪些胞内信号通路。
发明创造内容本发明的目的是提供一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及其编码基因。
鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体名称为EPOR/NOK，它是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID№2衍生的蛋白质。
序列表中SEQ ID №2的蛋白质由650个氨基酸残基组成。在实际应用中，为了便于检测，其羧基端还带有FLAG标签，该带FLAG标签的EPOR/NOK的氨基酸序列如序列表中的序列4所示，序列4由658个氨基酸残基组成，自氨基端第651位-658位氨基酸残基为FLAG标签。
鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体EPOR/NOK编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
序列表中的SEQ ID №1由1953个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端第1位-1953位碱基；自5′端第1位-750位碱基为鼠源EPOR胞外区编码序列；自5′端第751位-758位碱基为外源NotI酶切位点；自5′端第759位-1950位碱基为NOK基因跨膜区和胞内区的编码序列。
其中，人源带激酶功能域的新型癌基因NOK基因(NovelOncogene withKinase-domain，NOK)是由本发明人克隆得到的新基因，它是具有序列表中序列5所示的DNA序列。序列5由1269个碱基组成，其开放阅读框架为自5′端第1位-1269位碱基。
在实际应用中，为了便于检测，在其3′端还带有FLAG标签的编码基因，该带FLAG标签的编码基因的核苷酸序列如序列表中的序列3所示，序列3由1977个碱基组成，自5′端第1951位-1977位碱基为FLAG标签的编码基因。
含有鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体EPOR/NOK编码基因的载体和细胞系，如pcDNA3(EPOR/NOK-H)和于2004年5月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)、保藏号为CGMCC №1144的BaF3-EPOR/NOK细胞系，均属于本发明的保护范围。
实验证明，EPOR/NOK基因在BaF3细胞稳定表达导致该细胞发生转化，使BaF3细胞由白细胞介素3(IL-3)依赖性转化为非依赖性；EPOR/NOK稳定表达细胞系BaF3-EPOR/NOK皮下接种裸鼠后，可导致接种部位肿瘤生成及远处脏器转移，表现为恶性肿瘤特点。BaF3-EPOR/NOK接种裸鼠可作为研究肿瘤发生与转移机制，以及筛选抗肿瘤生成与转移药物的模型动物。BaF3-EPOR/NOK可作为细胞水平的模型工具用于筛选抗肿瘤生成与转移药物，将在抗肿瘤药物筛选及抗肿瘤药物的药效检测中发挥重要作用。
图1为从扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR扩增得到的NOK基因产物图2为DAS跨膜区预测软件分析EPOR/NOK嵌合受体图3为EPOR/NOK蛋白酪氨酸激酶功能域分析结果图4为用鼠源FLAG抗体检测BaF3-p3及BaF3-EPOR/NOK稳定细胞中EPOR/NOK蛋白的表达图5为在饥饿条件下BaF3-EPOR/NOK的增殖曲线图6为BaF3-EPOR/NOK细胞在没有血清及WEHI-3B的半固体培养基中形成集落的照片图7为BaF3-EPOR/NOK皮下接种裸鼠成瘤照片图8BaF3-EPOR/NOK皮下接种裸鼠后，肿瘤细胞远处脏器转移的HE染色结果示意图具体实施方式
实施例1、EPOR/NOK编码基因的获得用引物5′-TATAGCGATATCATGGACAAACTCAGGGTGCC-3′和5′-TATAGCGCGGCCGCGAGAGGGTCCAGGTCGCTA-3′，以pMX-EPOR(pBabe-EPO-R)为模板(PNAS，Vol.93，p8324-8328，August 1996)，在如下的反应体系50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液，200μmol/L每种dNTP，1单位高保真Taq酶；循环程序下94℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟延伸，扩增鼠红细胞生成素受体(EPOR)胞外区，将得到的片段利用EcoRV和NotI亚克隆到pcDNA3(购自Invitrogen公司)的EcoRV和NotI位点之间，得到质粒pcDNA3(EPOR)。
NOK全长cDNA从人扁桃体肿瘤总RNA中经RT-PCR获得，具体步骤如下按常规方法提取人扁桃体肿瘤总RNA，然后以5′-TATAAAGCTTATGGGCATGATGACACGGATGCT-3′和5′-TATACTCGAGTCAGGCGTAGTCGGGCACGTCGTAGGGGTAAAGCATGCTATAGTTGTA-3′为引物(下划线为HA表达标签)，反应条件按照一步法RT-PCR的使用说明进行(Takara)，得到的PCR产物(图1)纯化后直接亚克隆到T载体(购自Promega公司)，酶切鉴定后再进行测序。将测序过的RT-PCR产物经HindIII和XhoI双酶切后亚克隆到pcDNA3(购自Invitrogen公司)上，构成pcDNA3(NOK-H)表达质粒。
以引物5′-TATAGCGGCCGCAGTGATTATCGTCCCAACTTT-3′和5′-TATACCAGTGTGCTGGTCACTTGTCA TCGTCGTCCTTGTAGTCAAGCATGCTATAGTTGTAGA-3′以pcDNA3(NOK-H)为模板，在如下的反应体系50ng模板DNA，100pmol每种引物，1×扩增缓冲液，200μmol/L每种dNTP，1单位高保真Taq酶；和循环程序下94℃5分钟，94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟，35个循环，72℃10分钟延伸，扩增人NOK-H跨膜区及胞内区，将得到的片段利用NotI和BstXI亚克隆到pcDNA3(EPOR)的NotI和BstXI位点之间，筛选得到完整的融合基因表达载体pcDNA3(EPOR/NOK-H)，测序表明该融合基因具有序列表中序列1的核苷酸序列。该融合基因C末端携带FLAG标签(序列表中序列3)，可被鼠M2抗体识别。
EPOR/NOK是具有序列表中序列2的氨基酸残基序列的蛋白质，DAS跨膜预测软件分析EPOR/NOK是单一跨膜分子，跨膜区位于自氨基端第249-277氨基酸残基(图2)。EPOR/NOK具有典型的酪氨酸激酶功能域(自氨基端第333-600氨基酸残基)(图3)实施例2、BaF3-EPOR/NOK稳定细胞系的构建离心收取1×106野生型BaF3细胞，重悬于0.5ml无血清RPMI-1640培养液。将3μg实施例1中得到的pcDNA3(EPOR/NOK-H)与BaF3细胞混合，冰浴10分钟后，用ECM399(BTX公司)电转仪进行电转。电转条件为200-230V，电流为25-35毫秒。电转染后的细胞在RPMI-1640全培养基中生长。在G418的筛选下获得稳定外源基因的表达。由于质粒pcDNA3携带新酶素抗性基因，稳定细胞在500μg/ml G418下进行筛选。每三天换一次液，连续培养三周后，在100mm培养皿中进行扩增，得到细胞系BaF3-EPOR/NOK CGMCC №1144。
实施例3、检测BaF3-EPOR/NOK稳定细胞系EPOR/NOK基因的表达由于EPOR/NOK基因的羧基端融合了一个FLAG标签，阳性细胞克隆可通过蛋白印记杂交(Western Blot)进行检测。等蛋白量的BaF3-EPOR/NOK及BaF3-P3(pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3)对照的细胞裂解液经10％SDS/PAGE分离后转到硝酸纤维素膜上。以鼠源抗FLAG标签的单克隆抗体(Santa Cruz Biotechnology)为一抗进行杂交，以荧光素标记的羊源抗鼠抗体(Amersham Biosciences UK Limited)为二抗，最后用ECL化学发光的底物进行杂交信号放大，结果如图4所示，表明细胞系BaF3-EPOR/NOK有特异性EPOR/NOK蛋白表达，分子量约为68kD。
实施例4、EPOR/NOK基因使BaF3细胞由白细胞介素3(IL-3)依赖性转化为非依赖性BaF3细胞为小鼠前B细胞，需要有白细胞介素3的刺激下才能增殖。在没有血清及没有WEHI-3B的RPMI-1640(掺入的3H胸腺嘧啶脱氧核苷)培养液中在37℃培养3天，[3H]掺入检测细胞增殖结果如图5所示，表明在没有血清及没有WEHI-3B的RPMI-1640培养液中，BaF3-EPOR/NOK可显著增殖3天以上，而BaF3-P3(pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3)对照由于需要IL-3的刺激，因而细胞几乎没有增殖。说明在BaF3细胞中稳定表达EPOR/NOK基因，可以使BaF3-EPOR/NOK在没有WEHI-3B条件培养液(提供IL-3)的情况下也可以增殖。
实施例5、BaF3-EPOR/NOK在‘饥饿’培养条件下具有锚定非依赖增长的特性稳定细胞在半固体培养基中的生长是检测细胞转化特性的依据之一。将BaF3-EPOR/NOK细胞以1×105个细胞/ml培养基的浓度悬浮在60mm培养皿盛装的0.4％琼脂糖培养基中，铺在0.8％的琼脂糖培养基之上。琼脂糖培养基用RPMI-1640培养液制备，其中含有5％FBS及400μg/ml G418。以pcDNA3.0空载体稳定转染的BaF3(BaF3-p3)为阴性对照。在没有血清及没有WEHI-3B上清的条件下，置于含5％二氧化碳的37℃孵箱中培养。三周后，用倒置显微镜计算直径大于0.1mm的细胞集落数，结果如图6所示，表明BaF3-EPOR/NOK在‘饥饿’培养条件下有明显的集落生成。统计结果如表1所示，表明在BaF3细胞中稳定表达EPOR/NOK，可使BaF3细胞的增殖特性发生改变，具有肿瘤细胞的特点。
表1、BaF3稳定细胞系在半固体琼脂糖培养基中的集落生成试验BaF3细胞系细胞数集落数(标准差)BaF3-p3 1×1050(0)BaF3-EPOR/NOK 1×105102(10)注集落数为三次平行实验的平均值±标准差实施例6、BaF3-EPOR/NOK细胞具有肿瘤生成特性，皮下接种裸鼠可导致恶性肿瘤生成体内成瘤实验的具体步骤是，将1×107BaF3-EPOR/NOK稳定细胞系皮下注射4-6周去胸腺Balb-c裸鼠，注射部位是裸鼠右前臂腋下皮肤。以稳定表达pcDNA3.0空载体的BaF3细胞(BaF3-p3)为阴性对照。每一种细胞注射六只裸鼠。每一实验组包括三只雌鼠(F1、F2、F3)及三只雄鼠(M1、M2、M3)。注射BaF3-EPOR/NOK细胞7-10天后可见接种部位皮下有明显肿瘤形成(图7)。对照组与试验组接种三周后的成瘤情况如图7所示。接种BaF3-EPOR/NOK细胞一个月后小鼠全身出现衰竭，行动迟缓，35-40天死亡。BaF3-EPOR/NOK细胞在裸鼠体内呈现恶性肿瘤生长趋势，在注射部位骨骼肌成侵润性生长，肝脏及脾脏明显增大，并导致远处脏器如肝脏、脾脏、肾脏和肺脏转移(图8及表2)。图8中，箭头指示为肿瘤转移灶。
表2、BaF3-NOK在裸鼠肿瘤生成情况
a代表裸鼠的平均值±标准差序列表<160>5<210>1<211>1953<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1atggacaaac tcagggtgcc cctctggcct cgggtaggcc ccctctgtct cctacttgct 60ggggcagcct gggcaccttc acccagcctc ccggacccca agtttgagag caaagcggcc 120ctgctggcat cccggggctc cgaagaactt ctgtgcttca cccaacgctt ggaagacttg 180gtgtgtttct gggaggaagc ggcgagctcc gggatggact tcaactacag cttctcatac 240cagctcgagg gtgagtcacg aaagtcatgt agcctgcacc aggctcccac cgtccgcggc 300tccgtgcgtt tctggtgttc actgccaaca gcggacacat cgagttttgt gccgctggag 360ctgcaggtga cggaggcgtc cggttctcct cgctatcacc gcatcatcca tatcaatgaa 420gtagtgctcc tggacgcccc cgcggggctg ctggcgcgcc gggcagaaga gggcagccac 480gtggtgctgc gctggctgcc acctcctgga gcacctatga ccacccacat ccgatatgaa 540gtggacgtgt cggcaggcaa ccgggcagga gggacacaaa gggtggaggt cctggaaggc 600cgcactgagt gtgttctgag caacctgcgg ggcgggacgc gctacacctt cgctgttcga 660gcgcgcatgg ccgagccgag cttcagcgga ttctggagtg cctggtctga gcccgcgtca 720ctactgaccg ctagcgacct ggaccctctc gcggccgcag tgattatcgt cccaactttg 780ttggttacta tcttcctcat ccttcttggg gtcatcctgt ggctttttat cagagaacaa 840agaactcaac agcagcgttc tggacctcaa ggcattgccc ctgttcctcc acctagggac 900ctaagctggg aagcaggaca tggaggaaat gtggctttgc cacttaagga gacatccgtg 960gaaaactttc tgggagctac cacacctgcc ctggctaagc tgcaggtgcc gcgggagcaa 1020ctctctgaag ttctggagca gatttgcagc ggtagctgtg ggcccatctt tcgagccaat 1080atgaacactg gggacccttc taagcccaag agtgttattc tcaaggcttt aaaagaacca 1140gctgggctcc atgaggtaca agatttctta gggcgaatcc aattccatca atacctgggg 1200aaacacaaaa acctggtgca gctggaaggc tgctgcactg aaaagctgcc actctatgtg 1260gtgttggagg atgtggccca gggggacctg cttagctttc tctggacctg tcggcgggat 1320gtgatgacta tggatggtct tctctatgat ctcacagaaa aacaagtata tcacatcgga 1380aagcaggtcc ttttggcgct ggaattcctg caggagaagc atttgttcca tggggatgtg 1440gcagccagga atattctgat gcaaagtgat ctcactgcta agctctgtgg attaggcctg 1500gcttatgaag tttacacccg aggggccatc tcctctactc aaaccatacc tctcaagtgg 1560
cttgccccag aacggcttct cctgagacct gctcgcatca gagcagatgt ctggtctttt 1620gggatcctgc tctatgagat ggtgactcta ggagcaccac cgtatcctga agtccctcct 1680accagcatcc tagagcatct ccaaagaagg aaaatcatga agagacccag tagctgcaca 1740cataccatgt acagtatcat gaagtcctgc tggcgctggc gtgaggctga ccgcccctca 1800cctagagagc tgcgcttgcg cctagaagct gccattaaaa ctgcagatga cgaggctgtg 1860ttacaagtac cagagttggt ggtacctgaa ctgtatgcag ctgtggccgg catcagagtg 1920gagagcctct tctacaacta tagcatgctt tga 1953<210>2<211>650<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>
<400>2Met Asp Lys Leu Arg Val Pro Leu Trp Pro Arg Val Gly Pro Leu Cys1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asp20 25 30Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu35 40 45Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp50 55 60Glu Glu Ala Ala Ser Ser Gly Met Asp Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr65 70 75 80Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Ser Leu His Gln Ala Pro85 90 95Thr Val Arg Gly Ser Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp100 105 110Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly115 120 125Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu130 135 140Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His145 150 155 160Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His165 170 175
Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr180 185 190Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn195 200 205Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala210 215 220Glu Pro Ser Phe Ser Gly Phe Trp Ser Ala Trp Ser Glu Pro Ala Ser225 230 235 240Leu Leu Thr Ala Ser Asp Leu Asp Pro Leu Ala Ala Ala Val Ile Ile245 250 255Val Pro Thr Leu Leu Val Thr Ile Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile260 265 270Leu Trp Leu Phe Ile Arg Glu Gln Arg Thr Gln Gln Gln Arg Ser Gly275 280 285Pro Gln Gly Ile Ala Pro Val Pro Pro Pro Arg Asp Leu Ser Trp Glu290 295 300Ala Gly His Gly Gly Asn Val Ala Leu Pro Leu Lys Glu Thr Ser Val305 310 315 320Glu Asn Phe Leu Gly Ala Thr Thr Pro Ala Leu Ala Lys Leu Gln Val325 330 335Pro Arg Glu Gln Leu Ser Glu Val Leu Glu Gln Ile Cys Ser Gly Ser340 345 350Cys Gly Pro Ile Phe Arg Ala Asn Met Asn Thr Gly Asp Pro Ser Lys355 360 365Pro Lys Ser Val Ile Leu Lys Ala Leu Lys Glu Pro Ala Gly Leu His370 375 380Glu Val Gln Asp Phe Leu Gly Arg Ile Gln Phe His Gln Tyr Leu Gly385 390 395 400Lys His Lys Asn Leu Val Gln Leu Glu Gly Cys Cys Thr Glu Lys Leu405 410 415Pro Leu Tyr Val Val Leu Glu Asp Val Ala Gln Gly Asp Leu Leu Ser420 425 430Phe Leu Trp Thr Cys Arg Arg Asp Val Met Thr Met Asp Gly Leu Leu435 440 445Tyr Asp Leu Thr Glu Lys Gln Val Tyr His Ile Gly Lys Gln Val Leu450 455 460Leu Ala Leu Glu Phe Leu Gln Glu Lys His Leu Phe His Gly Asp Val465 470 475 480Ala Ala Arg Asn Ile Leu Met Gln Ser Asp Leu Thr Ala Lys Leu Cys
485 490 495Gly Leu Gly Leu Ala Tyr Glu Val Tyr Thr Arg Gly Ala Ile Ser Ser500 505 510Thr Gln Thr Ile Pro Leu Lys Trp Leu Ala Pro Glu Arg Leu Leu Leu515 520 525Arg Pro Ala Arg Ile Arg Ala Asp Val Trp Ser Phe Gly Ile Leu Leu530 535 540Tyr Glu Met Val Thr Leu Gly Ala Pro Pro Tyr Pro Glu Val Pro Pro545 550 555 560Thr Ser Ile Leu Glu His Leu Gln Arg Arg Lys Ile Met Lys Arg Pro565 570 575Ser Ser Cys Thr His Thr Met Tyr Ser Ile Met Lys Ser Cys Trp Arg580 585 590Trp Arg Glu Ala Asp Arg Pro Ser Pro Arg Glu Leu Arg Leu Arg Leu595 600 605Glu Ala Ala Ile Lys Thr Ala Asp Asp Glu Ala Val Leu Gln Val Pro610 615 620Glu Leu Val Val Pro Glu Leu Tyr Ala Ala Val Ala Gly Ile Arg Val625 630 635 640Glu Ser Leu Phe Tyr Asn Tyr Ser Met Leu645 650<210>3<211>1977<212>DNA<213>人工序列<220>
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<400>3atggacaaac tcagggtgcc cctctggcct cgggtaggcc ccctctgtct cctacttgct60ggggcagcct gggcaccttc acccagcctc ccggacccca agtttgagag caaagcggcc120ctgctggcat cccggggctc cgaagaactt ctgtgcttea cccaacgctt ggaagacttg180gtgtgtttct gggaggaagc ggcgagctcc gggatggact tcaactacag cttctcatac240cagetcgagg gtgagtcacg aaagtcatgt agcctgcacc aggctcccac cgtccgcggc300tccgtgcgtt tctggtgttc actgccaaca gcggacacat cgagttttgt gccgctggag360
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<220>
<223>
<400>4Met Asp Lys Leu Arg Val Pro Leu Trp Pro Arg Val Gly Pro Leu Cys1 5 10 15Leu Leu Leu Ala Gly Ala Ala Trp Ala Pro Ser Pro Ser Leu Pro Asp20 25 30Pro Lys Phe Glu Ser Lys Ala Ala Leu Leu Ala Ser Arg Gly Ser Glu35 40 45Glu Leu Leu Cys Phe Thr Gln Arg Leu Glu Asp Leu Val Cys Phe Trp50 55 60Glu Glu Ala Ala Ser Ser Gly Met Asp Phe Asn Tyr Ser Phe Ser Tyr65 70 75 80Gln Leu Glu Gly Glu Ser Arg Lys Ser Cys Ser Leu His Gln Ala Pro85 90 95Thr Val Arg Gly Ser Val Arg Phe Trp Cys Ser Leu Pro Thr Ala Asp100 105 110Thr Ser Ser Phe Val Pro Leu Glu Leu Gln Val Thr Glu Ala Ser Gly115 120 125Ser Pro Arg Tyr His Arg Ile Ile His Ile Asn Glu Val Val Leu Leu130 135 140Asp Ala Pro Ala Gly Leu Leu Ala Arg Arg Ala Glu Glu Gly Ser His145 150 155 160Val Val Leu Arg Trp Leu Pro Pro Pro Gly Ala Pro Met Thr Thr His165 170 175Ile Arg Tyr Glu Val Asp Val Ser Ala Gly Asn Arg Ala Gly Gly Thr180 185 190Gln Arg Val Glu Val Leu Glu Gly Arg Thr Glu Cys Val Leu Ser Asn195 200 205Leu Arg Gly Gly Thr Arg Tyr Thr Phe Ala Val Arg Ala Arg Met Ala210 215 220
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<223>
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权利要求
1.一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。
2.根据权利要求1所述的嵌合受体，其特征在于所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列的蛋白质。
3.根据权利要求2所述的嵌合受体，其特征在于所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体的羧基端还带有FLAG标签，所述带有FLAG标签的嵌合受体具有序列表中序列4的氨基酸序列。
4.鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体编码基因，具有下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)编码序列表中SEQ ID №2蛋白质序列的多核苷酸；3)与序列表中SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体编码基因是具有序列表中SEQ ID №1的核苷酸序列。
6.根据权利要求5所述的基因，其特征在于所述鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体编码基因的3′端还带有FLAG标签的编码基因，所述带FLAG标签编码基因的嵌合受体编码基因具有序列表中SEQ ID №3的核苷酸序列。
7.含有权利要求4所述基因的表达载体。
8.根据权利要求7所述的载体，其特征在于所述表达载体为pcDNA3(EPOR/NOK-H)。
9.含有权利要求4所述基因的细胞系。
10.根据权利要求9所述的细胞系，其特征在于所述细胞系为BaF3-EPOR/NOKCGMCC №1144。
全文摘要
本发明的公开了一种鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体及编码基因与应用，其目的是提供一种鼠源EPOR(红细胞生成素受体)胞外区与人源NOK(带激酶功能域的新型癌基因)胞内区嵌合受体及编码基因与可表达该受体的细胞系。本发明所提供的鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体，是具有序列表中SEQ ID №2的氨基酸残基序列或将SEQ ID №2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ ID №2相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白质。鼠源EPOR胞外区与人源NOK胞内区嵌合受体稳定表达细胞系BaF3－EPOR/NOK CGMCC№1144可作为细胞水平的模型工具用于筛选抗肿瘤生成与转移药物。
文档编号C12N15/12GK1570108SQ200410037889
公开日2005年1月26日 申请日期2004年5月13日 优先权日2004年5月13日
发明者刘力, 傅新元, 常智杰, 张淑平 申请人:清华大学