一种生产n-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明属于基因工程菌的构建及应用，特别是指一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。该基因工程菌通过在枯草芽孢杆菌中表达编码6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因，形成完整的从葡萄糖到N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路；敲除或失活枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因nagB和gamA、6-磷酸-N-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因nagA、氨基葡萄糖转运蛋白基因gamP和N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因nagP构建而成，它解决了现有技术中所生产的N-乙酰氨基葡萄糖安全性差、产量低、成本高的问题。具有所构建的基因工程菌能积累更高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖，工业化利用价值较高的优点。
【专利说明】一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构建方 法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程菌的构建及应用，特别是指一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的 枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] N-乙酰氨基葡萄糖是葡萄糖的衍生物，通常以beta-1，4-糖苷键聚合成几丁质。 几丁质是自然界中数量仅次于纤维素的第二大类碳水化合物，广泛存在于菌类、藻类，虾、 蟹、昆虫的外壳和高等植物的细胞壁等，因此，N-乙酰氨基葡萄糖在自然界的存量巨大。
[0003] N-乙酰氨基葡萄糖与D-葡萄糖醛酸形成重复的二糖单位而构成透明质酸，透明 质酸是关节间起润滑作用的关键物质，对于骨关节具有重要的保护作用。实验已证明N-乙 酰氨基葡萄糖可作为治疗和预防中老年人关节疾病的有效药物，并且实验证明即使大剂量 的N-乙酰氨基葡萄糖对人体也无任何毒副作用，是一种安全可靠的保健品和药物。N-乙酰 氨基葡萄糖也可以通过酶水解或酸水解产生氨基葡萄糖，后者也是一种已得到广泛应用的 中老年人关节保健品，市场巨大。
[0004] N-乙酰氨基葡萄糖的生产目前主要是利用氨基葡萄糖和乙酸酐经化学缩合反应 而成，原料氨基葡萄糖主要通过酸水解几丁质而获得，这个过程伴随着大量含酸废水的排 放，而且由于虾蟹壳几丁质的原料供应受季节和产地因素的限制，导致最终N-乙酰氨基葡 萄糖生产成本过高。因此，国内外开展了利用微生物发酵法生产N-乙酰氨基葡萄糖的工 作。
[0005] 专利 W02004003175(同族专利包括 US7332304 和 CN101365785 等）中公开了一 系列代谢工程大肠杆菌的构建方法，发酵后N-乙酰氨基葡萄糖产量最高达到110g/L，专利 CN102268399和CN102286420公开了两种构建大肠杆菌工程菌的方法，并通过发酵N-乙酰 氨基葡萄糖产量达到70g/L。上述专利都是通过遗传改造大肠杆菌得到能高产N-乙酰氨基 葡萄糖的基因工程菌，但是大肠杆菌在发酵过程中会产生内毒素，这使得其发酵产品在保 健品和食品中的应用受到限制，因此采用安全无毒的微生物生产氨基葡萄糖或N-乙酰氨 基葡萄糖成为工业生产的需要。
[0006] 专利 CN103045527A，CN102978149A 和 CN103060252A 中公开了一系列产 N-乙酰 氨基葡萄糖的枯草杆菌工程菌构建方法，通过遗传改造构建了几株产N-乙酰氨基葡萄糖 的枯草芽孢杆菌，发酵后产量分别达到115mg/L，415mg/L和1.23g/L，初步解决了发酵法生 产N-乙酰氨基葡萄糖安全性的问题，但以上发酵产量最高只达到1. 23g/L，产量过低导致 生产成本增高，不利于工业化生产的应用。
【发明内容】
[0007] 本发明的目的之一在于提供一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌及其构 建方法和应用，利用所构建的高产N-乙酰氨基葡萄糖的基因工程枯草芽孢杆菌，通过生物 发酵工程，达到生产可以在保健品领域应用的高安全性N-乙酰氨基葡萄糖的目的。
[0008] 本发明的整体技术构思是：
[0009] -种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，其保藏编号为 CCTCC Μ 2014342。
[0010] 上述菌种 申请人:已于2014年7月16日提交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国 典型培养物保藏中心保藏，保藏单位简称为CCTCC。
[0011] 生产Ν-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌的构建方法，是通过将编码6-磷酸氨基 葡萄糖合成酶、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶引入枯草芽孢杆菌宿主菌高效表达，并敲除或 失活枯草芽孢杆菌中Ν-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄糖脱氨酶基因 nagB和gamA、6-磷酸-Ν-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因 nagA、氨基葡萄糖转运蛋白基因 gamP和N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因 nagP构建而成。
[0012] 所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因和6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因引入枯草 芽孢杆菌超表达，可将这两个基因分别克隆到表达载体上后，以质粒的方式在枯草芽孢杆 菌中串联表达，本发明中表达载体选择ΡΗΤΟ 1载体。
[0013] 所述nagB、nagA、nagP、gamA和gamP基因的敲除，是通过同源重组系统完成。五 个基因中nagA和nagB在枯草杆菌染色体上连锁排列，可一次性敲除，gamA和gamP连锁排 列，可一次性敲除。因此，上述5个基因的敲除可以通过三次实验操作完成，也可以通过五 次实验分别完成。枯草芽孢杆菌的基因敲除工作可通过PMAD载体和分子生物学实验完成。
[0014] 生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌在N-乙酰氨基葡萄糖中的应用，将生产 N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌CCTCC Μ 2014342接种至以葡萄糖为碳源的无菌培养 基，在37°C条件下通气发酵70小时。
[0015] 本发明的具体技术构思还有：
[0016] 所述的构建方法包括如下工艺步骤：
[0017] A、分别敲除枯草芽抱杆菌中的nagAB基因族、gamAP基因族和nagP基因，获得基 因工程菌宿主；
[0018] B、构建GNA1和glmS双表达载体；
[0019] C、将双表达载体转入1)所得宿主菌，得到最终生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽 孢杆菌。
[0020] 所述的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于枯草芽孢杆菌或其它具有相同功能 酶的微生物。
[0021] 所述6-磷酸氨基葡萄糖合成酶催化6-磷酸果糖和谷氨酰胺合成6-磷酸氨基葡 萄糖的反应，该酶受反应产物6-磷酸氨基葡萄糖的反馈抑制，因此该反应为N-乙酰氨基葡 萄糖合成途径中的限速步骤，高表达6-磷酸氨基葡萄糖合成酶有助于增加中间产物6-磷 酸氨基葡萄糖的供应量，从而会增加终产物N-乙酰氨基葡萄糖的浓度。所述酶可来源于枯 草芽孢杆菌，基因的获得可根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组序列GenBank No. NC_000964 中glmS基因序列全基因合成，或利用枯草芽孢杆菌168菌株的基因组DNA为模板通过PCR 扩增获得。
[0022] 所述的6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因来源于酿酒酵母或其它具有相同功能酶 的微生物。
[0023] 所述6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶催化6-磷酸氨基葡萄糖和乙酰CoA合成6-磷 酸-N-乙酰氨基葡萄糖，该酶在枯草芽孢杆菌中不存在，通过基因工程引入并高表达，从 而实现合成N-乙酰氨基葡萄糖的目的。该酶来源于酿酒酵母，基因的获得可根据GenBank No. NM_001179949序列，经全基因合成得到，或利用酿酒酵母S288c菌株基因组DNA为模板 通过PCR扩增获得。
[0024] 所述的敲除或失活枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸 氨基葡萄糖脱氨酶基因 nagB和gamA同时进行。
[0025] 本发明所具备的实质性特点和取得的显著技术进步在于：
[0026] 本发明通过在枯草芽孢杆菌中进行基因工程操作，构建了一条新的从葡萄糖到 N-乙酰氨基葡萄糖的代谢通路，增强了 N-乙酰氨基葡萄糖合成途径中的限速酶基因表达， 同时，敲除导致N-乙酰氨基葡萄糖消耗和回流的基因，阻止N-乙酰氨基葡萄糖的回流和消 耗，相比现有技术，本发明构建的工程菌株能积累更高浓度的N-乙酰氨基葡萄糖（经检测， 发酵终产物中N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达38. 3g/L)，具有较高的工业化利用价值。
[0027] 本发明中所采用的微生物已于2014年7月16日提交中国典型培养物保藏中心保 藏，保藏单位简称为CCTCC。
【专利附图】
【附图说明】
[0028] 图1是本发明中生产N-乙酰氨基葡萄糖工程菌株的相关代谢途径。
【具体实施方式】
[0029] 以下结合附图对本发明的实施例做进一步描述，但不作为对本发明的限定，本发 明的保护范围以权利要求记载的内容为准，任何依据说明书做出的等效技术手段替换，均 不脱离本发明的保护范围。
[0030] 本实施例中使用的质粒抽提、基因组抽提、PCR试剂等采用商业产品，具体操作按 照说明书进行。其他未注明的实验操作按照《分子克隆实验指南第三版》（〔美〕J.莎姆布 鲁克黄培堂译）操作方法进行。
[0031 ] 枯草芽孢杆菌实验操作及pMAD基因敲除原理和方法见文献（Maryvonne Arnaud et al, New vector for efficient allelic replacement in naturally nontransformable, low-GC-content, gram-positive bacteria, APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, Nov. 2004,p.6887 - 6891)〇
[0032] 枯草芽孢杆菌电转化方法参照文献Meddeb Mouelhi F et al, High transformation efficiency of Bacillus subtilis with integrative DNA using glycine betaine as osmoprotectant, Anal Biochem. 2012 May 15 ;424 (2):127-9.
[0033] 实施例1
[0034] 一、敲除枯草芽孢杆菌168菌株中nagAB基因簇
[0035] 1、根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： h游引物 F-nagAB-up-BamHI: CTGGATCCGACTGCAAGATTTCGGCCTGGG (SEQ ID NO. 1 所示）和下 游引物 R-nagAB:CATMGTCAGCATGTTCCTTTCACATAGATGATCCGCCTTTCTGG(SEQ ID N0. 2 所示）。 以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到nagAB基因簇上游1000bp片 段。
[0036] 2、根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 F-nagAB: CCAGAAAGGCGGATCATCTATGTGAAAGGAACATGCTGACTTATG (SEQ ID N0. 3 所 示）和下游引物 R-nagAB-down-NcoI: GCTCCATGGTAACGTATATACCAATGAAGAG (SEQ ID NO. 4 所示）。以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到nagAB基因簇下游 lOOObp 片段。
[0037] 3、将上述两种PCR产物纯化后各取5ul作为模板，以引物F-nagAB-up-BamHI (SEQ IDN0·l所示）和R-nagAB-down-NcoI(SEQIDN0·4所示）做overlapPCR扩增，获得nagAB 基因簇中上下游各l〇〇〇bp，且中间缺失了 nagAB编码区的DNA片段。
[0038] 4、纯化上述片段，利用常规分子克隆技术将其插入载体pMAD，得到敲除载体 pMAD- Δ nagAB ；
[0039] 5、将pMAD-AnagAB质粒转化进枯草芽孢杆菌168菌株，涂布含有50ug/mL的 X-gal (5-溴_4_氯_3_卩彡丨哚-β -D-半乳糖苷）和红霉素平板，30度过夜培养；
[0040] 6、挑取显蓝色转化子，30度过夜培养，按5%接种量转接至5mL红霉素抗性的LB 培养基，30度孵育2小时，升温至42度继续孵育6小时，稀释（1(Γ2-1(Γ5)涂布含有X-gal和 红霉素的平板，42度过夜培养；
[0041] 7、挑取蓝色单菌落于30度和无抗性LB培养基中孵育6小时，升温至42度继续孵 育3小时，稀释（1(Γ 2-1(Γ5)涂布含有X-gal的无抗性LB平板，42度过夜培养；
[0042] 8、挑取显白斑的单菌落分别在红霉素和无抗LB培养基过夜培养，选择无红霉 素抗性的单菌落做菌落PCR验证，引物选择F-nagAB-up-BamHI (SEQ ID NO. 1所示）和 R-nagAB-down_NcoI(SEQ ID NO. 4所示），能扩增出大小为2kb的菌落即为敲除了 nagAB基 因簇的阳性菌落Bsl68/AnagAB。
[0043] 实施例2
[0044] 二、继续敲除枯草芽孢杆菌中的gamAP基因簇
[0045] 1、根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 F-gamAP-up-BamHI: CTGGATCCACTGCTCCCCACAGCACTTTTCC (SEQ ID N0. 5 所示）和 下游引物 R-gamAP:CGCAGCAGGGGGGACTITITTACATGTGACACCCCCTCAAAGAG(SEQ ID N0. 6 所 示）。以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到gamAP基因簇上游 lOOObp 片段。
[0046] 2、根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 F-gamAP: CTCTTTGAGGGGGTGTCACATGTAMAAAGTCCCCCCTGCTGCG (SEQ ID N0. 7 所示） 和下游引物 R-gamAP-down-NcoI: GCTCCATGGATACCACTCGTTTGGGACAGCC (SEQ ID Ν0· 8 所示）。 以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到gamAP基因簇下游lOOObp片 段。
[0047] 3、将上述两种PCR产物纯化后各取5ul作为模板，以引物F-gamAP-up-BamHI (SEQ ID Ν0· 5所示）和R-gamAP-down-NcoI (SEQ ID Ν0· 8所示）扩增，获得gamAP基因簇中上下 游各1000bp，且中间缺失了 gamAP编码区的DNA片段。
[0048] 4、纯化上述片段，利用常规分子克隆技术将其插入载体pMAD，得到敲除载体 pMAD-Δ gamAP ；
[0049] 5、将pMAD- Λ gamAP质粒转化进实施例1中的枯草芽孢杆菌Bsl68/ Λ nagAB菌株， 采用与上述同样的步骤筛选阳性菌落，引物选择F-gamAP-up-BamHI (SEQ ID NO. 5所示）和 R-gamAP-down_NcoI(SEQ ID NO. 8所示），能扩增出大小为2kb的菌落即为敲除了 gamAP基 因的阳性菌落 Bsl68/A nagAB /Δ gamAP。
[0050] 实施例3
[0051] 三、继续敲除枯草芽孢杆菌中的nagP基因
[0052] 1、根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 F-nagP-up-BamHI: CTGGATCCCAAGACCTCCTCGTACAGAATAATG (SEQ ID N0. 9 所示） 和下游引物 R_nagP:GGTTGCCCTCTCCGCTTTTTTACATACCCATCCCCCTCATACCC(SEQ ID NO. 10 所 示）。以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到nagP基因上游1000bp 片段。
[0053] 2、根据枯草芽孢杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列，设计引物： 上游引物 F-nagP: GGGTATGAGGGGGATGGGTATGTAAMAAGCGGAGAGGGCAACC (SEQ ID NO. 11 所示） 和下游引物 R-nagP-down-NcoI: GCTCCATGGTTCCGGCGATTCTGAAGTCTAAG (SEQ ID N0. 12 所 示）。以枯草芽孢杆菌168菌株基因组DNA为模板，经PCR扩增得到nagP基因下游1000bp 片段。
[0054] 3、将上述两种PCR产物纯化后各取5ul作为模板，以引物F-nagP-up-BamHI (SEQ ID Ν0· 9所示）和R-nagP-down-NcoI (SEQ ID Ν0· 12所示）扩增，获得nagP基因中上下游 各1000bp，且中间缺失了 nagP编码区的DNA片段。
[0055] 4、纯化上述片段，利用常规分子克隆技术将其插入载体pMAD，得到敲除载体 pMAD-Δ nagP ；
[0056] 5、将pMAD- Δ nagP质粒转化进实施例2中的枯草芽孢杆菌Bs 168/ Δ nagAB/ Λ gamAP菌株，采用与上述同样的步骤筛选阳性菌落，引物选择F-nagP-up-BamHI (SEQ ID NO. 9所示）和R-nagP-down-NcoI (SEQ ID NO. 12所示），能扩增出大小为2kb的菌落即为 敲除了 nagP 基因的阳性菌落 Bsl68/AnagAB/AgamAP/AnagP。
[0057] 实施例4
[0058] 四、GNA1和glmS基因双表达载体的构建
[0059] 1、根据酿酒酵母GNA1基因序列GenBank No. NM_001179949全合成GNA1基因，两 端加 BamHI和Xbal位点（如下划线所示），具体序列如下所示（SEQ ID N0. 13)。
[0060] ggatccatgagcttacccgatggattttatataaggcgaatggaagagggggatttggaacaggtcact gagacgctaaaggttttgaccaccgtgggcactattacccccgaatccttcagcaaactcataaaatactggaatga agccacagtatggaatgataacgaagataaaaaaataatgcaatataaccccatggtgattgtggacaagcgcaccg agacggttgccgctacggggaatatcatcatcgaaagaaagatcattcatgaactggggctatgtggccacatcgag gacattgcagtaaactccaagtatcagggccaaggtttgggcaagctcttgattgatcaattggtaactatcggctt tgactacggttgttataagattattttagattgcgatgagaaaaatgtcaaattctatgaaaaatgtgggtttagca acgcaggcgtggaaatgcaaattagaaaatagtctaga
[0061] 2、利用常规分子生物学技术将GNA1基因连接至pHTOl载体（MoBiTec公司，德国） 的BamHI和Xbal位点上，得到载体pHTOl-GNAl。
[0062] 3、根据枯草芽抱杆菌168菌株基因组（Genbank No. NC_000964)序列中glmS序 列设计引物，正向引物 F-glmS-Xbal ：CGCTCTAGAGGAGGAAGAAAAATATGTGTG(SEQ ID NO. 14 所 示）和反向引物 R-glmS-AatII ：GTAGACGTCTTACTCCACAGTAACACTCTTCGC(SEQ ID NO. 15 所 示），该引物中的两端增加了 Xbal和Aatll位点；
[0063] 4、以枯草芽孢杆菌168菌株的总DNA为模板，以上述引物（SEQ ID NO. 14-15 所示）PCR扩增得到glmS基因及其上游核糖体结合位点的DNA片段，通过常规克隆技术 将片段插入上述构建好的载体PHT01-GNA1的Xbal和Aatll位点之间，得到双表达载体 pHTOl-GNAl-glmS。
[0064] 实施例5
[0065] 五、最终工程菌的构建
[0066] 将上述构建的双表达载体pHTOl-GNAl-glmS电转化改造过的枯草芽孢杆菌宿主 菌Bsl68/ Λ nagAB/ Λ gamAP/ Λ nagP，涂布氯霉素（10mg/L) LB平板，37度培养过夜，获得基 因工程菌株1^168/八1^8413/八8811^/八1^8?/^1'01-6敵1-811113，即为能合成1^-乙酰氨基 葡萄糖的枯草芽孢杆菌，命名为BsNAGOl。
[0067] 实施例6
[0068] 六、工程菌株发酵
[0069] 1、种子和发酵培养基：
[0070] 种子培养基为LB培养基（成分为蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L);固 体或液体培养时，补加氯霉素至终浓度l〇mg/L。
[0071] 发酵培养基由如下组份组成：蛋白胨l-10g/L，酵母粉l-5g/L，磷酸氢二钾l-5g/ L，磷酸二氢钾l_8g/L，硫酸铵l-5g/L，葡萄糖5-20g/L，余量为水。补料培养基为质量百分 比为40-60%的葡萄糖溶液。
[0072] 2、发酵过程：
[0073] 先过夜培养种子培养基，按2-5%的接种量将枯草芽孢杆菌CCTCC M2014342转接 至发酵培养基，33-37°C好气培养，通过通气量、罐压和搅拌保持溶氧维持在20%以上，用氨 水控制pH = 6. 8-7. 0并补充氮源，初始葡萄糖耗完后开始按照3-6g/L · h速率补加碳源， 发酵液0D600达到15后添加0. 01-0. 05mM的异丙基-β -D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)诱 导蛋白表达，继续培养至发酵结束，取样利用高效液相色谱（HPLC)检测。
[0074] 具体检测条件为：
[0075] 检测柱：Bi〇-Rad ΑΜΙΝΕΧ ΗΡΧ 87Η Organic Analysis Column (300X 7. 8 mm);
[0076] 柱温：6〇? ;
[0077] 流动相：6mM 硫酸，流速：0. 6ml/min ;
[0078] 检测波长：210 nm。
[0079] 经检测，72-84小时发酵后，发酵液中N-乙酰氨基葡萄糖浓度可达38. 3g/L以上。
【权利要求】
1. 一种生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)，其特征在于其 保藏编号为CCTCC Μ 2014342。
2. 生产Ν-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征在于是通过将编码 6_磷酸氨基葡萄糖合成酶、6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶引入枯草芽孢杆菌宿主菌高效表 达，并敲除或失活枯草芽孢杆菌中Ν-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基葡萄 糖脱氨酶基因 nagB和gamA、6-磷酸-Ν-乙酰氨基葡萄糖脱乙酰酶基因 nagA、氨基葡萄糖转 运蛋白基因 gamP和N-乙酰氨基葡萄糖转运蛋白基因 nagP构建而成。
3. 根据权利要求2所述的生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征 在于所述的构建方法包括如下工艺步骤： A、 分别敲除枯草芽孢杆菌中的nagAB基因簇、gamAP基因簇和nagP基因，获得基因工 程菌宿主； B、 构建GNA1和glmS双表达载体； C、 将双表达载体转入A所得宿主菌，得到最终生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆 菌。
4. 根据权利要求2所述的生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征 在于所述的6-磷酸氨基葡萄糖合成酶基因来源于枯草芽孢杆菌或其它具有相同功能酶的 微生物。
5. 根据权利要求2所述的生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征 在于所述的6-磷酸氨基葡萄糖乙酰化酶基因来源于酿酒酵母或其它具有相同功能酶的微 生物。
6. 根据权利要求2所述的生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌的构建方法，其特征 在于所述的敲除或失活枯草芽孢杆菌中N-乙酰氨基葡萄糖分解代谢途径中的6-磷酸氨基 葡萄糖脱氨酶基因 nagB和gamA同时进行。
7. 生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌在N-乙酰氨基葡萄糖中的应用，其特征在 于将生产N-乙酰氨基葡萄糖的枯草芽孢杆菌CCTCC Μ 2014342接种至以葡萄糖为碳源的 无菌培养基，在37°C条件下通气发酵70小时。
【文档编号】C12N15/75GK104195094SQ201410376584
【公开日】2014年12月10日 申请日期:2014年8月1日 优先权日:2014年8月1日
【发明者】张帆 申请人:张帆