癌中capcna蛋白-蛋白相互作用的肽基抑制的制作方法

专利名称：癌中capcna蛋白-蛋白相互作用的肽基抑制的制作方法
技术领域：
本文公开内容涉及选择性地靶向细胞成分的肽基治疗组合 物和方法，和涉及癌增生的方法。
背景增殖细胞核抗原(PCNA)在DNA复制、修复、染色体重组、 细胞周期关卡调控和其它的细胞增殖活性的过程中，扮演重要的角 色。与衔接蛋白、复制因子C(RFC)连接，PCNA形成为DNA聚合酶 S和DNA聚合酶e对接点的滑动钳。呈酸碱两性等电点(pl)的增殖细 胞核抗原(PCNA)的不同同种型已被证明。恶性与非-恶性乳腺细胞(被 称为非-恶性PCNA或nmPCNA)和组织的PCNA的二维聚丙烯酰胺凝 胶电泳法(2DPAGE)分析，显示PCNA的酸型仅存在于恶性细胞中(被 称为癌症特异性PCNA或csPCNA或caPCNA)。 PCNA的这两种形式 间的该等电点差异，似乎是因恶性细胞对翻译后修饰PCNA多肽的能 力改变而引起，而不是由于PCNA基因内的遗传改变。检测PCNA多肽的结构以定义caPC^A与PCNA的非-恶 性细胞同种型之间的结构差异的结构研究，显示了唯一仅暴露于癌细 胞中的caPCNA蛋白的区域。针对癌症特异性PCNA同种型的区域， 开发了对PCNA同种型在癌细胞中排它表达具有高度选择性的抗体。增殖细胞核抗原(PCNA)是29 kDa的核蛋白，其在细胞周 期的S期和G2期时于细胞中的表达使该蛋白成为良好的细胞增殖标 记。还已经表明，在许多分子途径中的配偶体负责细胞的生命和死亡。 其在S期细胞核中的周期性出现提示与DNA复制有关联。PCNA后 来被鉴别为哺乳动物细胞中的DNA聚合酶辅助罔子和体外SV40 DNA复制的必需因子。除了在哺乳动物细胞中用作DNA滑动钳蛋白 和DNA聚合酶辅助因子以外，PCNA还与涉及转录、细胞周期关卡、 染色体重塑、重组、凋亡和其它形式的DNA修复的众多其它蛋白相 互作用。除了作用不同之外，PCNA的许多结合湾己偶体通过其对每种
新一代细胞的细胞功能的精确遗传的贡献而连接。PCNA可用作协调 染色体加工的主要分子。还已知PCNA与例如FEN-1 、 DNA连接酶和PNA甲基转 移酶的其它因子相互作用。另夕卜，还已经表明PCNA在多个DNA修 复途径中是必需的参与者。与错配识别蛋白、Msh2和核苷酸切除修 复内切核酸酶XPG之类的蛋白的相互作用，使PCNA参与和DNA合 成截然不同的过程。与多个配偶体的相互作用 一般取决于能使PCNA 以按顺序和对遗传有利的方式选择性地相互作用的机制。已经相当成功地应用产生多克隆抗体和单克隆抗体的短合 成肽的用途。已知肽作为化学-引诱剂、活性神经毒素和呼吸毒素和激 素。肽还已被用作生化研究的亲合把和探针，且已提供理解不连续蛋 白-蛋白相互作用特征和特异性的基础。此外，肽激素发挥活性生理效 应，在一些情况下，活性激素是较大蛋白内包含的肽或在发挥其生理 效应之前从前体蛋白被加工和释》文。肽已经通过用作这些相互作用的高度特异性竟争剂，而用 于千扰蛋白-蛋白相互作用。利用肽试剂的生化研究增加肽作为能够干 扰蛋白-蛋白相互作用所需细胞功能的治疗药的用途。因此，假如选择 性地干扰这些蛋白-蛋白相互作用，那么可抑制依赖于不连续的蛋白-蛋白相互作用的特异性细胞过程，例如凋亡和细胞周期进程。基因组
DNA的复制依赖于蛋白-蛋白相互作用也对肽译导的这些蛋白相互作 用的抑制敏感。体内DNA合成是高度调节的过程，其依赖于一系列复杂 的蛋白-蛋白相互作用介导的无数的生化反应。细胞分裂依赖于DNA 合成过程，而癌细胞的生长基本上对干扰DNA合成机制的调节和/或 活性的任何药物敏感，所述DNA合成机制负责复制癌细胞的基因组 DNA。此外，证明当转化的细胞发育成高侵袭转移性表型时，乳腺癌 的一个标记是基因组不稳定性的诱导。基因组不稳定性由改变DNA 合成使用的保真度的细胞DNA合成机制中的一系列变化导致。利用p^cip蛋白(已知它与PCNA蛋白相互作用)的羧基末 端26个氛基酸的研究证明该肽千扰细胞增殖过程的能力，p21的这个 肽片段部分干扰一个或多个利用PCNA的细胞过程，推测与参与DNA 合成过程以及其它细胞周期关卡调控的调节和凋亡诱导的关键性蛋 白-蛋白相互作用相冲突。利用p21的这个肽片段的研究已经i正明p21肽激活非-半 胱天冬酶关联的细胞凋亡路径的能力。相似地，涉及在体内部分抑制 DNA复制的p21蛋白的39个M酸肽片段的研究，提示p21的这个 肽片段可稳定导致细胞内DNA合成活性降低的PCNA-p21蛋白相互 作用。与HLA类II序列的残基65-79相应的合成肽可以以相似 于由雷帕霉素诱导的方式抑制细胞周期进程。该研究表明肽而不是得 自细胞周期调节蛋白的那些肽具有调节细胞周期进程的能力。此外，可将计算化学方法用于冲莫拟可与其它细胞蛋白相互 作用的PCNA分子的特异性区i或，所迷其它细胞蛋白与细胞周期关卡 调控和DNA合成有关。细胞周期蛋白-CDK复合体的区域可用作模 板，以鉴别千扰细胞增殖所需关键细胞周期关卡扭制点的把位。需要应用合成肽抑制细胞增殖，和选摔性耙向癌症特异性 PCNA蛋白以调节细胞增殖抑制的方法来治疗癌症。期望与caPCNA
上抗原位点或靶位相互作用，以干扰唯一针对癌细胞的特异性蛋白
-caPCNA相互作用的肽模拟物药物。本文公开的衍生自caPCNA特异 性表位的肽，显著增强特异性传统化学疗法的细胞毒效应，岡此以高 度选择性的方式杀灭癌细胞。
概述衍生于非恶性PCNA (nmPCNA)蛋白或癌症特异性 (caPCNA或csPCNA)-相互作用蛋'白的特异性区域或结构域的肽干扰 细胞蛋白与PCNA蛋白在体内的相互作用。代表caPCNA蛋白的肽片 段的特异性氨基酸序列干扰PCNA的调节活性，随后通过干扰需要 PCNA的细胞过程的功能而抑制癌细胞生长，该细胞过程包括DNA 复制、修复、染色体重組和细胞周期关卡调控，在体内选择性地抑制癌症特异性增殖细胞核抗原 (caPCNA)同种型与恶性细胞中胞内蛋白的相互作用的方法，该方法包 括步骤
(a) 提供选择性地干扰caPCNA与胞内蛋白的相互作用的药物；
(b) 给予该药物，以使该药物在体内与癌细胞群体接触；和
(c) 抑制caPCNA与胞内蛋白的相互作用。药物可以是肽、肽^^莫拟物、小分子或其组合。在一个实施 方案中，药物为含氛基酸序列LGIPEQEY的肽。在另 一个实施方案中， 药物为在含氨基酸序列LGIPEQEY的靶位与caPCNA分子相互作用的 肽才莫拟物。在一个实施方案中，药物为还包括标记序列的肽。该标记 序列可包括^J^酸序列RYIRS 。任何易位序列(translocation sequence) 适合本文使用。在一个实施方案中，静脉内给予药物。在一个实施方案中， 药物被配制成选自脂质体、微米颗粒和纳米颗粒的治疗用递药系统。
在一个实施方案中，药物干扰caPCNA与涉及细胞过程的
胞内蛋白的相互作用，该细胞过程选自DNA合成、DNA修复、重组、 转录、细胞周期关卡调控和凋亡。在一个实施方案中，药物为其氨基酸序列得自caPCNA上 抗原位点的肽分子。在另一个实施方案中，药物为其分子结构对应于 caPCNA上抗原位点的肽模拟物分子。在另一个实施方案中，药物为 其氨基酸序列得自caPCNA上蛋白结合位点的肽分子。在一个实施方案中，药物为其分子结构对应于caPCNA上 蛋白结合位点的肽;t莫拟物分子。在一个实施方案中，药物为竟争caPCNA上结合位点的小 分子，其中该结合位点能与胞内蛋白相互作用，选择性地抑制癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种 型与恶性细胞中胞内蛋白的体内相互作用的方法，该方法包括步騍
(a) 提供选择性地干扰caPCNA与胞内蛋白的相互作用的药物，其 中该药物为肽或肽模拟物，其氨基酸序列或分子结构得自在与 caPCNA相互作用的胞内蛋白上的caPCNA结合位点；
(b) 给予该药物，以使该药物在体内与癌细胞群体接触；和
(c) 抑制caPCNA与胞内蛋白的相互作用，减少表达癌症特异性增殖细胞核批原(caPCNA)同种型的 恶性细胞的体内细胞增殖的方法，该方法包括步骤
(a) 提供选择性地干扰caPCNA与胞内蛋白的相互作用的药物；
(b) 给予该药物，以使该药物在体内与癌细胞群体接触；和
(c) 减少恶性细胞的细胞增殖。增强表达癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种型的 癌症的癌症治疗的方法，该方法包括步骤
(a) 提供选择性地干扰caPCNA与胞内胥白的相互作用的药物；
(b) 提供用于癌症的化学治疗剂；
(c) 给予所述药物和化学治疗剂，以使至少一部分药物在体内与癌 细胞群体接触；和
(d)增强癌症治疗，其中与由单独的化学疗法杀灭的癌细胞数目相 比，杀灭的癌细胞数目增加。鉴别选择性地抑制癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA) 同种型与恶性细胞中胞内蛋白的体内相互作用的候选药物的方法，该 方法包括步骤
(a) 提供药物；
(b) 提供caPCNA-衍生的肽；
(c) 鉴别结合到caPCNA-衍生的肽的药物；和
(d) 假如候选药物抑制caPCNA与胞内蛋白的相互作用，则确定该 药物为候选药物。也可按照合理的药物设计方法，以获得caPCNA细胞相互 作用的特异性抑制剂，该相互作用基于caPCNA衍生肽，例如具有氨 基酸序列LGIPEQEY的肽的结构或序列信息。在一个实施方案中，药 物为衍生自胞内蛋白的肽片段。在一个实施方案中，已知胞内蛋白与 caPCNA相互作用。用于减少恶性细胞的体内细胞增殖的治疗用组合物，该恶 性细胞表达癌症特异性增殖细力包核抗原(caPCNA)同种型，该组合物包 括具有氛基酸序列LGIPEQEY的肽分子或其功能等同的结构或其肽 模拟物，其中该肽分子衍生自caPCNA的氨基酸序列。在一个实施方 案中，该肽分子还包括促进跨细胞肽摄取的肽结构域。用于减少恶性细胞的体内细胞增殖的脂质体组合物，该恶 性细胞表达癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种型，该组合物包 括具有氮基酸序列LGIPEQEY的肽分子或其功能等同的结构或其肽 模拟物，其中该肽分子衍生自caPCNA的氨基酸序列。表达caPCNA衍生肽的重组细胞，其中该肽选择性地干拔 癌细胞中的蛋白-蛋白相互作用'。在一个实施方聿中，该caPCNA衍生 肽包括氛基酸序列LGIPEQEY。包括氨基酸序列LGEPEQEY和狀易位序列的合成肽，用于减少恶性细胞的细胞增殖的治疗用组合物，该恶性细 胞表达癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种型，该组合物包括具 有氨基酸序列LGIPEQEY的肽分子。该肽分子是可细胞渗透性的，包 括肽易位序列。该肽具有蛋白酶抗性。与肽抑制剂一起使用的合适的化学治疗剂包括阿霉素、紫 杉醇、多西他赛、顺铂、datrexate、吉西他滨或长春瑞滨或其組合。其它合适的PCNA-衍生的肽抑制剂包括VEQLGIPEQEY、 LGIPEQEYSCVVK 、 LGIPEQEYSCVVKMPSG 、 EQLGIPEQEY 、 QLGIPEQEY 、 LGIPEQEYSCVVKMPS 、 LGIPEQEYSCVVKMP 、 LGIPEQEYSCVVKM 、LGIPEQEYSCVV 、UHPEQEYSCV 、 LGIPEQEYSC、 LGIPEQEYS和在LGIPEQEY侧面的另外NH2末端氨基 酸和COOH末端氨基酸的组合。
附图简述图l显示用乳腺癌细胞进行的caPCNA羊巴肽序列转染实验 的流式细胞计分析。图2显示对于PCNA的XPG-GST亲和柱流份的2D-PAGE分析。图3显示XPG-GST融合蛋白特异性地免疫沉降物 caPCNA。如本文描述处理3(Hig的MCF7细胞提取物等分试样。以l: IOOO的稀释度，在蛋白质印迹分析中使用用来使PCNA显色的PC10抗体。图4显示用ELISA方法检测caPCNA的结果。
图5显示ELISA的结果，其中caPCNA抗体(caPCNAab)结合 到板上，用于捕获分离的caPCNA。冲洗孔，然后与识别PCNA的C端 20个氨基酸的山羊抗PCNA抗体(C20)—起温育。用碱性磷酸酯酶缀合 的抗山羊TgG抗体使结合的C20抗体显色，用对硝基苯酚磷酸酯使结 合的抗体复合物显色，并用分光光度法量化。冬研究中显示的竟争实
验涉及ca(cs)PCNA和本测定中递增量的caPCNA批原肽片段(称为B1 或PCNAaal26-133肽)同时温育。显示存在递增浓度肽B1时，caPCNA 整个分子的结合减少，并且证明ELISA测定对于由该肽序列定义的 caPCNA抗原表位的识别是特异性的。图6显示当caPCNA抗体识别抗原表位时肽序列的特异性。
图7阐述XPG-PCNA相互作用结构域的相互作用。使用本 文描述的ELISA测定，评估B1肽(PCNA aal26-133)是否可在定义的 PCNA-XPG相互作用结构域与XPG直接相互作用。图8显示csPCNA特异性地结合XPG。制备MCF7细胞核提 取物，透析入低盐緩冲液中，装载到在低盐緩冲液条件下预平衡的 XPG-GST琼脂糖柱上。用6柱体积的预平衡緩冲液冲洗柱。作为流份l 收集柱流通和冲洗流份。用緩冲液和盐的条件洗脱柱。(A)使用 XPG-GST琼脂糖柱的PC10抗体流份进行2D-PAGE蛋白质印迹。在蛋 白质印迹分析中以l: 1000稀释度使用PC10批体，(B)使用XPG-GST琼 脂糖柱的PC10和csPCNAab抗体流份进行lD-PAGE蛋白质印迹分析。 在蛋白质印迹分析中以l: 1000稀释度使用PC10和csPCNAab抗体，M 表示标记。
详述本文公开的方法和组合物涉及caPCNA衍生的和caPCNA 相互作用蛋白衍生的(例如p21、 XPG、 Cdk2)肽、肽模拟物、兵功能类 似物和选择性地干扰癌细胞中重要细胞功能的小分子。这些肽至少有 两种作用方式。例如，caPCNA衍生肽与caPCNA竟争结合到caPCNA 相互作用蛋白，或结合到干扰相互作用的caPCNA相互作用蛋白的位 点。caPCNA相互作用蛋白衍生肽竟争其在caPCNA上的相应结合位 点，因此阻止caPCNA相互作用蛋白结合到caPCNA。衍生于caPCNA蛋白序列的特异性肽能够阻断几种细胞蛋 白的结合，该细胞蛋白参与癌细胞的DNA复制、修复、细胞周期控制、
凋亡、转录或染色体重组。当允许肽与这些蛋白竟争其在PCNA上的 自然存在结合位点时，caPCNA与这些细胞蛋向的结合被干祝，通过
用，募集PCNA的正常细胞功能被干扰。该重要细胞机理的干扰自身 或与其它分子如癌症化学治疗药物组合赋予c aPCNA衍生肽细胞毒 性。这些肽单独或与其它癌症治疗剂组合，为有用的癌症化学疗法或 特异性抗癌化学疗法的药效加强剂。这些PCNA衍生肽分子也用作特 定细胞过程抑制剂，使新的机理和治疗方法能够调节涉及PCNA的正 常细胞和癌细胞中的特定细胞功能。—般而言，肽抑制剂基于概念干扰蛋白-蛋白相互作用将 导致干扰这些蛋白相互作用介导的细胞过程。然而，这些肽抑制剂没 有考虑识别"癌症特异性"氨基酸序列的需要，该氨基酸序列仅在癌细 胞中可得到，而在非癌细胞中不可得到，这是由于该氨基酸序列因各 种方法如翻译后修饰、蛋白构象变化、结合到癌细胞中过度表达的蛋 白或癌细胞中结合配偶体的缺失而在非癌细胞中被"隐藏"。因此，本 文识别的靶序列的癌症特异性在阻止癌细胞的蛋白-蛋白相互作用中 是特异性的。本文鉴定，衍生于蛋白增殖细胞核抗原(PCNA)的肽片段 能够结合DNA损害剂(例如阿霉素)起作用，以增强这样的药物治疗各 种癌细胞的疗效。该肽衍生于PCNA内的氨基酸序列，例如包含M 酸126-133的M酸序列。该序列似乎只暴露亍癌细胞中，而没有暴露 于非癌细胞。通过阻止PCNA-结合蛋白，包括XPG直接结合到癌细胞 中的caPCNA,增强了包括DNA损害剂的化学治疗药物的效果。通过 将合适的细胞，与作为单一药物或与细胞毒类药物如阿霉素组合的肽 一起温育，来测定该肽序列的内在细胞毒性。使用组织培养基中指数 生长的U937白血病细胞培养物。使用脂质体介导的蛋白迁移技水，其 中将caPCNA肽(126-133)和阿霉素包封在脂质体中，以10一添加至细 胞培养物中。使用白血病细胞系U937时，结幂表明该肽具有内在细胞
毒性，而U937细胞与该肽和一系列浓度的阿霉素一起温育，使阿霉素 的细胞毒性增加约3倍。该方法产生24小时内超过50%的培养细胞杀 灭，该细胞杀灭是肽/药物特异性的，而不是由于脂质体介导的细胞毒 性。作为阳性对照，这些白血病细胞也与衍生于p21waf蛋白的 肽一起温育几小时(4小时或24小时)，用衍生于醉母肌球蛋白的肽作为 阴性对照。结果表明甚至在缺少阿霉素时p21肽细胞毒性非常大^600/0 杀灭)，而PCNA衍生肽(氨基酸126-133)杀灭约20。/。的白血病细胞，寸吏 用碘化丙锭(propidium iodide)和膜联蛋白V柒色,通过流式细胞计评估 细胞杀灭对细胞损伤。这些研究表明，对应于PCNA序列内的氩基酸126-133的肽 具有抗癌化学治疗活性。另外，数据表明PCNA胥白或其任何结合配 偶体内的其它肽序列类似地可干扰调节细胞增殖和影响细胞存活的 特定细胞过程。得自PCNA和与PCNA相互作用的蛋白之间的接触区的 肽能干扰关键的细胞过程。例如，得自已知与PCNA结合的3种其它蛋 白(即Fen 1、 p21、 HDAC1)的相互作用位点的兵它肽，可设计为在关 键细胞过程如DNA复制和细胞周期关卡调控中具有抑制作用。这些肽 具有区别地抑制癌细胞增殖的癌症特异性作用，而对正常细胞分裂具 有很少的作用。该作用上的差异取决于(至少部分取决于)caPCNA和 其结合配偶体之间的相互作用位点内的差异，该差异在结构上改变了 -恶性细胞和非恶性细胞之间翻译后修饰中的差异诱导的构象变化。作 为治疗策略，当使用这些修饰肽治疗时，肽的物质形式的改变，例如 将自然存在的L-氨基酸形式变化为另一种形式(例如转变为D-氨基酸， 或改变单个氨基酸之间的肽键以便减少蛋白水解引起的非特异性降 解)，为延长肽半衰期的有用方法。 caPCNA-衍生肽和肽模拟物代表新的第三代抗癌治疗剂， 这些肽选择性地用作癌细胞中4吏用PCNA的组分的竟争剂。肽氨基酸 序列表示的分子靶在癌细胞中优势表达。因此，本文公开的肽相对于
现在的第二代治疗剂代表显著的进步，其中现在的第二代治疗剂靶向 可在癌细胞中向上或向下调节或表达的特异性途径。在第二代药物的 情况，这些细胞途径在非癌细胞中也有活动，这些笫二代药物或肽或 药剂对这些途径内的具体步骤的调节不能显著地区分癌细胞和非瘴 细胞。本文公开的肽序列扭向可能只在癌细胞中展开的caPCNA 蛋白区域，因此这些肽与caPCNA选择性抗体反应。因此，鉴于其与 caPCNA竟争调节与PCNA内氨基酸序列相互作用的特异性蛋白的活 性的能力，将本文公开的肽设计为选择性地靶向恶性细胞，该PCNA 涉及以下细胞过程中的至少一个DNA复制、修复、重组、转录、細 胞周期关卡调控和凋亡。使用标准的肽合成方法和设备合成或可市购得到(例如华 盛顿州，西雅图市耳关合生化研究^>司(United Biochemical Research Co.)) 本文公开的肽。包括人PCNA分子的氨基酸126-133 (LGEPEQEY)、之 后的促进细胞摄取肽的胰岛素受体序列(RYIRS)的caPCNA-衍生肽, 选择性地抑制体外癌细胞。通过在二曱亚砜(DMSO)的存在下，在磷 酸盐緩冲水溶液(PBS)或包含0.2%-2% DMSO而不食血清的培养基中， 将该肽与癌细胞一起温育约4-24小时，开始该肽的摄取。也通过将肽 包封进脂质体制剂，和随后在37。C时与癌细胞一起温育约4-24小时， 有效地介导该肽的摄取。该肽也增大化学治疗剂如阿霉素的细胞毒效 应。当用于本文时，术语"药物"、"药剂"包括核酸、蛋白、 蛋白片段、肽、合成肽、肽^t拟物、其类似物、小分子、抑制剂和能 够影响蛋白-蛋白相互作用或细胞过程的任何化学、有机或生物有机分 子。术语"caPCNA-衍生肽"和"PCNA-衍生肽"指肽、与PCNA
的对应区域相比用氨基酸替换或氨基酸类似物或氨基酸缺失修饰的 肽序列、和对应于PCNA特殊区域的肽冲莫拟物。PCNA-衍生肽的长度
可为约5-50个氨基酸或约5-20个氨基酸或约5-10个氛基酸。PCNA-衍 生肽也可包括纯化标记如组氨酸标记、FLAG-表倬、RYIRS标记和促 进肽跨细胞膜易位的序列。也可修饰PCNA-衍生狀以影响其亲油性， 从而增强肽递送至癌细胞。肽可合成("合成肽")或也可通过重组扶水 产生("重组肽")。也可将这些肽工程化以增加其体内稳定性，而不显 著影响其抑制caPCNA-蛋白相互作用的效能。也包括基本上不影响本 文公开的肽的抑制活性的突变，该突变包括插入、缺失、替换、M 酸修饰。基本上由126-133序列LGIPEQEY组戍的肽可包括其它特异性 序列或非特异性序列。"肽衍生物"指具有PCNA或PCNA同系物的区域的氨基酸 序列的分子，但另外具有其氨基酸侧基、a碳原子、末端氛基或木端 羧基中一种或多种的至少一种化学修饰。化学修饰包括添加化学部 分、产生新键和去除化学部分。氨基酸侧基的修饰包括赖氨酸、e-氨 基的酰化，精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化，谷氨酸或天冬氨酸 羧基的烷基化，和谷氨酰胺或天冬酰胺的去氨基化。末端氨基的修饰 包括脱-氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端M^ 的修饰包括酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺和低级烷基酯修饰。低 级烷基为C1-C4烷基。此外，可通过具有普通技能的蛋白化学技水人 员已知的保护基团，保护一个或多个側基或末端基团。可将氛基酸的 a-碳单甲基化或二甲基化。也可将PCNA-衍生肽与癌细胞中存在的细胞表面受体的 配体融合或连接。例如，将人转铁蛋白受体(hTfR)-—种细胞增殖的 标记用作治疗药物的靶，其在口腔癌、肝癌、胰腺癌、前列腺癌和其 它癌中表达至少100倍之多(Lee等，(2001年)"受体介导的结合人转铁 蛋白受体的肽的摄取"Eur. J. Biochem., 268: 2004-2012)。肽、 HAIYPRH和THRPPMWSPVWP特异性地结合hTfR，这些肽能将相关 的大分子靶向hTfR (Lee，同上)。这些肽结合位点不与天然配体Tf重 叠，在体内可用于将大分子靶向hTfR-阳性细胞中的内吞途径(Lee，同
上)。这样的肽也可用于靶向PCNA-衍生肽以增强肽递送，也进一步增 强特异性递送。合适的细胞渗透性肽或连接或融合caPCNA-衍生肽的肽 结构域的实例包括，例如衍生于某些蛋白的转导结构域如触足蛋白 (Antp)同源结构域的第三螺旋的小多碱基肽、RYIRS标记序列、 Penetratin (RQIKIWFQNRRMKWKK) 、 Tat (GRKKRRQRRRPPQ)、 Transportan (GWTLNSAGYLLGKINLKALAALAKKIL) 、 VP22 (DAATATRGRSAASRPTERPRAPARSASRPRRPVD)、两亲性肽(次级 和初级)、MAP (KLALKLALKALKAALKLA) 、 KALA (WEAKLAKALAKALAKHLAKALAKALKACEA) 、 ppTG20 (GLFRALLRLLRSLWRLLLRA)、三聚体(Trimer) (VRLPPP) 、 Pl (MGLGLHLLVLAAALQGAWSQPKKKRKV) 、 MPG
(GALFLGFLGAAGSTMGAWSQPKKKRKV) 、 Pep-1
(KETWWETWWTEWSQPKKKRKV) 、 hCT
(LGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP)及其它。用于癌的具体化學治疗剂包括紫杉醇、多西他赛、顺钩、 氨曱蝶呤、环磷酰胺、5-氟尿苷、亚叶酸、依立替康、紫杉醇、碳柏、 阿霉素、氟尿嘧咬碳铂、依达曲沙、吉西他滨或长春瑞滨或其組合。本文公开的肽也适合于进行放射疗法和任何其它形式的 癌症疗法的癌症患者。本文公开的肽抑制剂为合适的增欢剂，其可在 给予特殊癌症疗法如化学疗法或放射疗法之前、期间和之后给药。应理解，适合于使用本文公开的肽治疗的癌包括但不限于 恶性肿瘤如各种形式的成胶质细胞瘤、神经胶质瘸、星形细胞瘤、脑 膜瘤、成神经细胞瘤、成视网膜细胞瘤、黑素瘤、结肠癌、肺癌、腺 癌、宫颈癌、卯巢癌、.''膀胱癌、成淋巴细胞瘤、向血病、骨肉瘸、乳 腺癌、肝癌、肾瘤、肾上腺癌或前列腺癌、食道癌。如果恶性细胞表 达csPCNA同种型，本文公开的组合物能够干扰caPCNA同种型与一种 或多种蛋白的相互作用。
术语"肽;f莫拟物"或"肽拟似物"指具有包括非肽元件如非天 然氨基酸的小蛋白样链(肽)的化合物。设计和合成肽模拟物的目的为 与靶蛋白结合，以诱导或引起特殊的变化。 一般而言，肽;f莫拟物通过 模拟或拮抗其设计来模拟或拮抗的母体肽维构的关键相互作用来发 挥功能。肽模拟物一般没有典型的肽特征如酶可分裂的肽键。关亍用 于设计和合成肽拟似物的各种有用技术的一般纟率述，参见al-ObekJi等， (1998年)，"肽和肽才莫拟物库。分子多样性和药物设计"A勿/历c^c/wo/.; 9(3): 205-23 ;和 Houben-Weyl: 尸e/ "'tfes a"c/
尸e/ "(io附ewe"c^, Thieme Medical Publishers,笫4片反(2003)。在另 一个实施方案中，能够干扰ca(cs)PCNA相互作用的肽 包括以下氛基酸序列的肽，该氨基酸序列在LGIPEQEY的NH2木端上 包括约+3邻近或非邻近的其它氛基酸，在LGIPEQEY的COOH末端上 包括约+9邻近或非邻近的氨基酸。例如，这些肽中的一些包括氨基酸 序列VEQLGIPEQEY (+3画,2末端)、LGIPEQEYSCVVK (+5-COQH 末端)、LGIPEQEYSCVVKMPSG (+9-COOH末端)、EQLGIPEQEY (+2國NH2末端)、QLGIPEQEY (+1画朋2末端)、LGIPEQEYSCVVKMPS (+8-COOH末端)、LGIPEQEYSCVVKMP (+7國COOH末端)、 LGIPEQEYSCVVKM (+6-COOH末端)、LGIPEQEYSCVV (+4-COOH 末端)、LGIPEQEYSCV(+3-COOH末端)、LGIPEQEYSC (+2-COOH本 端)、LGEPEQEYS (+l-COOH末端)和LGIPEQEY侧翼的其它NH2和 COOH末端氨基酸的组合。包括产生csPCNA特异性抗体，但不影响肽 特异性的替换的M酸突变在本公开的范围内。可用氨基酸类似物或 非天然氨基酸替换肽中的一个或多个氨基酸残基。另外，基于本文公 开的肽序列开发的肽拟似物也可用于产生csPCNA同种型的抗体。 PCNA-衍生肽和其它PCNA-相互作用蛋白-衍生肽的剂量 取决于肽的效能、肽在体内的稳定性、给药方式、治疗的癌症的性质、 体重、患者年龄和技术人员共同认可的其它同素。例如，PCNA-衍生 肽药物的剂量可为约0.1-10.0微克(mcg)/kg体重或约0.2-l,0 mcg/kg体
重或约0.5-5.0 mcg/kg体重或约10.0-50.0 mcg/kg体重。取决于毒'f生效应 和杀肿瘤能力，剂量也可为约1.0-10.0 mg/kg体重和约0.1-1.0 mg/kg体重。可通过普通医师已知有效的任何途径给予本文公开的組 合物。外围的、肠胃外给药为合适的。在医学丈献中一般将肠胃外给 药理解为用无菌注射器将剂型注射进身体。外闺的肠胃外途径包括静 脉内、肌内、皮下和腹膜内给药途径。本文公开的组合物的静脉内、 肌内和皮下给药途径为合适的。对于肠胃外给药，可将本文公开的肽 与磷酸盐緩冲水溶液(PBS)或符合FDA关于人患者给药标准的任何合 适的无热原医药级緩沖液组合。当用于本文时，"药学上可接受的栽体 "包括任何和所有的溶剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散剂或悬浮助剂、 表面活性剂、等渗剂、增稠剂或乳化剂、防腐剂等，只要适合于期望 的净争歹朱剂型。"em/"gtow^尸/7C7 wacew"ca/ Sc/ewces,笫20版,A.Jl, Gennaro (Williams and Wilkins, Baltimore, MD, 2000)公开了用于配制 药物组合物的各种载体及其制备的已知技术。本文描述組合物的溶液 或悬浮液也可包括无菌稀释液，如注射用水、盐溶液、不挥发油、聚 乙二醇、丙三醇、丙二醇或其它合成溶剂；螯合剂，如EDTA;緩冲 剂，如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；和用于调节张度的试剂，如氣化 钠或葡萄糖。按照本领域标准实践，可将组合物的肠胃外制备封间在 玻璃或塑料制成的安瓿、 一次性注射器或多剂量小瓶中。可以小瓶容 纳冻千无菌粉末来贮藏本文公开的组合物以待重新组成，且未重新组 成的产品可贮藏在-20。C。
例如，可在盐水或任何合适的》爰沖液中将肽组合物稀释，直接静脉内 给予。例如，可将肽组合物包封在脂质体中，用任何合适的方法静脉 内给予。例如，可用本领域普通技术人员已知的延长释放药物递送系 统递送肽组合物。靶向肿瘤的其它方式也为合适的。例如，美国专利 申请公布US20050008572 (Prokop等)公开了与納米微粒胂瘤靶向和治
疗有关的方法和组合物，其公开内容通过引用结合到本文中。美国专
利申请公布US20030212031 (Huang等)公开了稳定的含脂质药物释放 复合物和其制备方法，其公开内容通过引用结合到本文中。
实施例1
caPCNA-衍生肽对乳腺癌细胞的细胞毒效应在培养基中将指数生长的乳腺癌细胞生长至汇合成片的 50%(

图1)。然后改变培养基，在进行处理细胞的流式细胞计分析之前， 在新鲜培养基中将由转染试剂(PJR)制备的脂质体和细胞一起再温育
24小时。脂质体包^p21 wafl蛋白的to区域和/或caPCNA抗原位 点肽(LGIPEQEY)。在24小时之后，用碘化丙锭和荧光标记的膜联蛋 白V抗体将细胞染色。健康生长的细胞对抗体为不可透过的，如闺l 的左下小图所示，而对转染试剂敏感但还在生长的渗透化健康细胞袜 碘化丙锭染色。用膜联蛋白V抗体染色的细胞表明一定水平的损害, 该损害与凋亡细胞的诱导(图l右下部)和/或死于凋亡或坏死的细胞(图 l右上部)有关。这些结果表明用盐水处理的对照细胞产生与第1左上小 图有关的流量剖面(flowprofile)(图1)。只用转染试剂处理的细胞轻微 地影响细胞的状况，引起凋亡和坏死细胞数目的轻微增加。用p^细 胞毒性肽片段处理的细胞表现出诱导的细胞杀灭(闺l右上小图)，用 caPCNA肽处理的细胞显示强烈的细胞毒性反应，大部分健康生长的 细胞被损伤，处于经历凋亡或细胞死亡的过程中。caPCNA肽与lOOpM 阿霉素组合，在测定时期内引起几乎90%的细胞杀灭。另外，约5-7% 的剩余细胞显现出正经历凋亡和将要死亡。用低剂量的阿霉素处理的 细胞引起显著水平的细胞杀灭，caPCNA肽与该剂量的阿霉素组合引 起协同效应，该协同效应引起几乎所有的被分析细胞死亡。在该药物 的亚致死浓度下，将细胞暴露于一组低浓度的肽中，显著提高阿霉素
的致死率。
实施例2
与nmPCNA相比，XPG-GST融合蛋白优先与caPCNA结合早期尝试选择性地分离和純化caPCNA没有成功。通过使 用固定化XPG-GST融合蛋白系统作为caPCNA純化的亲和性基质克 服了该问题(图2)。通常純化PCNA利用的技水是在磷酸纤维素、苯 基琼脂糖和Q-琼脂糖基质上使用层析步骤，导致在蛋白流份里两个同 种型一起存在。为分离两个PCNA同种型，将固定化的XPG-GST融 合蛋白片段加入包含纯化设计的亲和柱(闺3)。由于两个PCNA同种 型融合蛋白XPG部分结合亲和力的差别，该方法导致从mnPCNA中 有效纯化caPCNA。随后亲和柱(XPG-GST)的流通和洗脱液的 2D-PAGE分析表明碱性PCNA同种型存在于非恶性细胞中 (nmPCNA)，在亲和柱的流通中发现该同种型，而酸性(c^PCNA)同种 型在从柱洗脱的流份中回收(图2)。为了合成体的纯化，对MCF7细胞(人乳腺癌细胞系)提取 物进行处理。然后使MCF7衍生的合成体经历在磷酸纤维素、苯基琼 脂糖和Q-琼脂糖基质上的层析步骤，如(Malcas， L.和Hickey, R. (1996), 乳多空病毒复制过程中涉及DNA聚合酶的表达、純化和表征。在 Methods in Enzymol Vol. 275:病毒聚合酶和关联蛋白，学会出版社 (133-167))描述的。然后将咮^有nmPCNA和caPCNA两个同种型的Q-琼脂糖洗脱的流份装在XPG-GST亲和柱上，洗脱柱子，使柱于的流 通和洗脱物都经受利用PC10抗体的2D-PAGE蛋白质印迹分析。在蛋 白质印迹分析中以1: 1000的稀释度使用PC10批体。用XPG-GST融合蛋白，将caPCNA从MCF7细胞提取物 中特异性免疫沉淀(图3)。将30微克MCF7细胞提取物样品与 XPG-GST融合蛋白一起温育两小时，接着与谷胱甘肽琼脂糖珠一起 温育1小时，以捕获XPG-GST。然后离心混令物，收集珠、上清夜和含有XPG-GST的琼脂糖珠沉淀物。PCNA复合物经受2D-PAGE蛋 白质印迹分析。利用市售的PC10抗伴探测进行蛋白质印迹。如图3 所见，能够容易地识别XPG-GST，并且选择性从MCF7乳腺癌细胞 提取物中沉淀caPCNA,在上清液部分中留下nmPCNA同种型。实施例1描述了 caPCNA衍生肽对癌细胞细胞毒性的影 响。caPCNA上的caPCNA衍生肽位点可用作备种关键蛋白中任一种 适合的分子锁，例如XGP (着色性干皮病G蛋白)。当它们与PCNA 相互作用时，这些相互作用的蛋白用作钥匙用于活化特有的细胞过 程，例如DNA修复、细胞周期关卡调拉等，通过干扰这些蛋向与PCNA 的结合获得的治疗益处，与癌症特异性和正常细胞PCNA同种型之间 结合位点的结构差异有关，如固定化XPG-GST融合蛋白片段优先结 合到caPCNA所证明。癌细胞对这样的干扰敏感，因为结合位点暴露 在caPCNA上，但在nmPCNA同种型上隐藏，当竟争肽存在或结令 位点对恶性和非恶性细胞类型之间不同的结合蛋白有亲和性时，该结 合位点不可得到或不易接近。结合到caPCNA"锁"的"钥匙"的用途，即在相互作用细胞 内蛋白的区域或结构域或表位也可以用作潜在的治疗剂和潜在的治 疗靶。如图2-4提供，以融合到谷胱甘肽-S-转移酶基因产物(即GST》 的XPG蛋白片段的形式，证明了这些蛋白中之一选择性结合到 caPCNA上的该位点的证据。该方法的原理是基于肽模拟物(基于 caPCNA的抗原位点)能通过阿霉素提高癌细胞杀灭的观察。对于结合 到caPCNA的蛋白而言，这可能发生是由于对应于该抗原位点的肽直 接同caPCNA竟争，或在它们与caPCNA締令之前，通过该结合位点 (caPCNA的aa 126-133)结合到一个或多个同PCNA相互作用的特异性 蛋白。在任一方案中，该肽阻止这些蛋白中的一个或多个同caPCNA 上其补充结合位点締合。该竟争或不同的结合又干扰由该蛋白-蛋白相 互作用介导的特有细胞过程，例如核苷酸切除修复途径。闺2表示癌 症特异性PCNA(caPCNA)同种型选择性结合到亲和柱上，该亲和柱通
过将XPG蛋白的29个氨基酸片段偶联到谷胱甘肽-S，转移酶，在细菌 中表达该融合蛋白制备。在合适的结合条件下亲和柱与caPCNA结合。 通过緩冲液中NaCl的浓度从300 mM减少到0 mM来完成结合的 caPCNA的洗脱。该数据证明XPG-PCNA相互作用可以用于选择性结 合caPCNA同种型。图3为caPCNA特异性结合到作为XPG-GST融 合产物部分表达的XPG片段提供了进一步证据。该数据证明 XPG-GST蛋白用于仅选择性结合和沉淀caPCNA同种型，同时允许 nmPCNA同种型留在溶液中。随后通过固定化XPG-GST融合蛋白选 择性结合蛋白的2D-PAGE分析，接着用PCNA选择性抗体进行蛋白 质印迹分析，来证明癌症特异性PCNA (酸性)同种型特异性结合到闺 定化XPG-GST融合蛋白；而将未结合的nmPCNA同种型留在溶液中。 图4表明可将XPG-GST融合蛋白用作引起组织提取物中存在的 caPCNA的捕获和量化的初始试剂。ELISA结果显示XPG-GST从细 胞提取物和可能从患者血清样品(如果存在)捕获caPCNA,使由患癌 症个体或接受癌症治疗的个体表达的caPCNA的有效监控成为可能。这些caPCNA衍生的和caPCNA相互作用蛋白衍生的特异 性蛋白和肽片段是有用的诊断工具和有价值的治疗剂。另外，这些肽 片段也通过干扰蛋白-蛋白相互作用以及caPCNA上的抗原位点例如 氨基酸126-133，来干扰细胞生长和癌细胞增殖。
实施例3
用于检测caPCNA的XPG-GST融合蛋白基ELISA测定法的发展
的緩冲液一起温育30分钟，然后 在405nm处读取溶液的吸光度。仅含有nmPCNA的MCF10A细胞提 取物产生向在少于1 ing/ml提取物饱和的肴色产物的低水平ABTS转 化。相反，在相同的提取物浓度下，含有含caPCNA和nmPCNA两 者的MCF7细胞提取物的ELISA反应(Bechtel,同上)产生3传多的着 色产物，在该反应中甚至用3倍多的细胞提取物都没有逸到饱和。含 有MCF10A和MCF7细胞提取物的反应之间的吸光度差,表示在 MCF7细胞提取物中存在的caPCNA的量。
实施例4
PCNA 126-133肽相互作用的特异性图5显示ELISA的结果，其中将caPCNAab结合到板上， 并用于捕获分离的caPCNA。洗涤孔，然后与识别PCNA的C末端20 个氨基酸的山羊抗-PCNA抗体(C20)—起温育。用碱性磷酸酯酶缀合 的抗山羊IgG抗体使结合的C20抗体显色，用对硝基苯酚磷酸酯使结 合的抗体复合物显色，并且由分光光度法来量化。在该测定中，竟争 实验显示该研究涉及ca(cs)PCNA和递增量的caPCNA的抗原肽片段 (称为Bl或PCNA aa 126-133肽)同时温育。显示在递增浓度的肽B1 存在下，caPCNA整个分子的绪合减少，并且证明ELISA测定对于由 该肽序列定义的caPCNA抗原表位的识别是特异性的。在图5中描述的测定用于测试由PCNA aa 126-133定义的 抗原表位的抗体结合部位的特异性(图6)。如目标(aim) 1所描述进行 ELISA测定，然而Bl肽或取自酵母肌球蛋白内的肽序列(H-Ser-Ala-Cys-Glu國Gln-Ile-Leu画Lys-Asp-Thr陽OH)用 于在纯化的caPCNA 存在下竟争抗体。如图5显示，Bl肽有效地竟争抗体结合部位，而不
相关的酵母肌球蛋白肽(MAL4)没有与caPCNA竟争结合到caPCNAab 上，并且没有减少与结合到板上的固定化caPCNAab结合的PCNA的 量。这些数据证明抗体结合部位对Bl肽定义的caPCNA上抗原表位 的特异性。本文描述的ELISA用于监测两个肽干扰caPCNA与结合 的caPCNA抗体结合的能力。在该测定中，评价了对应于同PCNA相 互作用的 p21cip/wafl 蛋白部位的 一 个肽 (H-Gly画Arg-Lys-Arg-Arg-Gln-Thr-Ser-Met-Thr-Asp画Arg画Tyr-His-Ser-Ly s-Arg-Arg-Leu-Ile-Phe-Ser-OH)，在该ELISA测定中显示该肽对 caPCNA与结合的caPCNA抗体的结合无影响(图7)。对应于XPG蛋 白的XPG-PCNA 相互作用偉点的另 一 个肽
(H-Gln-Thr-Gln-Leu-Arg-Ile-Asp-Ser-Phe画Phe-Arg-OH)与純化的
caPCNA有效的竟争结合到cPCNA抗体，并且与在该竟争测定中使用 的XPG肽的量成正比，显著减少测定中着色底物的产生。XPG肽本 身不与caPCNA抗体相互作用，因为它与抗原肽不相关。因此，为了 阻断PCNA蛋白与caPCNA抗体的结合，XPG肽与其识别的PCNA 结合位点相互作用。如果由抗体识别抗原表位，该发生将通过特异性 结合该XPG肽而掩蔽。该数据表明caPCNA肽(aal26-133)和同PCNA 内的特异性位点相互作用的肽，例如XPG肽和其它已知的PCNA结 合配偶体，都可通过其有规则的结合配偶体干扰PCNA的识别，和根 据这些蛋白-蛋白相互作用潜在地干扰细胞功能。
实施例5
PCNA同种型部分II: XPG特异性结合csPCNA之间的功能差别
制备XPG-GST琼脂糖柱，随后使用该拉拆分MCF7乳腺 癌细胞核提取物。基于XPG-PCNA结合条件使用柱流通、柱洗涤和 洗脱物条件。亲和(XPG-GST)柱的流通+洗涤和洗脱液蛋向流份的 2D-PAGE分析显示，在XPG-GST琼脂糖柱流通+洗涤流份中发现存
在于非恶性细胞的碱性PCNA同种型(nmPCNA),而酸性PCNA同种 型csPCNA在柱的洗脱液蛋白流份中回收(闺8A)。用PC10和 csPCNAab抗体进行XPG-GST柱流份的1D-PAGE蛋白质印迹分析(图 犯)。它显示csPCNAab仅识别包含在XPG-GST琼脂糖拉洗脱液流份 的PCNA同种型，表明在用于拆分柱的条件下，XPG优先结合 csPCNA,对于已知的PCNA结合配偶体，PCNA同种型有不同的亲 和力。
表1:含有PCNAaa 126-133区域的肽结构域。
PCNA岸列1""W"
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PCNA序列t2l!5T " " ^
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PCNA序列126W
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PCNA ^>列126^"
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PCNA序列126-163 7"_
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含有126-133结构域的区i^如下划线所示,
权利要求
1. 一种用于减少恶性细胞的细胞增殖的治疗用组合物，所述恶性细胞表达癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种型，所述组合物包含肽分子，所述肽分子包含氨基酸序列LGIPEQEY，其中所述肽特异性抑制PCNA与一种或多种蛋白的相互作用。
2. 权利要求l的组合物，其中所述肽分于为合成分子。
3. 权利要求l的组合物，其中所述肽分于为细胞渗透性的。
4. 权利要求l的组合物，其中所述肽包含易位序列，
5. 权利要求l的组合辨，其中所述肽具有蛋白酶抗性。
6. 权利要求l的组合物，所述组合物包食化学治疗剂。
7. 权利要求6的组合物，其中所述化学治疗剂选自阿霉素、紫杉 醇、多西他赛、顺铂、datrexate、吉西他滨或长春瑞滨或其组合。
8. 权利要求l的组合物，所述组合物包^^旨质体。
9. 权利要求1的组合物在选择性抑制癌症特异性増殖细胞核抗 原(caPCNA)同种型与恶性细胞中胞内蛋白的相互作用中的用途，所述 用途包括(a) 提供权利要求1的组合物，所述组合物选择性干扰所述 caPCNA与所述胞内蛋白的相互作用；(b) 给予所述组合物，以使所述药物与癌细胞群体接触；和(c) 抑制caPCNA与所述胞内蛋白的相互作用。
10. 权利要求9的用途，其中经静脉内给予所述组合物。
11. 权利要求9的用途，其中所述caPCNA与所述胞内蛋白的相 互作用涉及细胞过程，所述细胞过程选自DNA合成、DNA修复、重 组、转录、细胞周期关卡调控和凋亡。
12. 权利要求1的组合物在减少恶性细胞的增殖中的用途，所述 恶性细胞表达癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种型，所述用途 包括 (a) 提供权利要求1的组合物，所述组合物选择性干扰所述 caPCNA与胞内蛋白的相互作用；(b) 给予所述组合物，以使所述药物与癌细胞群体接触；和(c) 减少恶性细胞的增殖。
13.权利要求1的组合物在增强癌症的癌症治疗中的用途，所述 癌症表达癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA)同种型，所述方法包 括(a) 提供权利要求1的组合物，所述组合物包含癌症的化学治疗剂；(b) 给予所述包含化学治疗剂的组合物，以使至少一部分所述药物 与癌细胞群体接触；和(c) 与由单独的化学疗法杀灭的癌细胞数目相比，通过增加癌细胞 的死亡或通过降低癌细胞的增殖潜力，来增强癌症治疗。
全文摘要
得自癌症特异性增殖细胞核抗原(caPCNA，也称为csPCNA)同种型或得自nmPCNA-相互作用蛋白的肽，干扰胞内蛋白-蛋白相互作用，因此引起癌增生潜力的降低。这些肽用作治疗用组合物，以减少癌细胞的增殖，也增强现有的化学疗法。
文档编号C12N15/09GK101384618SQ200780005289
公开日2009年3月11日 申请日期2007年2月16日 优先权日2006年2月17日
发明者L·H·马尔卡斯, R·J·希基 申请人:印第安纳大学研究及科技有限公司