专利名称：季节性流感病毒h1n1实时荧光定量pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种快速定量检测季节性流感病毒Hmi核酸的实时荧光定量PCR检 测方法及试剂盒，属于生物医学技术领域。
背景技术：
流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，其流行特点是传播迅速，波 及范围广。迄今为止，流感病毒已引起四次世界流感大流行，给人类社会的经济及健康造成 了巨大损失。流感病毒属于正黏病毒科，其基因组为分节段负链RNA，根据病毒核衣壳蛋白 (NP)和基质蛋白(M)不同可分为甲、乙、丙三种型别，均可感染人。甲、乙型流感病毒是人群 中主要的流行病毒，甲型流感病毒根据病毒表面血凝素抗原的不同分为16个HA亚型；根据 神经氨酸酶抗原的不同分为9个NA亚型。甲型流感病毒中的Hmi亚型曾经引起世界流感 的大流行。自1997年以后，HlNl亚型与H3N2亚型交替在人群中流行。从2002开始我国 的流感一直由H3N2占优势，持续了近3年后，2005年的9月以后Hmi亚型流感毒株重新成 为我国的流感流行的优势毒株。流感病毒的实验室诊断方法包括病毒细胞培养、血清学珍断以及抗原检测。病 毒通过感染敏感的组织细胞可以被分离鉴定出来，这可以作为流感病毒感染最直接，最可 靠的依据。另外，急性期血清较恢复期血清抗体有4倍增加也是流感病毒感染的标准。但 是两者耗时，一般来说细胞培养需要3 4d，血清学检查需要半个月。这一缺陷限制了其 在临床上的快速诊断。抗原的直接检测包括了对病毒结构蛋白以及核酸的检测。病毒结 构蛋白的检测基于抗原抗体的反应、偶联酶或者化学生色原或者荧光染料，包括免疫荧光 (Immunofluorescence, IF)、酶联免疫吸附试验(Enzyme linkedimmunosorbent assays, ELISA)，直接或间接免疫荧光试验的敏感度波动在40 % 100 %，特异性在86 % 99 %，但 是由于需要荧光显微镜特殊仪器而限制了其在临床上的应用。目前对流感病毒抗原核酸的最优检测手段是实时荧光定量聚合酶链式反应 (Real-time PCR)，它将高灵敏性、高特异性和高准确性结为一体，克服了传统PCR费时、易 污染、低通量等缺点，可对样本中的流感病毒核酸进行准确的定量检测。从目前的文献及专 利的查询结果得知，尚未有关于季节性流感病毒Hmi的实时荧光定量PCR检测的方法及试 剂盒的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种操作简单、应用方便的季节性流感病毒Hmi实时荧光 定量PCR的检测方法及试剂盒。为达到该目的，本发明采取如下技术方案一、针对季节性流感病毒Hmi的特异性引物的设计与合成本发明选择季节性流感病毒Hmi的保守基因N基因作为检测靶目标，首先从GenBank数据库中下载季节性流感病毒H1N1、H3N2、高致病性禽流感病毒H5W、新型甲型 HlNl病毒等代表株的N基因全序列，使用ClustalW软件进行序列同源性比对分析，筛选出 季节性流感病毒Hmi特异性的保守序列作为引物候选区域。应用Primer Express及Primer Premier 5. 0软件包对候选引物进行进一步配对 及筛选，得到最优特异性检测引物。引物设计及挑选遵循下列原则1.选用的引物位于季节性流感病毒HmiN基因的保守区，与新型Hmi、H3N2、H5m 等其他毒株无交叉反应。2.引物长度为18-25个碱基。3.引物的 GC%要求在 40%-60%，理论 Tm > 50° "C。4.引物自身之间尽可能避免碱基配对。5.扩增的目的片段长度介于100_500bp之间。据此，本发明最终采用的特异性检测引物序列如下SF-F :5，-ctgagaagcagatactgggc-3，SF-R :5，-ctgcattgtctccgaagaaat-3，二、季节性流感病毒Hmi检测标准品的制备1. 24孔细胞培养板培养的MDCK细胞接种季节性流感病毒Hmi代表株48小时后， 取100 μ 1细胞培养上清，按照RNeasy Mini Kit(Qiagen公司，货号74104)说明书提取病 毒 RNA。2.按照SuperScript III First-Strand Synthesis System(Invitrogen公司，货 号18080-051)说明书合成病毒第一链cDNA。3.基于NP基因5，及3，端序列设计并合成PCR引物，由病毒全长cDNA扩增出NP基因。4.琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况，结果显示除1497bp的特异性条带外， 还出现另外至少3条非特异性条带。5.对1497bp的目的条带进行切胶回收及纯化。6.对回收后的NP全长基因进行核酸浓度测定，并换算成拷贝数。
6.02xl023 (copies/mol) XDNA浓度(g/μ )
拷贝数(copies/μ )=-
DNA分子质量(g/mol)三、实时荧光定量PCR标准曲线的建立及灵敏度、特异性检测1.将计算好拷贝数的标准品做10倍梯度稀释，从lXliTcopies/y 1稀释至 IX IO2Copies/μ 1，共 9 个梯度。2.配置Real-time PCR Mix，按顺序依次加入
权利要求
一种季节性流感病毒H1N1实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于包含一对特异性引物和检测标准品，引物序列为SF F5’ ctgagaagcagatactgggc 3’SF R5’ ctgcattgtctccgaagaaat 3’
2.按照权利要求1所述的季节性流感病毒Hmi实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征 在于经以下步骤制备而成(1)选择季节性流感病毒Hmi的保守基因N基因作为检测靶目标，应用ClustalW软 件进行序列同源性比对分析，筛选出季节性流感病毒Hmi特异性的保守序列作为引物候 选区域，然后应用Primer Express及Primer Premier 5. 0软件包对候选引物进行进一 步配对及筛选，得到最优特异性检测引物，引物长度为18-25个碱基，引物的GC%要求在 40% -60%，理论Tm > 50°C，扩增的目的片段长度介于100_500bp之间。(2)基于NP基因5’及3’端序列设计并合成PCR引物，由病毒全长cDNA扩增出NP基 因，琼脂糖凝胶电泳检测NP基因的扩增情况并对目的条带进行切胶回收及纯化，然后对回 收后的NP全长基因进行核酸浓度测定，并换算成拷贝数，作为定量标准品。
3.根据权利要求2所述的季节性流感病毒Hmi实时荧光定量PCR检测试剂盒，其特征 在于，所述步骤(2)的优选条件为引物长度为22个碱基，引物引物的GC%要求在50%，扩 增目的片段长度为340bp，退火温度为55°C。
4.按照权利要求1所述的试剂盒，其特征在于RNA提取试剂盒为RNeasyMini Kit，逆 转录试剂盒为 SuperScript III First-Strand Synthesis System,实时焚光定量PCR mix 为SYBR Green PCR Master Mix，实时荧光定量PCR仪为ABI公司St印One机型。
全文摘要
本发明公开了一种检测季节性流感病毒H1N1的实时荧光定量PCR试剂盒，包括正反向特异性引物及检测标准品等，同时公开了待检样本的处理，Real-time PCR反应体系及反应条件，结果分析等方法。利用该试剂盒可以快速定量检测季节性流感病毒H1N1，灵敏度高，可用作基础及临床实验室对季节性流感病毒H1N1感染的辅助诊断方法和临床效果的监测手段，对实验操作者要求相对较低，具有实际的临床应用价值。
文档编号C12Q1/70GK101948934SQ20101027868
公开日2011年1月19日 申请日期2010年9月13日 优先权日2010年9月13日
发明者秦川, 许黎黎, 鲍琳琳 申请人:中国医学科学院医学实验动物研究所