一种禽流感和新城疫病毒同步检测试剂盒及检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于病毒检测技术领域，主要涉及禽流感H7亚型和新城疫病毒双检引物 的设计、检测方法的建立及试剂盒组装。
【背景技术】
[0002] 禽流感和新城疫是世界范围内公认的对养殖业最具毁灭性打击的两种禽病毒病。 两种病毒均可导致禽类严重的呼吸系统感染和死亡率。禽流感与新城疫病的暴发与野生禽 类传播有关，能够导致人类感染，例如结膜炎和流感样综合征等。
[0003] 禽流感（Avian influenza，Al)是由正粘病毒科A型流感病毒引起的一种禽类的 烈性传染病。自1978年在意大利的鸡群中首次发现本病以来，已在美洲、欧洲等世界上许 多国家和地区发现有本病流行。我国自1995年首次报道禽流感发生以来，每年都有禽流感 发生的报道，尤其是低致病性禽流感在我国的流行几乎呈常态化。近几十年，不断有LPAIV 和HPAIV感染人的报道，均是由禽直接传给了人，并没有病毒能在人群中有效传播的证据。 LPAIV H7感染人的临床症状表现为轻微的呼吸道症状或是结膜炎，而人感染HPAI H7亚型 病毒可引起严重疾病甚至死亡（fouchier RA etal，2004，Arzey GG etal，2012)。早在1902 年造成鸡瘟的高致病性病原，于1955年确定并更名为高致病性H7N7亚型禽流感。近几年 来，H7亚型AIV已经造成超过七千万家禽的死亡，波及到巴基斯坦、澳大利亚、爱尔兰、加拿 大、德国、智力、荷兰、以及美国等地，暴发亚型较多，包括LPAI H7N1、H7N3、H7N4、H7N7、以及 LPAI H7Nl、H7N2、H7N3、H7N8、H7N9(Peiris M etal，1998;Chan PK etal，2002;Puzelli S etal，2005 ;Malik JS etal，2012)。不同谱系的病毒均出现过感染人的时间，2013年3月中 国出现了 H7N9感染人并致人死亡事件。H7N9亚型禽流感最早在西班牙野鸟（绿翅鸭）中 分离，试验证明这是一中低致病性的亚型，毒株为A/Anascrecca/Spain/1460/2008 (H7N9)。 2002年哈兽研的陈化兰等在中国北部河北省家禽屠宰场鸡常规口咽部拭子中分离检测到 H7N2 禽流感病毒，A/chicken/Hebei/l/2002(CK/HB/l/02)。
[0004] 新城疫病毒的基因组不分节段，编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白NP、磷酸化蛋白 P、基质蛋白M、融合蛋白F、血凝-神经氨酸酶蛋白HN以及具有RNA依赖性的RNA聚合酶 蛋白L。以往普遍认为该裂解位点的氨基酸序列及裂解能力是NDV毒力的惟一决定性因素 (Dortmans J C etal，2009)。不过近年来的研宄表明F蛋白的裂解能力并不是NDV毒力的 惟一决定性因素。经NDV结构蛋白多肽指纹图谱分析发现，有NDV毒株NP、P和L蛋白分 子结构基本一致，而F和HN蛋白氨基酸在不同毒株间却存在较大差异，并且毒力差异越大， 其F和HN蛋白氨基酸差异也越明显[Palmieris SM etal，1988]。国内外对F基因和HN基 因研宄较多，并测定出了多个NDV强、弱毒株F基因和HN基因的核苷酸序列.NDVHN蛋白能 特异识别宿主细胞表面靶受体，与靶受体结合并能水解病毒粒子囊膜表面糖链末端的唾液 酸。HN蛋白具有抗原性、HA活性和NA活性，并且与F蛋白具有协同作用，因此HN蛋白是 NDV毒力和特性的重要蛋白（曹殿军等，1998)。HN蛋白是一种既有血凝素（HA)活性又有 神经氨酸酶（NA)活性的糖蛋白，是NDV重要的毒力蛋白和保护性抗原。HA活性能够使病毒 吸附到对应靶细胞的受体上，NA活性则破坏细胞受体，从感染细胞表面释放病毒粒子。同 时HN蛋白还能够促进膜融合，吸引F蛋白充分接近该位点，继而启动病毒与细胞膜融合。
[0005] 两种病毒的同时检测已有大量科研人员进行了研宄，RT-PCR是最常用的一种快速 检测方法（梁成珠等，专利号200510042527. 1，孙涛等，专利号201010128875. 1，刘永生等， 专利号200810081497. 9,谢芝勋等，2008,刘海鹏等，2003,于洋等，2006,杨旭芹，2005)，其 次是高通量的基因芯片方法（薄清如等，专利号201110078639.8,田丽娜等，2008,吴时友 等，2005) 〇
[0006] 80年代中期，人们建立了聚合酶链式反应技术（polymerase chain reaction， PCR)，将DNA扩增过程缩短到了 2h?3h，使得分子克隆技术得到了突破性的改进。2000年 Notomi等建立了一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术：环介导的等温扩增技 术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP)。该技术依赖于自动循环的链置换 反应，在等温条件下，不到Ih就能扩增出IO9靶序列拷贝。LAMP法具有许多迄今为止的扩 增方法所无法比拟的优点。（1)只需一恒定温度就能扩增反应。不需要特殊试剂，不需要 预先进行双链DNA的变性；（2)高特异性：应用6个区段、4种引物，并且这6个区段的顺序 也有规定。因此，LAMP法扩增的特异性很高，可以根据是否扩增就能判断目标基因的存在 与否，对疾病定性检测；(3)快速、高效扩增：整个扩增在不到60min即可完成，且产率可达 到0. 5mg/ml。若在引物上再进一步改进，可大大提高其扩增效率，扩增时间在原来的基础 上减少1/3?1/2 ;⑷灵敏度高：扩增模板可达1?10拷贝；(5)步骤简单：扩增RNA只 要在DNA基因扩增试剂的基础上加上逆转录酶，就能够完全像DNA基因扩增那样，一步实现 RNA扩增；(6)鉴定简便：对PCR产物进行荧光标记，在核酸大量合成时，只要用肉眼观察即 可获得结果，也可利用现有的荧光定量PCR仪作荧光检测。诸多试验结果表明，该方法灵敏 度是普通PCR方法的100倍，根据鉴定体系的不同，可通过肉眼观察有无荧光或沉淀直接判 定结果（pham HM etal，2005;Dukes JP etal，2006;孔令辰等，2007;赵彦宗等，200%杨睿 等，2011)。
[0007] 自从LAMP检测方法建立以来，研宄人员利用其检测了 RNA、DNA病毒，如犬瘟 热（Cho HS etal，2005)、新城疫病毒（孔令辰等，2007;pham HM etal，2005;Imai etal， 2006;)、重急性呼吸综合症冠状病毒（SARS) (Poon LL etal，2004)，人类疱瘆病毒的检测 (Okamoto S etal，2004)、禽流感病毒（Imai M etal，2006,李靖等，2005，P oon LL etal， 2005)、口蹄疫病毒（Dukes JP etal，2006)、蓝耳病病毒（赵彦宗等，2009)、猪瘟病毒（刘中 勇等，2010)、圆环病毒（何选民等，2009)、伪狂犬病毒（杨睿等，2011)、细小病毒（尚毅等， 2011)等，细菌病原体（Ihir