检测金鱼造血器官坏死病病毒的试剂盒及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧 光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行金鱼造血器官坏死病病毒检 测的方法和试剂盒。
【背景技术】
[0002] 金鱼造血器官坏死病病毒（goldfish haematopoietic necrosis virus, GFHNV)， 也称为鲤疱疫病毒-2 (cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)，是金鱼造血器官坏死病 (goldfish haematopoietic necrosis，GFHN)的病原，是一种感染金鱼（Carassius auratus)、鲫（Carassius auratus)及其变种的高致病性双链DNA病毒。该病毒曾在日本、 澳大利亚、新西兰、英国、匈牙利及我国台湾爆发疫病，发病金鱼死亡率可达100%。
[0003] 目前，国内外缺乏对GFHNV敏感的细胞系以及抗GFHNV的抗体，因此无法使用病 毒分离和免疫学方法检测该病毒。对该病毒的检测方法的研究主要集中于建立分子生物学 检测方法检测病毒核酸，包括PCR方法、荧光定量PCR方法和环介导等温扩增技术（LAMP) 检测方法。
[0004] 目前报道的针对GFHNV的PCR检测方法，其检测限低于荧光定量PCR检测方法和 LAMP检测方法，而且需要对扩增产物进行凝胶电泳才能观察结果，易造成溴化乙锭污染； LAMP检测方法如果反应时间过长，容易产生假阳性，且由于产物过多，也容易造成核酸污 染；目前报道的某些荧光定量PCR检测方法不稳定，检测结果有时会产生假阴性。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物和探针。
[0006] 本发明的另一个目的在于提供检测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR方 法及其试剂盒。
[0007] 为实现上述目的，本发明对已知金鱼造血器官坏死病病毒特异基因的DNA序列进 行比对，筛选出金鱼造血器官坏死病病毒基因的特异序列，即GFHNV主衣壳蛋白（MCP)基因 中一段保守序列（2307-2464)，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 本发明提供用于检测金鱼造血器官坏死病病毒上述特异序列的引物，以及与所述 引物配合使用的荧光探针。其中，探针5'标记荧光基团FAM，3'标记TAMRAN。该特异引物 扩增产物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 在本发明的一个实施方式中，优选的引物序列为：
[0010] 上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT (SEQ ID NO. 2)
[0011] 下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO. 3)。
[0012] 荧光探针序列为：
[0013] 5'-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQ ID NO. 4)。
[0014] 本发明提供了上述引物和荧光探针在制备检测金鱼造血器官坏死病病毒试剂盒 中的应用。
[0015] 本发明提供一种金鱼造血器官坏死病病毒的实时荧光定量PCR检测方法，包括以 样品总DNA为模板，利用本发明提供的引物和探针进行实时荧光定量PCR，同时设立无模板 对照和阳性对照，根据扩增曲线判定结果。
[0016] 本发明的实时荧光定量PCR扩增反应体系，当为25 μ L反应体系时，其优选配置 为：
[0017] 试剂 体积（μ?ν) IOxPCR Buffer ( 15mM MgCl2) 2.5 dNTP (2.5mM each) 2.0
[0018] Tag polymerase ( 5U ) 0.5 上游引物（lOpmol/ul) 1.5 下游引物（lOpmol/ul) 1.5 探针（lOpmol/ul ) I DNA模版 I MgCl2 ( 25mM ) 2 CldH2O 丨3 。
[0019] 本发明的实时荧光定量PCR的反应程序为：95°C预变性3min，I个循环；95°C变性 30s，55?65°C退火30s，40个循环。
[0020] 本发明优选的实时荧光定量PCR的反应程序为：95°C预变性3min，1个循环；95°C 变性30s，59 °C退火30s，40个循环。
[0021] 本发明每次检测标本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照为有效扩 增时，样本结果判断标准如下：
[0022] Ct值彡38. 0时样品结果为阳性；Ct值> 38. 0的样品结果为阴性。
[0023] 本发明提供了 一种用于金鱼造血器官坏死病病毒检测的试剂盒，其包括上述能特 异地扩增出如SEQ ID NO. 1所示核苷酸序列或其特异性片段的引物以及配合引物使用的 Taqman 探针。
[0024] 本发明试剂盒的所用引物序列为：
[0025] 上游引物：CAAACCCAGCACCGTCAGATGGT(SEQ ID NO. 2)
[0026] 下游引物：ATCCGGCACAGGTGGCGTGT(SEQ ID NO. 3)。
[0027] 突光探针序列为：
[0028] 5,-FAM-TTGGATCTGCTGCGCCCTGTTTGACAG-TAMRAN(SEQ ID NO. 4)。
[0029] 本发明提供的试剂盒，还包括DNA裂解液，荧光定量反应液，阴性模板和阳性模 板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为金鱼造血器官坏死病病毒基因组DNA。
[0030] 本发明提供了用于检测金鱼造血器官坏死病病毒的特异性引物和探针，建立了检 测金鱼造血器官坏死病病毒的荧光定量PCR方法，具有很高的检测灵敏度，可以检测到100 个拷贝的金鱼造血器官坏死病病毒DNA ;该方法特异性强，其重复性好，可作为检测临床标 本的手段，提高金鱼造血器官坏死病病毒检测的阳性率，操作简单，检测过程仅需90分钟， 大大缩短检测周期，检测结果使用荧光定量PCR仪直接观察，不存在溴化乙锭污染的问题。 本发明提供的检测试剂盒，其反应体系包含了上述引物、探针和阴性、阳性对照，该试剂盒 的推广应用将为防治和监测金鱼造血器官坏死病病毒病提供技术支持。
【附图说明】
[0031] 图1为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR特异性评价，图中曲线为金鱼造血 器官坏死病病毒的反应曲线；
[0032] 图2为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测限测定（1)，图中4-10号曲线， 分别依次对应DNA模板量为IO4拷贝-IO ltl拷贝的反应体系扩增出的反应曲线。
[0033] 图3为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR标准曲线（1)
[0034] 图4为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR检测限测定（2)，图中1-5号曲线， 分别依次对应DNA模板量为IO 1拷贝-IO5拷贝的反应体系扩增出的反应曲线。
[0035] 图5为金鱼造血器官坏死病病毒荧光定量PCR标准曲线（2)
【具体实施方式】
[0036] 以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离 本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明 的范围。
[0037] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0038] 实施例1金鱼造血器官坏死病病毒特异性引物和探针的设计
[0039] 对已知金鱼造血器官坏死病病毒特异基因的DNA序列进行比对，筛选出金鱼造 血器官坏死病病毒基因的特异序列，即GFHNV主衣壳蛋白（MCP)基因中一