一种快速检测甘蔗属spsb基因多态性的方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种检测甘蔗属SPSB基因 (JN584485)多态性的方法，及其在甘蔗糖分性状的标记辅助选择育种中快速建立遗传优良 的甘蔗种质的应用。
【背景技术】
[0002] 甘蔗是复杂的异源多倍体植物，细胞核内含有多套染色体组，在甘蔗杂交育种中 主要以甘鹿属热带种（Saccharum. officinarum L )，、甘鹿细莖野生种（又称割手密） (Saccharum spontaneum L·)、甘鹿大莖野生种（Saccharum robustu m B·)、甘鹿属中国种 (Saccharum sinense R.)和甘鹿属印度种（Saccharum barberi J.)的种间杂交为主。因 此杂交后代的性状分离严重，一个杂交花穗的后代有成百上千后代类型，不能精确各单倍 型在后代的传递方式。蔗糖磷酸合成酶（SPS)是甘蔗蔗糖合成最关键的酶之一，鉴定和分 离出不同多态性的SPS基因对甘蔗的定向杂交与提高甘蔗蔗糖分具有重要的意义。目前， 我国甘蔗育种还基本上以传统的杂交为主，从不同的杂交组合中选出性状优良的，高产高 糖的品种。但这一方式耗费时间长，育成一个品种至少需要6年以上的时间，而且在选配杂 交组合时仅从表型性状来选择父母本，加上甘蔗开花条件的限制，育成一个新品种的难度 很大，因此如何从分子水平来指导甘蔗的品种选育成为育种家们关注的焦点。
[0003] 甘蔗是我国重要的糖料作物，提高单位面积内甘蔗产量是甘蔗育种家们一直追 求的目标。蔗糖磷酸合成酶是甘蔗蔗糖合成最密切的关键酶之一，共有4个家族，分别为 SPSA、SPSB、SPSC、SPSD11JP SPSDiv，它们是甘蔗体内光合产物向蔗糖和淀粉分配的关键调 控点，在该酶的作用下，不可逆性的催化六磷酸果糖生成六磷酸蔗糖，此产物在蔗糖磷酸酯 酶的作用下形成蔗糖，与蔗糖的合成呈正相关，对甘蔗蔗糖含量的增加具有重要的作用。因 此，分析SPS基因遗传变异，特别是多态位点与甘蔗糖分性状的关联程度，对培育具有优良 性状的甘蔗新品种和提高育种速度具有重要的理论指导意义。
[0004] 目前国内外在甘蔗SPSB基因的克隆和功能方面的研宄较多，主要从mRNA的角度 来进行研宄，但该基因的内含子区域并没有得到完整的克隆，其内含子区域的多态性分析 也未见报道。SPSB基因与SPSA、SPSC基因普遍存在3个磷酸化位点，分别为14-3-3蛋白 特异结合位点、光调控位点及渗透胁迫激活位点，并在相应酶的作用下行使着不同的功能。
【发明内容】
[0005] 本发明解决的问题在于利用甘蔗属不同种的基因组DNA来筛查SPSB基因的多态 性，寻找插入性较大的片段作为PCR检测的位点，从而提供一种快速检测SPSB基因多态性 的方法，并以此作为甘蔗多态性的标记，为不同SPSB基因型的甘蔗杂交选育提供一定的指 导。
[0006] 本发明采用的技术方案如下：
[0007] 一种快速检测甘蔗属SPSB基因多态性的方法，是设计一对引物SPSB2177P1扩增 含多态的DNA片段，经琼脂糖凝胶电泳检测，依据获得的电泳图谱条带类型判断SPSB基因 多态类型，
[0008] 包括如下步骤：
[0009] 步骤（1)，模板的制备：提取被测样本的基因组DNA ;
[0010] 步骤（2)，引物设计：所述的引物对SPSB2177P1为：
[0011] 上游引物：5' -TACATGGTTGGTTGTGGTGCT-3' ；
[0012] 下游引物：5' -GTGTCTGACTTGACGGGTGGT-3' ；
[0013] 步骤（3)，PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳检测；
[0014] 步骤（4)，基因型的判断；
[0015] 步骤（5)，SPSB基因多态结果鉴定。
[0016] 上述技术方案中，所述的模板为甘蔗属大茎野生种51NG3、甘蔗属甘蔗细茎野生种 (割手密）印割1号、甘蔗属热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori 或甘蔗栽培种R0C22的基因组DNA。
[0017] 上述技术方案中，所述的PCR扩增体系为：
[0018] Buffer 含 Mg2' 2.5 μ L dNTP 2.5mM 2 μ L EasyTaq DNA 聚介丨W 0 5 μ L 上游引物10uM 0.5 μ L 下游引物10uM 0.5 μ L DNA 税板 40ng/ML 1.5 μ L ddH20 17.5 μ L 总体积 25 μ L。
[0019] 上述技术方案中，所述的扩增程序为94°C预变性5min ;35个循环94°C变性30s， 60°C 退火 30s，72°C延伸 45s ;72°C延伸 7min。
[0020] 上述技术方案中，所述的琼脂糖凝胶电泳检测的具体方法如下：配2. 5% (w/v)琼 脂糖凝胶，取5 μ L扩增的产物与2 μ L Loading buffer混勾后上样，140V下电泳30min，紫 外判断PCR条带大小，结果如图1所示。
[0021] 上述技术方案中，所述的基因型判断的具体方法为：根据步骤（3)电泳检测的结 果，分别进行凝胶回收和克隆测序，验证图1中的片段序列正是SPSB基因第一内含子序列， 因此图1中出现的大小为175bp片段，为未插入性片段，该SPSB基因型命名为Bl型；图1 中出现大小为294bp片段，为插入性片段，该SPSB基因型命名为B2型；图1中出现大小为 421bp片段，为插入性片段，该SPSB基因型命名为B3型。在这三种基因型中，只有印割1号 含有B2型的多态性序列，能与其它几个种明显的区分开来。BI、B2和B3型基因序列测序 图见图2、图3、图4所示，三个图中前部和尾部的序列相同，仅中间含有插入性序列。
[0022] 上述技术方案中，所述的Bl型与B2型的差别在于B2型插入了一段119bp的序列， Bl与B2型对比图如图5所示，该序列如SEQ ID NO. 5所示；Bl与B3型的差别在于B3型插 入了一段246bp的序列，BI与B3型对比图如图6所示，该序列如SEQ ID NO. 6所示。
[0023] 上述技术方案中，所述的SPSB基因多态结果鉴定采用测序验证。
[0024] 所述的SPSB基因多态结果鉴定能够明显的区分甘蔗属甘蔗细茎野生种（割手密） 印割1号与甘蔗属其它种，与其它种相比，印割1号多出一个B2型条带。
[0025] 本发明的研宄过程：
[0026] 分别以甘蔗属大茎野生种51NG3、甘蔗属细茎野生种（割手密）印割1号、甘蔗属 热带种Badila、甘蔗属中国种光泽竹蔗、甘蔗属印度种Nagori和甘蔗栽培种R0C22的基因 组DNA为模板，参照高粱SPSB基因组DNA序列和甘蔗SPSB基因（JN584485)序列，以设计 的SPSB2177为引物，上下游引物序列分别在甘蔗SPSB基因第一外显子和第二外显子上， PCR扩增甘蔗SPSB基因部分片段，扩增产物经浓度为1. 5% (w/v)的琼脂糖凝胶进行电泳， 电泳的电压为140V，时间为30min，在紫外灯下多态性条带很难分离辨别，只显示唯一的条 带，通过凝胶回收、PMD-18T载体连接转化，所挑取测序的克隆数量为20个，经测序筛选出 SPSB基因在第一内含子615bp处有两条多态性插入片段，引物两端序列与SPSB基因 ⑶S 序列完全相同，针对这一插入性片段的两端设计引物SPSB2177P1，再以基因组DNA为模板 进行PCR扩增，经浓度为2.5% (w/v)的琼脂糖凝胶检测，检测的电压为140V，电泳时间为 30min。将电泳的凝胶经紫外检测，依据片段的大小分离多态性片段，将大小为175bp片段 的SPSB基因型命名为Bl型（未插入性片段），将大小为294bp片段的SPSB基因型命名为 B2型（插入性片段），将大小为421bp片段的SPSB基因型命名为B3型（插入性片段）两 段序列经琼脂糖凝胶回收、载体连接和克隆测序验证，证明三段序列是SPSB2177引物扩增 的多态性片段序列。
[0027] 所述的引物SPSB2177序列为：
[0028] 上游引物：5 ' - AACTTCAACCCCTCGCACTACTT - 3 '
[0029] 下游引物：5 ' - GTCCCCACTGTTCATCAATCTCC - 3 '
[0030] SPSB2177扩增程序：94°C预变