Alk基因重排检测探针、试剂盒以及方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及医学和生物技术，具体的是涉及ALK基因重排 检测探针、试剂盒以及方法。
【背景技术】
[0002] ALK基因编码的间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase, ALK)首先发现 于间变性大细胞淋巴瘤中，是靶向治疗的重要靶标之一。ALK基因位于2号染色体上（位置 为2p23)，长度为728kb，全长cDNA含有29个外显子，全长ALK蛋白含有1620个氨基酸，分 子量为177千道尔顿（kDa)，254个氨基酸激酶结构域由1123至1376位氨基酸残基组成，在 此之前是一个由氨基酸组成的短跨膜区。ALK基因重排的断裂点位于外显子19和20之间， ALK基因发生重排后多具有生物学功能，其表达产物为嵌合酪氨酸激酶，通过Coiled Coil 结构域形成多聚体，引起组成性的ALK激活，ALK信号可通过激活RAS-MEK-ERK，JAK3-STAT3 和PI3K-AKT等下游信号通路持续地促进细胞增殖，导致肿瘤的产生和转移。
[0003] 临床研究表明，针对ALK基因开发的靶向药物克唑替尼，对于ALK基因重排阳性 的NSCLC患者，表现出显著的治疗活性，并可延长患者的生存期。目前，克唑替尼已获得国 家食品药品监督管理总局（CFDA)的批准，在中国用于治疗间变性淋巴瘤激酶（ALK)阳性的 NSCLC患者。因此，与克唑替尼治疗配套的ALK基因重排检测具有明确的临床意义与检测必 要性。
[0004] 常用的ALK基因重排检测方法分为以下三种：荧光原位杂交（FISH)技术、免疫组 织化学（IHC)和基于PCR的方法（包括qRT-PCR、RACE-PCR或特异性RT-PCR联合测序技 术）。但上述技术尚存在一些不足，如荧光原位杂交探针主要使用人工染色体制备，由于在 人工染色体中重复序列在整个基因组中不断出现，从而导致非特异性的荧光信号，大大降 低了 FISH检测的特异性和灵敏度；常规IHC的阳性标准判定尚未统一；RT-PCR法检测ALK 融合基因虽然快速、简便易行、能同时明确ALK已知的融合变体的类型，但无法检测未知的 融合型是其最大的不足之处。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的之一是ALK基因重排检测试剂盒，该检测试剂盒可用于高特异性和 高准确性检测ALK基因重排的情况。
[0006] 实现上述目的的技术方案如下：
[0007] ALK基因重排检测试剂盒，包括有标记荧光染料的、针对断裂点上游的第一组探针 和针对断裂点下游的第二组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中 的至少一条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一条探 针；上述两组探针所标记的荧光染料颜色不一样。
[0008] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少五条探针。
[0009] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少八条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少八条探针。
[0010] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50,所述第 二组探针为 SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60。
[0011] 在其中一个实施例中，所述SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50依次分别由以下引物扩 增制备得到：SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID NO. 2、SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8、SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10、SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12、SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14、SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16、SEQ ID NO. 17 和 SEQ ID NO. 18、SEQ ID NO. 19 和 SEQ ID NO. 20。
[0012] 在其中一个实施例中，所述SEQ ID NO. 51-SEQ ID NO. 60依次分别由以下引物扩 增制备得到：SEQ ID NO. 21 和 SEQ ID NO. 22、SEQ ID NO. 23 和 SEQ ID NO. 24、SEQ ID NO. 25 和 SEQ ID NO. 26、SEQ ID NO. 27 和 SEQ ID NO. 28、SEQ ID NO. 29 和 SEQ ID NO. 30、SEQ ID NO. 31 和 SEQ ID NO. 32、SEQ ID NO. 33 和 SEQ ID NO. 34、SEQ ID NO. 35 和 SEQ ID NO. 36、 SEQ ID NO. 37 和 SEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39 和 SEQ ID NO. 40。
[0013] 本发明的另一目的是提供一种ALK基因重排检测探针。
[0014] 实现上述目的技术方案如下：
[0015] ALK基因重排检测探针，针对断裂点上游的第一组探针和针对断裂点下游的第二 组探针，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41 - SEQ ID NO. 50中的至少一条探针，所述第 二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少一条探针。
[0016] 在其中一个实施例中，所述第一组探针为选自SEQ ID NO. 41-SEQ ID NO. 50中的 至少五条探针，所述第二组探针为选自SEQ ID NO. 51 - SEQ ID NO. 60中的至少五条探针。
[0017] 本发明的另一目的是提供一种ALK基因重排检测方法。
[0018] 实现上述目的的技术方案如下。
[0019] 一种ALK基因重排检测方法，包括
[0020] 待检测样品切片预处理；
[0021] 利用上述ALK基因重排检测试剂盒进行杂交检测；
[0022] 复染后在显微镜下观察荧光信号。
[0023] 本发明的主要优点在于：
[0024] 1.本发明所提供的ALK基因重排检测试剂盒的检测结果与Cytocell公司产品 ALK检测产品的吻合率高达100%。
[0025] 2.本发明制备的检测ALK基因重排的FISH探针，不含有重复序列，能够避免交叉 反应，与染色体中ALK目标检测片段进行识别杂交，具有准确性高，特异性好、及假阳性