一种基于fish技术的活细菌定量检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于FISH技术的活细菌定量检测方法。
【背景技术】
[0002] 培养法是目前应用最广泛的活性微生物特异性检测手段，但培养法存在明显的缺 点：一方面，该法耗时长、工作量大，检测结果具有较大的滞后性；另一方面，对于粪便样品 中不可培养的或处于活的非可培养状态（Viable but Non-culturable, VBNC)的细菌，无 法应用培养法来进行检测。
[0003] 荧光原位杂交（FISH)技术是利用荧光标记的特异核酸探针与细胞内相应的靶 DNA分子或RNA分子杂交，通过在荧光显微镜或共聚焦激光扫描仪下观察荧光信号，来确定 与特异探针杂交后被染色的细胞或细胞器的形态和分布，或者是结合了荧光探针的DNA区 域或RNA分子在染色体或其他细胞器中的定位，由于FISH技术通过设计探针来对细菌检 测，故对VBNC状态的菌同样也可以进行检测。近年来，FISH技术广泛应用于水体、土壤、粪 便等样品中的细菌检测。结合计算机图像分析，可对细菌进行准确的定量检测。随着特异 性探针种类的不断丰富，可检测的细菌种类也越来越多。且FISH技术可在3h内完成对细 菌的定量检测，较传统培养法更加快速简便。
[0004] FISH技术能实现对细菌的特异性检测，然而在实际的微生物生态体系中，有活细 菌也存在着死细菌；死细菌虽然已经死亡，但其rRNA会在一段时间内存在，因此采用FISH 定量反映的是总菌的结果。对于微生物体系的解析尤其涉及生态功能的分析，活细菌的数 目更加能反映该种菌在生态体系中发挥的实际影响和作用，因此如何排除死细菌的干扰准 确定量活细菌变得十分重要，需对该技术进行升级使其能够特异性检测活细菌。
[0005] 叠氮溴化丙锭（PM)是一类叠氮类核酸染料，能够结合胞外游离的核酸，并能穿过 膜受损细胞的细胞膜进入细胞内，进而结合其胞内的核酸。而活性微生物具有完整的细胞 膜，叠氮类染料被阻隔在细胞之外。结合核酸的PM在强光诱导下能够与核酸形成牢固的 共价键。这部分核酸则不能够参与后续的核酸反应，这样便在后续反应中消除了非活性微 生物对检测结果的影响。PMA已与qPCR技术结合形成PMA-qPCR技术，它是一种细菌活细 胞定量检测的有效的分子手段，现在被广泛应用于致病菌或有害菌活菌的定量检测等领域 中。
[0006] 而PMA这一有效区分死活菌的染料还未与FISH技术结合，具有良好的开发前景。
【发明内容】
[0007] 基于上述背景，本发明提供了一种基于荧光原位杂交技术的活细菌定量检测方 法：PM-FISH技术，构建一种可以快速定量活细菌的PM-FISH技术。
[0008] 本发明的技术方案是在常规荧光原位杂交方法的实施过程前，增加 PM核酸染料 的预处理步骤，在PMA处理过程中，死菌细胞内的核酸与PMA共价结合，在荧光显微镜的蓝 光激发下发出橙色荧光，从而可知橙色荧光的细菌为原体系中的死菌；而PM无法穿透活 菌完整的细胞膜，从而被隔绝在活菌细胞外，游离在体系中的PM在PM处理最后的清洗步 骤中被洗去，故在PMA处理中和PMA处理之后，PMA都不会影响活菌，活菌细胞内的rRNA在 杂交步骤与荧光探针结合，荧光探针在荧光显微镜的蓝光激发下发出绿色荧光，从而可知 绿色荧光的细菌为原体系中的活菌。
[0009] 本发明的技术方案包括以下步骤： (1)用PM对样品进行前处理，使PM与死菌核酸结合。
[0010] (2)去除样品中游离的PMA，使之不对活菌造成影响。
[0011] (3)进行FISH操作，包括细菌固定、溶菌酶处理、探针杂交。
[0012] (4)将细菌过滤在聚碳酸酯滤膜上，并制片。
[0013] (5)荧光显微镜观察并计数。
[0014] 具体按如下步骤进行： (1) 按照常规方法制备细菌悬液和进行PM预处理； (2) 离心，去上清，用无菌生理盐水冲洗后，再用生理盐水重悬； (3) 将步骤2)得到的菌液离心，去上清，IXPBS缓冲液重悬； (4) 用4%多聚甲醛在4°C下固定l_2h，储存于-20°C 50%乙醇中； (5) 取 2-10 μ L 菌液，加 20-50 μ L lmg/ml 溶菌酶，37°C水浴加热 15min ; (6) 加入20yL 5X杂交液和5yL EUB338探针，用无菌水补足至lOOyL，轻轻重悬， 45-50°C水浴加热l_2h ; (7) 取杂交后的菌液用真空抽滤装置过滤到0. 2 μ m聚碳酸酯滤膜上，滴加抗荧光猝灭 齐Ll，封片，常温保存于暗盒中； (8) 用荧光显微镜蓝光激发，拍摄所得到的荧光影像； (9) 镜检后菌体细胞计数：随机选取荧光显微镜内观察的视野10个，取其平均数，按照 下列公式计算： 菌体细胞数目=视野平均细菌数X (过滤面积/视野面积）X稀释倍数。
[0015] 本发明的显著优点： 本发明通过对荧光原位杂交技术的改进，即增加 PM染料处理的步骤，实现了样品体 系中死活菌的有效区分，构建出一套可准确定量样品中活性细菌的方法。由于这种定量方 法建立在荧光原位杂交技术上，荧光原位杂交在微生物定量领域已广泛应用，而PMA对细 菌的活性选择也具有普适性，故本方法对细菌定量具有较强的普适性。另外，本方法在检测 活性细菌的同时，也可同时对非活性菌进行定量，可快速分析环境体系对细菌活性的影响。
【附图说明】
[0016] 图1为活菌比例为50%时的FISH荧光图；其中a为万.co/i的活菌比例为50%时 的FISH突光图，b为P. /7(9/7 iiosaceiAs的活菌比例为50%时的FISH突光图，c为51 <9/7 terica 的活菌比例为50%时的FISH荧光图，d为Z. 的活菌比例为50%时的FISH 荧光图。
[0017] 图2为活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图；其中a为凡co/i的活菌比例为 50%时的PMA-FISH荧光图，b为P. pefliosacem的活菌比例为50%时的PMA-FISH荧光图， c为51 <9/7terica的活菌比例为50%时的PMA-FISH突光图，d为Z. ?的活菌 比例为50%时的PMA-FISH荧光图。
【具体实施方式】
[0018] 下面结合具体实施例对本发明做进