试剂盒及其用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其是基因突变检测领域。具体地，本发明涉及试剂盒 及其用途，更具体地，涉及试剂盒、对待测结核分支杆菌预定基因预定位点进行突变检测的 方法以及对待测结核分支杆菌进行预定药物耐药性检测的系统。
【背景技术】
[0002] 结核病（TB)是当今全球范围对人类最具威胁性的感染性疾病之一，是单病因所 致的感染性疾病中死亡率最高的疾病，全球每年死于结核病的人数接近200万。中国是全 球结核病的重灾区，结核病发病总人数居全球第二，每年死于结核病者约25万，结核病夺 去的生命多于其它所有传染病所造成死亡例数的总和。耐药结核分枝杆菌的产生和传播及 结核合并HW感染是造成近年来结核病死灰复燃、卷土重来的主要原因。目前对结核病治疗 主要使用化学药物，然而由于抗结核药物的不规范治疗，病人体内的结核菌对多种抗结核 药物发生耐药，从而形成耐多药结核病（multidrug resistant tuberculosis，MDR_TB)，这 是结核病疫情重新上升的最主要的原因之一。中国结核病疫情的主要特点之一就是耐药率 高，耐多药结核病人数居全球第一。结核病耐药问题非常突出，已成为结核病防治的一个难 题。因此深入开展结核分枝杆菌耐药机制研宄及在此基础上建立适合临床应用的快速耐药 检测方法，对于指导结核病临床治疗，控制耐多药结核病的传播，以及开发新型抗结核药物 均具有重大的理论意义和实用价值。
[0003] 目前，临床结核分枝杆菌耐药性的检测以培养加药敏试验为主，方法可靠但费时， 一般需要4-6周，难以满足临床需要。BACTEC MGIT 960系统是一种快速培养仪系统，在5-7 d即可获得药敏结果，但此法费用较高，不利于在耐药结核发病率高的不发达地区推广，严 重影响结核病治疗。为此，结核分枝杆菌耐药性快速低费用检测技术研制显得十分重要。
[0004] 然而，目前的结核分枝杆菌耐药性检测方法仍有待改进。
【发明内容】
[0005] 本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
[0006] 近年来，相应产生了许多与药物敏感性相关的耐药基因的研宄，结核分枝杆菌耐 药的分子机制研宄取得了一些进展，测定的耐药基因有katG、inhA、rpoB、embB、mabA、ahpC、 oxyR、pncA、rrs、rpsl、gyrA和gyrB等。其中，针对临床上最常用的异烟肼、利福平、链霉 素、已胺丁醇药物，异烟肼耐药基因为KatG基因，利福平耐药基因为RpoB基因，链霉素耐药 基因为RpsL基因，已胺丁醇耐药基因为embB基因，其耐药机理分别如下：异烟肼（INH)作 为一种高效特异的抗结核药物，一种前体药，通过KatG编码的触酶过氧化物酶活化产生游 离的自由基，然后其攻击细胞内的多个药物靶点。结核杆菌内过氧化氢-过氧化物酶（由 KatG基因编码）的作用下才能转化为活性形式作用于enoyl-ACP还原酶，抑制杆菌酸和细 胞壁合成。由于KatG蛋白是唯一可以激活异烟肼的酶，所以其功能的下降或缺失必然会造 成结核菌异烟肼耐药性，进一步的研宄发现造成临床异烟肼耐药性的主要原因不仅是KatG 基因的完全缺失、点位突变、碱基的插入和缺失同样重要。利福平（RFP)是抗结核联合化疗 中主要的一线药物，利福平耐药性是MDR-TB的标志物。利福平通过与RNA聚合酶的β亚单 位（RpoB基因编码）结合，抑制RNA聚合酶的活力，干扰分支杆菌RNA的转录及合成，阻碍蛋 白质的合成而发挥抗菌作用。90%以上结核分枝杆菌利福平耐药菌株RpoB基因的利福平 耐药确定区域（Rifampin Resistance Retermining Region，RRDR)内存在遗传变异。突变 类型包括单个核苷酸、缺失和插入变异。通过大量研宄表明，利福平耐药结核分枝杆菌临床 分离株基因突变一般发生在的RRDR区域内一段高度保守8Ibp (507-533位27个氨基酸密 码子处）的区域。链霉素（SM)是1945年发明的一种氨基糖苷类抗生素，是第一种有效的抗 结核药物，目前仍是结核病治疗的一线药物。在抗结核药物中，其耐药发生率高居榜首。链 霉素主要通过与细菌核糖体蛋白小亚基不可逆的结合，干扰tRNA的正确定位，使mRNA错误 转译，从而破坏翻译过程的正常进行，合成结构功能异常的蛋白来发挥其杀菌作用。许多研 宄认为大多数链霉素耐药性的产生与RpsL基因（结核分枝杆菌标准株H37Rv基因组的第 781560?781934位，全长375bp，编码核糖体蛋白S12)，作用可能是维持读码过程中一些轻 微的不准确性，而突变的S12蛋白却要求与tRNA的严格配对，更准确的表达mRNA上的每一 个密码，从而抑制了链霉素诱导的密码子错读而表现为对链霉素的耐药性。RpsL基因中突 变率最高的是43位密码子和88位密码子，总之，RpsL基因结核分枝杆菌耐链霉素的主要分 子机制之一，可通过分析高频突变而检测大部分结核分枝杆菌对链霉素的耐药性。乙胺丁 醇（EMB)是一种人工合成的阿拉伯糖类似物，是具有广谱抗分枝杆菌活性的一线抗结核药 物，主要作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制阿拉伯糖基与阿拉伯半乳聚糖的聚合，从而 抑制细菌细胞壁分枝菌酸邛可拉伯半乳聚糖一肽聚糖复合物的形成，引起细菌细胞形态改 变，最终导致细菌死亡。embB基因全长约3246bp，编码阿拉伯糖基转移酶。embB基因突变使 阿拉伯糖基转移酶的结构发生改变，影响其与乙胺丁醇的结合和相互作用，使乙胺丁醇失 去作用祀分子或结合力降低而无从发挥其杀菌作用，导致耐乙胺丁醇的产生。Sreevatsan 等报道在耐乙胺丁醇结核分枝杆菌中embB基因的突变率为69%，其中89%是306位密码 子突变。这些基因的高频突变位点检测已有相关专利和商品化试剂盒，但是检测费用仍然 车父尚，检测速度还有待提尚。
[0007] 本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明的一个目的 在于针对上述临床上最常用的异烟肼、利福平、链霉素、已胺丁醇药物，提出一种针对这4 种药物高频耐药基因的位点开发的，费用低、速度快的结核分支杆菌耐药性检测技术。
[0008] 进而，根据本发明的一个方面，本发明首先提供了一种试剂盒。根据本发明的实施 例，该试剂盒包含：第一引物组，所述第一引物组特异性识别结核分支杆菌的KatG基因，由 第一引物对和第二引物对组成，所述第一引物对具有SEQ ID NO. 1-2所示的核酸序列，所述 第二引物对具有SEQ ID NO. 3-4所示的核酸序列；第二引物组，所述第二引物组特异性识 别结核分支杆菌的RpoB基因，由第三引物对和第四引物对组成，所述第三引物对具有SEQ ID NO. 5-6所示的核酸序列，所述第四引物对具有SEQ ID NO. 7-8所示的核酸序列；第三引 物组，所述第三引物组特异性识别结核分支杆菌的RpsL基因，由第五引物对和第六引物对 组成，所述第五引物对具有SEQ ID NO. 9-10所示的核酸序列，所述第六引物对具有SEQ ID NO. 11-12所示的核酸序列；以及第四引物组，所述第四引物组特异性识别结核分支杆菌的 embB基因，由第七引物对和第八引物对组成，所述第七引物对具有SEQ ID NO. 13-14所示的 核酸序列，所述第八引物对具有SEQ ID NO. 15-16所示的核酸序列。
[0009] 发明人惊奇地发现，利用本发明的试剂盒，能够对待测结核分枝杆菌的预定基因， 即KatG基因、RpoB基因、RpsL基因和embB基因的至少之一的核酸序列进行有效富集，进而 通过对富集序列进行文库构建、测序、比对分析，能够准确有效确定预定基因的高频突变位 点是否存在突变，从而能够容易地判定待测结核分枝杆菌对预定基因对应的药物是否具备 耐药性，并且判定结果准确、可靠，可重复性好，检测过程简单、需时少，便于推广应用。
[0010] 根据本发明的另一方面，本发明还提供了一种对待测结核分支杆菌预定基因预定 位点进行突变检测的方法。根据本发明的实施例，所述预定基因预定位点为选自结核分支 杆菌的KatG基因315位点、RpoB基因526和531位点、RpsL基因43和88位点、以及embB 基因306位点的至少之一，该方法包括：利用前面所述的试剂盒富集待测结核分支杆菌预 定基因的核酸序列；针对富集得到的核酸序列，构建核酸测序文库；对所述核酸测序文库 进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果；基于所述测序结果，确定待测结核分 支杆菌预定基因的序列信息；以及基于所述待测结核分支杆菌预定基因的序列信息，确定 所述待测结核分支杆菌的预定基因预定位点是否存在突变。
[0011] 根据本发明的实施例，利用本发明的对待测结核分支杆菌预定基因预定位点进行 突变检测的方法，通过对待测结核分枝杆菌的预定基因即KatG基因、RpoB基因、RpsL基因 和embB基因的至少之一的核酸序列进行有效富集，并对富集序列进行文库构建、测序、比 对分析，能够准确有效确定预定基因的高频突变位点是否存在突变，进而能够容易地判定 待测结核分枝杆菌对预定基因对应的药物是否具备耐药性，并且判定结果准确、可靠，可重 复性好，检测过程简单、需时少，便于推广应用。
[0012] 根据本发明的又一方面，本发明还提供了一种对待测结核分支杆菌进行预定药物 耐药性检测的系统。根据本发明的实施例，所述预定药物为异烟肼、利福平、链霉素和已胺 丁醇，该系统包括：突变检测装置，所述突变检测装置适于根