鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的检测试剂与方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物疫病检验检测领域，特别是涉及用于鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株 和野毒株的二重荧光定量PCR引物和探针，本发明还涉及利用该引物和探针进行猪伪狂犬 病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因检测的方法和检测试剂。
【背景技术】
[0002] 猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV)引起的一种以发热、奇 痒及脑脊髓炎为主要临床症状的急性传染病，可致妊娠母猪流产、产死胎及胎儿干尸化；对 初生仔猪则引起神经症状，出现运动失调，麻痹，衰竭死亡，死亡率100% ;成年猪常为隐性 感染，耐过的呈隐性感染的成年猪是该病的主要传染源。猪伪狂犬病最早发现于美国，因临 床表现与狂犬病类似，故称伪狂犬病。20世纪60年代之前猪伪狂犬病对养猪业未造成重大 危害，然而在60?70年代，抢毒株的出现导致猪场爆发该病的数量显著增长，且各日龄猪 均可感染，症状也明显加剧，这种变化在美国和西欧广泛存在。该病在全球范围内的流行呈 上升趋势，世界上已有50多个国家和地区报道该病的流行。我国1947年刘永纯从猪体分 离到PRV以来，已有24个省、自治区的报道流行。
[0003] 猪伪狂犬病毒属于疱瘆病毒科甲型疱瘆病毒亚科，猪疱瘆病毒I型。目前，PRV只 发现一种血清型，但不同毒株在生物学特性和毒力等方面有差异。PRV具有泛嗜性，可以在 多种组织培养细胞内增殖，且可产生明显的细胞病变及核内嗜酸性包涵体，对兔肾和猪肾 细胞尤为敏感。PRV基因组为线形双链DNA，大小约180kb，GC%含量高达74%。PRV基因 组由72个阅读框组成，可编码70种蛋白，目前发现和命名的有11种糖蛋白，其中gB、gC、 gD、gE和gl基因编码的糖蛋白与病毒的毒力有关。目前已有的PRV的检测方法主要有病 毒分离鉴别、动物接种试验、免疫学检测方法、血清学检测方法和分子生物学检测方法。用 于PCR检测的主要为gB、gE和gH基因，其中gE基因 GC%含量高达74. 16%，gH基因是病 毒复制所必须，并且糖蛋白gH在疱瘆病毒中较为保守。
[0004] 由于目前我国广泛使用的猪伪狂犬病疫苗为gE基因缺失的疫苗，该基因是PRV的 主要毒力因子之一，但不是病毒复制所需的，而gD与病毒复制有关，存在于疫苗株和野毒 株中。因此，若能提供一种能够同时鉴别gE基因和gD基因的方法，将有助于快速鉴别区分 猪伪狂犬病野毒株和gE基因缺失株（PRV疫苗株），有助于有效判断猪是否感染野毒株的 PRV。目前，现有的PRV检测方法基于ELISA、PCR和病毒分离等方法普遍存在敏感性低、耗 时长等不足，这非常不利于该病防控工作的开展。因此，若能提供一种能够同时鉴别gE基 因和gD基因的荧光PCR方法，将有助于快速鉴别区分猪伪狂犬病野毒株和gE基因缺失株 (PRV疫苗株），有助于有效判断猪是否感染野毒株的PRV，对该病的防控具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供用于鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因 的特异性引物对和探针；
[0006] 本发明的另一个目的在于提供鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的荧光定量 PCR方法及其检测试剂。
[0007] 为实现上述目的，本发明对已知猪伪狂犬病病毒gD和gE基因特异基因的DNA 序列进行比对，筛选出猪伪狂犬病病毒gD和gE基因高度保守且具有型特异性基因序列， 设计检测gD基因和gE基因的2对特异性引物对和2个TaqMan MGB探针，分别命名为 PRV-F (Pl)、PRV-R (P2)、PRV-F (P3)、PRV-R (P4)、PRV-MGB-FAM-探针（P5)、PRV-MGB-VIC-探 针（P6)，2对特异性引物对，2个TaqMan MGB探针的核苷酸序列分别如SEQ ID NO. 5-6所 不O
[0008] 本发明提供上述2对特异性引物和2个TaqMan MGB探针结合使用，可用于二重荧 光定量PCR方法鉴别检测猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株。
[0009] 本发明提供一种鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的检测试剂，含有2对特异 性引物对和2条荧光探针；2对特异性引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1?4所示，2条 荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5?6所示。
[0010] 本发明的检测试剂还包括：DNA裂解液、荧光定量反应液、阴性模板、阳性模板，所 述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为猪伪狂犬病病毒基因组DNA。
[0011] 进一步地，本发明检测试剂其25 yL总工作体系为：
[0012] 试剂 体积pL 浓度 IOxExTaq 缓冲液 2.5 dNTP 2.0 2.5mM Ex Taq 酶 0.25 5U/liL gD基因上游引物 〇·5 0·4μΜ gD基因下游引物 〇.5 〇.4μΜ gE基因上游引物 〇·5 〇.4μΜ gE基因下游引物 Ο·5 〇·4μΜ 探针 Ρ5 0.8 0.6μΜ 探针 Ρ6 1.0 〇.7μΜ DNA模板 2.0 去核酸水 补足至25 。
[0013] 本发明检测试剂的工作程序为：94°C预变性5min ;94°C变性15sec，60°C退火 30sec，40个循环。
[0014] 本发明还提供一种鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株和野毒株的检测试剂。
[0015] 本发明提供上述2对特异性引物和2条荧光探针在制备鉴别猪伪狂犬病毒疫苗株 和野毒株检测试剂中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016] 本发明提供了一种鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的二重荧 光定量PCR方法，具体地，是应用本发明的2对特异性引物和2条荧光探针，以PRV基因组 DNA为模板，通过荧光定量PCR方法和实现鉴别。
[0017] 上述方法每次检测样本时须设立阴性对照和阳性对照，在检测中两种对照成立的 判断标准如下：
[0018] 在"FAM/NONE"和"VIC/ΝΟΝΕ"双标记模式下，阳性对照出现两条特定的扩增曲线 Ct值< 29. 0 ;阴性对照应无特定的扩增曲线且Ct值> 32. 0或无。如阴性对照和阳性对照 结果不满足以上条件，此次实验视为无效。
[0019] 样本结果判断标准如下：
[0020] Ct值彡29. 0时样品结果为阳性；
[0021] Ct值彡32. 0的样品结果为阴性；
[0022] Ct值在29. 0?32. 0之间时，且出现特定扩增曲线的样品需要重复，结果为阳性者 判定为阳性，结果为阴性者判定为阴性；若重复试验Ct值依然低于32判定为阳性扩增，超 过32判定为阴性扩增。若样品中检测到PRV的gE和gD基因双阳性，判为野毒株。
[0023] 本发明提供了用于鉴别猪伪狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的特异性 引物和探针，针对PRV gE基因缺失疫苗检测出gD基因而检测不出gE基因，建立了鉴别猪 伪狂犬病病毒疫苗株gD基因和野毒株gE基因的二重荧光定量PCR方法，具有很高的检测 灵敏度，检测猪伪狂犬病病毒疫苗株gD和野毒株gE基因的最低检测限为I. OX IO1拷贝/ UL ;该方法还具有100%的特异性，其重复性好，可作为检测临床标本的手段，提高鉴别猪 伪狂犬病病毒疫苗毒和野毒株的阳性率，操作简单，可在Ih?2h内完成，大大缩短检测周 期。本发明检测试剂将有助于快速鉴别区分PRV野毒株和gE基因缺失株（猪伪狂犬病疫 苗株），有助于有效判断猪是否感染野毒株的PRV，为猪伪狂犬病传染源调查、传播环境、病 原追溯提供了有效工具，对该病的防控具有重要意义。
【附图说明】
[0024] 图1为PRV gD/gE基因二重FQ-PCR扩增曲线，其中，1为VIC探针（P6探针）gD基 因扩增曲线，2为FAM探针（P5探针）gE基因扩增曲线，3, 4为阴性对照。
[0025] 图2为PRV gD/gE基因二重FQ-PCR检测gD基因敏感性扩增曲线；1?7为分别对 应的质粒浓度 I. OX 1〇6, I. OX 1〇5, I. OX 1〇4, I. OX 1〇3, I. OX 1〇2, I. OX 101，I. OX 10°拷贝 / UL ;8、9为阴性对照。
[0026] 图3为PRV gD/gE基因二重FQ-PCR检测gD基因标准曲线。
[0027] 图4为PRV gD/gE基因二重FQ-PCR检测gE基因敏感性扩增曲线：1?6为分别对 应的质粒浓度 I. 0X105, I. 0X104, I. 0X103, I. 0X102, I. 0X101，I. 0X10〇c〇pies/yL，7、8 为阴性对照。
[0028] 图5为PRV gD/gE基因二重FQ-PCR检测gE基因标准曲线。
[0029] 图6为PRV gD/gE基因二重FQ-PCR体系单一检测gD基因特异性扩增曲线；I :gD 基因 VIC通道扩增曲线；2 :gE基因 FAM通道扩增曲线，3, 4 :阴性对