一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡及制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及动物病毒学与免疫学检测技术领域，更具体涉及一种用于检测猪血清 中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的免疫胶体金试试纸卡，同时还涉及一种用于检测猪血清中 伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的免疫胶体金试试纸卡的制备方法，还涉及一种用于检测猪血 清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的免疫胶体金试试纸卡的用途。
【背景技术】
[0002] 猪伪狂犬病（PR)是由伪狂犬病病毒（PRV)引起的一种急性传染病。感染猪的临 床特征为体温升高，新生仔猪表现神经症状。成年猪常为隐性感染，妊娠母猪感染后可引起 流产、死胎及呼吸系统症状。本病广泛分布于世界各国，在我国也广泛存在，是重要的传染 病之一，一旦发病，很难根除，给养猪业造成了极大的损失，使生产效益极大的降低，严重制 约着我国养猪业的健康发展。被列为国家中长期动物疫病防治规划中二类优先防治的国内 动物疫病。因此，该病的净化和根除计划分外重要。
[0003] PRV整个基因组大小约为150Kb，已被发现有11种糖蛋白，分别命名为gB、gC、gD、 gE、gG、gH、gl、TK、gL、gM和gN。目前国际广泛应用的疫苗是gE基因与TK基因双缺失疫 苗。将双基因缺失疫苗注射动物后，动物不能产生缺失蛋白抗体。因此，可以通过检测gE 蛋白抗体的有无来确定猪只是否感染伪狂犬病病毒野生毒株。
[0004] 在中国，猪伪狂犬病病毒gE基因缺失疫苗也正在广泛应用，gE基因缺失疫苗免疫 接种后，在被免疫的猪血清中不能检测到针对gE蛋白的抗体，为利用血清进行PRV野生 毒株感染猪和gE基因缺失疫苗免疫接种猪进行鉴别诊断提供了条件，这也是猪伪狂犬病 净化和根除计划的基础。因此，在净化和根除计划中，监测和检测猪血清中的伪狂犬病病毒 gE蛋白抗体是非常重要的一个环节。对已经免疫接种过的猪进行血清抗体检测，如果检测 到gE蛋白抗体，说明猪已经感染了猪伪狂犬病病毒的野生毒株，可将感染的猪只淘汰，彻 底净化和根除猪伪狂犬病。
[0005]目前国内检测猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体一般采用酶联免疫吸附试验（ELISA)， 但是由于这种检测方法的特殊性，必须在实验室中完成，所用时间长，费用高。因此建立一 种快速、方便、特异性高、灵敏度强、现场可用的检测方法很有优势。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是在于提供了一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸 卡，本试纸卡检测快速，成本低廉，操作方便，灵敏度高；本发明的优点是使用了不饱和标记 法标记猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体，提高了检测的灵敏性和特异性。
[0007] 本发明的另一个目的是在于提供了一种猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试 纸卡的制备方法，试纸卡制备过程简单，原辅料廉价易得，试纸卡操作简单，临床使用中不 需要任何设备，便于携带和现场使用。
[0008] 本发明还有一个目的是在于提供了一种猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试 纸卡在检测猪伪狂犬病病毒gE蛋白抗体中的应用，主要针对现有的猪血清中伪狂犬病病 毒gE蛋白抗体检测方法操作繁琐，检测耗时耗力，还需专业人员操作的现象，此试纸卡操 作简单，检测快速、准确，结果易于判断，无需专业人员及仪器操作，且可在养猪现场使用。
[0009] 为了实现以上的目的，本发明采用以下技术方案： 一种用于检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡，试纸卡是由免疫胶体金 试纸条和卡体组成。卡体包括支撑背板、检测窗孔和加样孔；免疫胶体金试纸条包括样品 垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫、底板，硝酸纤维膜上设有包被有猪伪狂犬病病毒鄂 A株的检测线和包被有羊抗鼠 IgG质控线。其连接关系是：硝酸纤维素膜粘贴在底板上面， 在硝酸纤维膜的一端粘贴有金标结合垫和样品垫，吸水垫粘贴于硝酸纤维素膜的另一端； 样品垫、金标结合垫、硝酸纤维素膜、吸水垫相接处（1 一 3毫米)分别部分重合，检测线与质 控线相互平行，相距6~8mm，且与胶体金试纸条的长相垂直，检测线靠近（1-2 mm)金标结合 垫一端，质控线靠近（1-2 mm)吸水垫一端。免疫胶体金试纸条放置于卡体中，检测线和质 控线设置在检测窗孔所对应的位置，加样端与加样孔位置相对应。
[0010] 所述的金标结合垫(购自上海杰一生物生物技术有限公司）为金颗粒标记猪伪狂 犬病病毒gE蛋白单克隆抗体； 所述的检测线与质控线分别包被有猪伪狂犬病病毒鄂A株和羊抗鼠 IgG。 toon] 所述的样品垫与金标结合垫具体为缓冲液处理过的吸水纸和玻璃纤维，缓冲液的 配方为：含〇· 5% (w/v)牛血清白蛋白（BSA)，3% (w/v)鹿糖，0· 5% (v/v)吐温-20的IOmmol/ L 的 PBS，PH8. 5。
[0012] 所述的猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体为2E6细胞所制。
[0013] 一种检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体的试纸卡的制备方法，其步骤是： A.制备并纯化猪伪狂犬病病毒（PRV):将-78~-82°C保存的伪狂犬病病毒鄂A株(该 伪狂犬病病毒鄂A株来源见参考文献：陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜 牧兽医学报，1998年02期）取出，感染单层的pK-15细胞(购自中国典型培养物保藏中心， CCTCC，⑶C061，PK-15细胞的编号是⑶C061)，提取病毒DNA，经PCR鉴定正确后，0. 5个MOI 接种pK-15细胞，出现90%细胞病变后收毒,将病毒液反复冻融2~4次,56°C灭活,将病毒 液8000rpm离心lOmin，弃掉沉淀，并将离心后的上清液放入洁净的烧杯中，在磁力搅拌器 搅拌下，将硫酸铵按41. 5~43. 5g每IOOml的剂量缓慢加入烧杯中的病毒液中，搅拌过夜，低 温高速12000rpm、4°C离心IOmin,弃掉上清，沉淀用1/5原体积的IOmM PH9. 0 Tris-HCL重 悬，用IOmM PH9.0 Tris-HCL为透析液，4°C透析22~26h，期间多次更换透析液，回收透析袋 中病毒液，27000rpm超高速离心lh，沉淀用1/5原体积的IOmM PH9. 0 Tris-HCL重悬，设置 四个蔗糖密度梯度分别为60% (w/v)、45% (w/v)、35% (w/v)、20% (w/v)进行梯度离心，收集 不同条带的病毒后，脱糖，将不同线病毒用病毒保护剂重悬，检测猪伪狂犬病病毒gE阳性， 最终确定用35%条带病毒作为检测线包被物。所述病毒保护剂为含有3%w/v鹿糖，0. 2%w/v 牛血清白蛋白的IOmM PH7. 2 PBS溶液。
[0014] B.制备金标结合垫，其制备方法如下： (1)所述的猪伪狂犬病病毒gE蛋白单克隆抗体是由杂交瘤细胞2E6分泌的，杂交瘤 细胞2E6制备方法为：采用杂交瘤细胞技术(参见文献：沈关心、周汝麟，现代免疫学实验技 术，武汉：湖北科学技术出版社，1998)，用纯化的猪伪狂犬病病毒鄂A株免疫BALB/c小鼠， 取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行融合，用HAT选择性培养基(购自SIGM公司）进行培养 后，再用猪伪狂犬病病毒鄂A株和伪狂犬病病毒gE/gl基因缺失株(参见中国发明专利申请 公开说明书，申请专利号200510019513. 8)进行间接免疫荧光筛选，筛选后的阳性细胞