专利名称：犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测 试齐U盒。
背景技术：
狂犬病是由狂犬病毒(Rabies virus, RV)引起的人畜共患传染病，其主要宿主为 犬、猫等动物。典型症状为恐水症，又称恐水病。本病极为凶险，病死率几乎为100%。犬 不仅用于狩猎、侦破、看门、食肉和作为宠物饲养，犬还是进行生命科学、医学、药学、化工、 农业、军事、环保、航天及生物工程领域应用广泛的重要实验动物之一。随着经济的发展和 人民生活水平的提高，宠物犬的数量在不但增加，犬的活动区域也在不断扩大。从宠物医疗 市场得到的信息，人们迫切希望了解宠物犬接种狂犬疫苗后犬只是否获得保护力，而目前 狂犬病毒抗体的检测工作因受检测条件和费用的限制，没有得到广泛的应用。狂犬病毒是 狂犬病的病原体，而我国又是狂犬病的高发国家，居世界第二位，仅次于印度。由于狂犬病 是人畜共患性疾病，多数的人狂犬病是由与人类密切接触的带毒犬传播的，其危害已经引 起政府和人民的高度关注。目前，用于实验动物包括犬、猴、鼠等狂犬病毒抗体检测的方法和相应的试剂盒， 有一定的研究和报道。但是现有检测狂犬病毒抗体的方法包括普通ELISA方法、荧光免疫 法、放射免疫法及化学发光法等都存在相应的弱点。普通ELISA试剂盒多用原核表达的重 组蛋白或培养的全病毒做包被抗原。重组蛋白存在复性困难，缺乏空间构象表位的缺点，全 病毒存在不易纯化的缺点，这些都会导致检测灵敏度低下。荧光免疫法、放射免疫法及化学 发光法需要一定的实验仪器，且放射免疫法还存在放射性同位素污染的问题。而胶体金免 疫层析法虽然有操作简单的优点，但是灵敏度比较低。中国专利公开号为CN1547027A的专 利申请公开了一种用间接酶免疫吸附试验检测犬狂犬病毒IgG试剂盒及制备方法，中国专 利公开号为CN1547028A的专利申请公开了一种用竞争酶联免疫吸附试验检测犬狂犬病毒 总抗体试剂盒及制备方法，中国专利公开号为CN101413948的专利申请公开了一种犬狂犬 病病毒NP-ELISA抗体检测试剂盒，上述专利所用检测板包被方法均为抗原直接包被法。
发明内容
本发明的目的是提供一种犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒。本发明采 用单克隆抗体包被法间接包被抗原制备反应板，进而组成用间接免疫吸附实验检测犬抗狂 犬病毒IgG抗体的试剂盒，本试剂盒除了具有普通ELISA试剂盒的优点外，还弥补了由于抗 原问题而致的灵敏度低的缺点，从而提高检测的灵敏度和特异性。本发明的技术方案为一种犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有预包 被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、 酶底物溶液和终止液，其特征在于酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液为0. 05M ρΗ9· 6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量为每孔 0. I-Iug ；封闭液为质量浓度是1-10%的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗 原，包被量为每孔0. Ι-lug;样品稀释液为含有质量浓度0. 1-10%牛血清白蛋白BSA和含 有质量浓度0. 01-0. 05% NaN3的0. 01mol/L及ρΗ7· 2-7. 4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合 物为辣根过氧化物酶_兔抗犬IgG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0. 05%吐温-20的 0. 01mol/L及pH7. 2-7. 4的PBS ；酶底物A溶液为3，3’ -5，5’ -四甲基联苯胺溶液，酶底物 B溶液为双氧水溶液；终止液为lmol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。辣根 过氧化物酶标记的是兔抗犬IgG抗体。犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制备方法，按以下步骤进行⑴抗 狂犬病毒单克隆抗体的制备用纯化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗原刺激的脾 脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选杂交瘤细胞， 用ELISA方法和IFA(间接免疫荧光)方法鉴定抗狂犬病毒的杂交瘤细胞株，进行三次亚 克隆化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗狂犬病毒的单克 隆抗体；(2)兔抗犬IgG的制备和辣根过氧化物标记按常规方法提取纯化犬IgG ；免疫家 兔，当兔抗血清ELISA效价达1 32以上时取血清；硫酸铵沉淀纯化；用改良的过碘酸氧化 法进行标记；最后酶标记物加入0. 1-10%牛血清白蛋白、0. 1-10%酪蛋白和50%的中性甘 油，测定工作浓度后，-20°C保存备用；(3)上述各种溶液的配制①样品稀释液0. 1-10% BSA,0. 01-0. 05 % NaN3 的 0. 01mol/L, ρΗ7· 2-7. 4 的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液在 1000ml 的 0. OlM PBS 溶液中加 0. 5ml 吐温-20 (Tween-20)；③酶底物 3，3，-5，5，-四甲基 联苯胺(TMB)溶液i)底物A液称取TMBlOOmg加入IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完 全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩液；ii)底物B液称取乙酸钠IOg溶于IL纯化水，用 乙酸调PH值为5. 0，加入浓度为30% H202400ul即得；④终止液取54. 3ml浓度为95-98% 浓硫酸加蒸馏水至1000ml即可。所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波 破碎、差速离心提取和S印harose 4FF柱过滤纯化，-20°C保存，作为包被用狂犬病毒用抗 原。本发明实验结果及分析1.特异性检测用本发明制造的试剂盒分别检测狂犬病毒免疫犬血清，犬阴性血 清，犬六联疫苗(犬温热病，犬细小病毒病，犬钩端螺旋体病，传染性肝炎，传染性支气管炎 和副流感病)免疫犬血清，操作和判定按照具体实施方式
中犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA 检测试剂盒的操作步骤进行，结果显示，狂犬病毒免疫犬血清检测为阳性，其他样品检测为 阴性，特异性为100%。2.灵敏度检测用本发明制造的试剂盒检测不同稀释度的阳性参考血清，操作和 判定按照具体实施方式
中犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤进行，检 测结果为最高检测到阳性参考样品的稀释度为1 640。
图1为本发明工艺流程图。
具体实施例方式一 .犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的制备方法1.狂犬病毒单克隆抗体的制备用纯化的狂犬病毒抗原免疫BALB/c小鼠，得到抗 原刺激的脾脏细胞，融合该脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞系，利用HAT选择性培养基筛选 杂交瘤细胞，用ELISA方法和IFA方法鉴定抗狂犬病毒的杂交瘤细胞株，进行三次亚克隆 化后得到分泌高特异性的单克隆抗体的细胞株，通过小鼠腹水生产抗狂犬病毒的单克隆抗 体；2.辣根过氧化物酶标记兔抗犬IgG 二抗的制备按常规方法提取纯化犬IgG ；免 疫家兔，当兔抗血清ELISA效价达1 32以上时取血清；硫酸铵沉淀纯化；用改良的过碘酸 氧化法进行标记；最后酶标记物加入牛血清白蛋白、酪蛋白和50%的中性甘油，测 定工作浓度后，-20°C保存备用；3.所述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声 波破碎、差速离心提取和S印harose 4FF柱过滤纯化，-20°C保存，作为包被用狂犬病毒用 抗原；4.将狂犬病毒单克隆抗体均勻的包被在酶标板孔上，包被缓冲液为0.05M pH9.6 的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1. 59g Na2CO3, 2. 93g NaHCO3,包被量为每孔0. I-Iug ；封 闭液为BSA或脱脂牛奶，浓度是1-10% ；封闭完再包被的是狂犬病毒纯化抗原，包被量为每 孔0.I-Iug ；5.试剂盒其他溶液配制①样品稀释液BSA，0.05% NaN3的O.Olmol/L， pH7. 2的磷酸盐缓冲液(PBS)；②洗涤液在IOOOml的0. OlM PBS溶液中加0. 5ml吐 温-20 (Tween-20)；③酶底物3，3’-5，5’ -四甲基联苯胺(TMB)溶液i)底物A液称取 TMBlOOmg加入IOml 二甲基亚砜(DMSO)中，使之完全溶解后即得一百倍的TMB底物浓缩 液；ii)底物B液称取乙酸钠IOg溶于IL纯化水，用乙酸调PH值为5.0，加入浓度为30% H202400ul即得；④终止液取54. 3ml浓度为95%浓硫酸加蒸馏水至IOOOml即可。二、犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒的操作步骤1.将待检样品用样品稀释液10倍稀释，每孔加lOOul，同时加入阳性和阴性对照 液，设空白对照。置37°C孵育1小时，洗涤液洗板5次，甩干，每孔加酶标抗体100ul，37°C 孵育1小时；洗涤液洗板5次，甩干，加入酶底物溶液，每孔100 μ 1，避光显色5-10分钟，加 入终止液，每孔50 μ 1。利用酶标仪在450nm测定光吸收值A450nm.2.结果判定Cut off (CO值)=阴性对照光吸收值A450nmX2. 1倍，样品值=样 品光吸收值A450nm/C0值，样品值大于1判为阳性；样品值小于1判为阴性。
权利要求
一种犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，所述检测试剂盒包含有预包被狂犬病毒抗原酶标板、封闭液、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、酶结合物、浓缩洗涤液、酶底物溶液和终止液，其特征在于酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，即1升溶液中含1.59g Na2CO3，2.93g NaHCO3，包被量为每孔0.1 1ug；封闭液为质量浓度是1 10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1 1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1 10％牛血清白蛋白BSA和含有质量浓度0.01 0.05％NaN3的0.01mol/L及pH7.2 7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)；酶结合物为辣根过氧化物酶 兔抗犬IgG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温 20的0.01mol/L及pH7.2 7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’ 5，5’ 四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。
2.根据权利要求1所述的犬用抗狂犬病毒IgG抗体ELISA检测试剂盒，其特征在于所 述狂犬病毒抗原用狂犬病毒疫苗株在Vero细胞上培养、扩增，经冻融，超声波破碎、差速离 心提取和S印harose 4FF柱过滤纯化，_20°C保存，作为包被用狂犬病毒用抗原。全文摘要
本发明涉及犬用抗狂犬病毒IgG抗体试剂盒，试剂盒内酶标板预先包被抗狂犬病毒单克隆抗体，包被缓冲液为0.05M pH9.6的碳酸盐缓冲液，包被量为每孔0.1-1ug；封闭液为质量浓度是1-10％的BSA或脱脂牛奶；封闭完再包被狂犬病毒纯化抗原，包被量为每孔0.1-1ug；样品稀释液为含有质量浓度0.1-10％BSA和含有质量浓度0.01-0.05％NaN3的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶结合物为辣根过氧化物酶-兔抗犬I gG酶结合物；浓缩洗涤液为含体积浓度0.05％吐温-20的0.01mol/L及pH7.2-7.4的PBS；酶底物A溶液为3，3’-5，5’-四甲基联苯胺溶液，酶底物B溶液为双氧水溶液；终止液为1mol/L H2SO4溶液，阳性对照、阴性对照放置在盒内。本发明试剂盒的特异性达100％；灵敏度为1∶640，本试剂盒用于实验犬、宠物犬和普通犬接种狂犬疫苗后的免疫效果评价。
文档编号G01N33/577GK101936998SQ20101025752
公开日2011年1月5日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者刘汉平, 刘洁, 廖园园, 彭杏, 温文生, 漆世华, 王威, 王小红 申请人:武汉中博生物股份有限公司