重组人抗狂犬病毒抗体的制作方法

专利名称：：重组人抗狂犬病毒抗体的制作方法重组人抗狂犬病毒抗体发明领域本发明涉及重组单克隆抗体，特别是涉及携带人抗体重链恒定区Fc段的用于筛选、表达人抗体scFv-Fc小分子抗体的通用载体在抗体表达文库中的制备方法及其应用，涉及在巴斯德酵母中表达重组人抗狂犬病毒抗体。发明背景抗体分子的突出特点是其功能和分子结构的双重性识别不同抗原需要数量巨大的结构上的多样性；与体内效应系统相互作用需要结构的恒定性。这一特点使抗体分子成为体内最复杂的分子，长期以来一直是人们研究的热点。自19世纪末，以抗原免疫动物获得抗血清的途径一直是获得抗体的经典方法。但由于抗血清含有为数众多的各种不同的抗体，其中某些抗体会针对正常组织细胞产生交叉反应而导致严重后果.因此，长期以来抗血清仅用于中和外源性毒素如蛇毒等，而未能应用于其他疾病的治疗。1975年，KOhler及Milstein建立了制备单克隆抗体的B淋巴细胞杂交瘤技术(Nature(London),256:495,1975)。通过细胞工程可以在体外定向地制备各种单克隆抗体(McAb，以下有时也简称"单抗")，这在抗体生产中是一个具有划时代意义的进展。特别重要的是，单克隆抗体对相应抗原具有的高度特异性以及抗体分子的均质性可大大降低它在体内与正常组织的交叉反应，为利用抗体治疗疾病带来了新的希望。近20年来，单克隆抗体在疾病诊断方面得到广泛应用，在疾病治疗方面也取得了突破性进展。然而，由于McAb多为鼠源性的，这也大大限制了它作为治疗制剂在人体内的应用。进入20世纪后，随着整个基因工程抗体
技术领域：
的发展以及抗体基因结构的阐明，DNA重组技术开始应用于抗体的改造，出现了各种各样的基因工程抗体。这些基因工程抗体或消除了天然抗体的一些不利于应用的特性，或增加了新的生物学功能，从而拓展了抗体的应用范围，改善了抗体的应用性能。与鼠源性单克隆抗体相比，基因工程抗体具有许多优点1)通过基因工程技术的改造，可以最大程度地降低抗体的鼠源性，减少甚至消除人体对抗体的排斥反应；2)基因工程小分子抗体的分子量较小，穿透力强，更易到达病灶的核心部位；3)可以根据治疗的需要，制备多种用途的新型抗体；4)可以采用原核细胞、真核细胞或植物等多种表达体系大量生产抗体分子，大大降低了生产成本。总之，这些基因工程抗体的产生大大增强了单克隆抗体的临床效力，引发了FDA批准治疗性免疫球蛋白和Fab分子上市的浪潮。据统计，目前正处于临床试验中的基因工程抗体约占生物制剂的30%。80世纪末90年代初噬菌体抗体基因库技术的兴起，使通过大规模富集筛选的方法获得特异性强、亲和力高的基因工程抗体成为可能。但是传统的噬菌体抗体库技术由于是基于原核表达体系的抗体库技术，缺乏对表达产物的翻译后修饰功能，从而降低了获得高亲和力基因工程抗体的可能性，因此对噬菌体抗体库进行富集筛选取时可能存在表达产物亲和力低、活性不稳定甚至难以获得特异性基因工程抗体的问题。所以有必要进一步探索和完善基因工程抗体库的制备技术，努力建立一套适用于真核表达体系的基因工程抗体库表达体系。狂犬病是由狂犬病毒引起的中枢神经系统感染的世界性人兽共患传染病，人和动物一旦发病其死亡率达100%。据06年9月卫生部公布数字显示，自5月份起，狂犬病已连续4个月成为我国报告死亡数最高的传染病病种。世界卫生组织(WHO)建议目前最有效的暴露后预防措施为联合应用主动及被动免疫，即同时进行疫苗接种并注射狂犬病抗血清。但来源不足、异源蛋白的副作用以及血液制品的潜在致病性都限制了治疗性免疫球蛋白在狂犬病的暴露后治疗中的应用。随着基因工程技术的发展，基因工程抗体的研制为人们提供了解决问题的新思路。已经有人在大肠杆菌中进行了人源抗狂犬病毒抗体片段Fab和scFv的表达，只是这些小分子抗体还无法完全替代抗血清在体内综合作用，包括抗体依赖的细胞毒性作用和抗体介导的细胞裂解作用等，因此完整的人抗狂犬病免疫球蛋白的生产成为了进一步研究的目标。我们利用本研究室构建的完整人重链及轻链表达载体pPICZaCH和pPICZaCK(见中国专利，申请号200410010991.8)，以来源于人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗体文库的特异性单抗RS3为模板，利用分步整合法转化X33酵母菌对抗狂犬病毒抗体进行克隆及表达，制备具狂犬病毒抗原结合活性的完整人源化抗体，以便满足实验室研究的需求，并为狂犬病的治疗与预防大量提供这类治疗剂。发明目的本发明的一个目的是提供用于毕赤酵母抗体库技术的重组表达载体，特征在于所说的载体同时携带有人重链抗体恒定区的Fc段序列以及供插入scFv抗体片段的适当的限制性内切酶位点。根据本发明载体的一个优选实施方案，其中所说的用于毕赤酵母抗体库技术的重组表达载体是重组质粒pPICZa/Fc。根据本发明载体的一个优选实施方案,其中所说的载体还携带有功能性分泌信号序列。根据本发明载体的一个优选实施方案，人抗狂犬病毒基因工程抗体RS3，包括scFv-Fc小分子抗体及IgG全抗体基因、基因产物及其应用，其中所说的人IgG抗体是通过分步整合法转化宿主细胞获得的完整的人单克隆抗体。本发明的另一个目的是提供被上述重组载体转化的能够在适当的培养条件下表达人抗体分子的宿主细胞。本发明的另一个目的是提供一种新的人抗狂犬病毒基因工程抗体RS3,其主要基因特征在于抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定族互补区域CDR1、CDR2及CDR3中特异性核苷酸系列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，如图6，是所说人抗狂犬病毒基因工程抗体RS3的可变区核苷酸及氨基酸序列，其中重链和轻链各自相应的三个CDR区序列为本抗体特有的全新序列。重链(VH)三个CDR区的氨基酸序列包括CDR1为YTFTSYYIH;CDR2为TINPGGGSTSYAEKFQD;CDR3为DLRGYISNWSTLFMDV。轻链(Vk)三个CDR区的氨基酸序列包括CDR1为RASQDIRKSLN;CDR2为DASNLEA;CDR3为QQYHHLPPWT。人抗狂犬病毒基因工程抗体RS3scFv-Fc抗体，其特征在于为一种可在原核或真核细胞中获得稳定有效表达基因重组的人抗狂犬病毒蛋白基因工程抗scFv-Fc抗体，由重链可变区，轻链(Kappa链)可变区及重链恒定区Fc段组成。其重链恒定区Fc基因来源于载体pPICZalgH，已在专利申请号为200410010991.8的专利申请中陈述。在scFv基因和Fc基因之间含有Apal酶切位点。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的宿主细胞是毕赤酵母细胞。本发明再一个目的是提供如上限定的重组表达载体在毕赤酵母人源抗体库中筛选人抗狂犬病毒scFv-Fe小分子抗体中的应用，以及以分步整合法分泌表达完整的人抗狂犬病毒单克隆抗体中的应用。本发明的一个目的是提供一种使用甲基营养酵母生产重组人抗狂犬病毒抗体的方法，该方法包括在以甲醇为碳源和能源的培养基中培养甲基营养酵母，其中所说的甲基营养酵母是用包括下列可操作地连接的元件的DNA构建体转化的(l)甲基可诱导的转录启动子；(2)编码人抗狂犬病毒抗体的DNA片段；(3)转录终止子和(4)可选择标志，从而在甲基营养酵母中产生人抗狂犬病毒抗体。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母A0X1基因。本发明的另一个目的是提供用于表达重组人抗狂犬病毒抗体的甲基营养酵母，该酵母能够依靠作为碳源和能源的甲醇生长，并且是被包括甲基可诱导的转录启动子、编码人抗狂犬病毒抗体的DNA片段、转录终止子和可选择标志的DNA构建体转化的。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母A0X1基因。本发明的再一个目的是提供用于在巴斯德毕赤酵母中表达重组人抗狂犬病毒抗体的DNA构建体，该构建体包括可操作地连接的元件甲基可诱导的转录启动子、编码人抗狂犬病毒抗体的DNA片段、转录终止子和可选择标志。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的甲基营养酵母是巴斯德毕赤酵母，并且所说的甲基可诱导的启动子和转录终止子均来自巴斯德毕赤酵母A0X1基因。图1显示小分子抗体scFv-Fc表达载体的构建示意图。图2显示重组质粒pPICZo/Fc的ApaI+XbaI双酶消化鉴定图谱泳道13为重组质粒pPICZo/Fc的不同克隆ApaI+XbaI双酶消化结果；泳道4是DNA分子量标志物。图3显示重组混合质粒pPICZo/scFv-Fc不同克隆的酶切消化鉴定图谱泳道15、7、8为重组混合质粒pPICZo/scFv-Fc的不同克隆XhoI+ApaI双酶消化结果；泳道6是DNA分子量标志物；泳道912为重组混合质粒pPICZo/scFv-Fc的不同克隆XhoI+XbaI双酶消化结果。图4显示重组的scFv-Fc小分子抗体在毕赤酵母菌中经甲醇诱导表达后，不同克隆RS3及RS9第3天培养物上清的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及免疫印迹(Western-blot)分析结果其中泳道1为蛋白分子量标志物；泳道2为RS3转化菌的培养物上清的SDS-PAGE结果.;泳道3为RS9转化菌的培养物上清的SDS-PAGE结果；泳道4为RS3转化菌的培养物上清的Western-blot结果；泳道5为RS9转化菌的培养物上清的Western-blot结果。图5显示scFv-Fc小分子抗体RS3的序列分析结果其中I为小分子抗体RS3重链可变区的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列;II为小分子抗体RS3轻链(Kappa链)可变区的核苷酸序列及推导出的氨基酸序列。图6显示完整重链及轻链抗体重组表达质粒分步整合法转化毕赤酵母细胞，提取的酵母工程菌基因组DNAPCR分析结果泳道14，6为扩增重链Fd结果；泳道7,8，10,12,13为扩增全长轻链结果；泳道9，13为空载体转化酵母菌PCR结果；泳道5为DNA分子量标志。图7显示分步整合法转化毕赤酵母，经甲醇诱导表达后，不同克隆培养物上清的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析泳道13为不同克隆培养物上清的SDS-PAGE结果；泳道4为蛋白分子量标志物。图8显示抗狂犬病毒全抗体阳性菌株1L摇瓶发酵培养后，培养物上清初步浓縮、纯化后进行免疫印迹(Western-blot)和ELISA分析结果其中A为非还原条件下，培养物上清Western-blot分析结果；B为还原条件下，培养物上清Westem-blot分析结果；C中泳道12为以狂犬病毒抗原电泳后，培养物上清作为一抗，酶标记羊抗人IgG为二抗的Western-blot分析结果，泳道3诱导前培养物上清Western-blot分析结果。
发明内容本发明涉及scFv-Fc小分子抗体真核表达抗体文库体系的建立，特别是具有狂犬病毒抗原结合活性的人抗狂犬病毒抗体可变区序列的获得及利用所述体系经过筛选获得较高亲和力特异性抗狂犬病毒的scFv-Fv小分子抗体。本发明涉及单克隆抗体，特别是具有狂犬病毒抗原结合活性的完整人抗狂犬病毒抗体序列的获得及其在所述体系中的重组制备。基于大肠杆菌表达系统的噬菌体抗体库技术是目前应用最为广泛的抗体库技术，但受其自身加工能力的限制，缺乏对表达产物的翻译后修饰功能，从而降低了获得高亲和力基因工程抗体的可能性，因此对噬菌体抗体库进行富集筛选取时可能存在表达产物亲和力低、活性不稳定甚至难以获得特异性基因工程抗体的问题。因此，我们特别选择应用酵母表达体系来建立scFv-Fc小分子抗体库，其既具备易于操作，遗传背景清楚，生产成本低等原核生物的特点，又具有真核生物的折叠、分泌机制，可以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程，且生长速度快，培养成分简单，能适应大规模工业化生产的需要。尤其毕赤酵母，它的乙醇氧化酶基因(AOXI)是一个甲醇诱导表达的严格调控基因，启动活性高，渗漏低，在加入甲醇后可以迅速启动转录，更适合高密度培养，这对于提高重组蛋白的产量是至关重要的。而且，毕赤酵母的N—糖基化方式也更接近高等真核生物，因此有可能将其作为建立人scFv-Fc小分子抗体库并且筛选获得高亲和力特异性单抗的另一个重要的异源表达体系。本发明建立的scFv-Fc小分子抗体表达体系的筛选功能不仅限于传统的PCR、RT-PCR及分子杂交等基因水平上的操作，而且可利用其强大的分泌功能构建抗体表达文库，利用抗体的抗原特异结合活性来筛选各种己知或未知的抗体，因此具有较大的灵活性。虽然其克隆能力远低于目前广泛使用于抗体筛选的噬菌体文库，而且库容相对较小，但是相较于传统的基于原核表达体系的噬菌体抗体库技术，其具备真核生物的折叠、分泌机制，可以完成真核生物特异的蛋白酶解、折叠、糖基化等翻译后修饰过程，故有利于筛选得到特异性强的高亲和力抗体，而这是噬菌体文库所不能比拟的。我们利用基因重组技术对毕赤-巴斯德酵母质粒进行重组，并在此基础上提供一套适于克隆和表达各种scFv-Fc小分子抗体的通用工具质粒，建立了可克隆、筛选并表达制备人源scFv-Fc小分子抗体的表达体系。基于本发明的这一抗体库表达系统，我们成功地克隆并筛选获得分泌表达的具较高亲和力的人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗体。各种基因工程抗体的出现在很大程度上改善了抗体性能，增强了单克隆抗体的临床效力，使其更适于临床应用。然而，所有这些改造都是在已有单抗基因基础上针对抗体的某一附属特性的改良，即改变或增加其生物学效应、降低其异源性、改变其药学动力学效应等。已有的人源化鼠单抗(包括对鼠单抗恒定区进行人源化改造得到的人-鼠嵌和抗体和只保留了抗原决定区(CDR区)鼠源性的改型抗体等)均未能完全消除鼠单抗的异源性，而仍可产生不同程度的HAMA,使抗体的效应减弱，且其亲和力也远远低于亲本鼠单抗。另外，这些小分子抗体由于缺乏Fc段介导，不但在体内的半衰期縮短，而且难以通过耙细胞杀伤、细胞吞噬及生物活性物质释放等效应功能来灭活或清除外来抗原以保护机体。因此，各种基因工程抗体都不能完全替代天然抗体发挥作用。所以，我们利用本研究室构建的完整人重链及轻链表达载体pPICZaCH和pPICZaCK(见中国专利，申请号200410010991.8)，以来源于人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗体文库的特异性单抗RS3为模板，利用分步整合法转化X33酵母菌对抗狂犬病毒抗体进行克隆及表达，成功的制备出具狂犬病毒抗原结合活性的完整人源化抗体，从而完成了本发明。为实现上述发明目的，可以按照本领域技术人员已知的技术(如参见分子克隆试验指南，科学出版社，第二版，1999年出版)进行基因的分离或合成、核苷酸片段的消化与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化与培养，以及表达产物的分离与纯化等操作。作为构建本发明的通用工具载体的起始质粒，可使用任何一种能在细菌细胞中稳定保留并复制，并在酵母菌中表达的质粒载体。这样的起始质粒包括但不只限于pPIC3.5，pPIC9，pHIL等。但本发明中优选的是高效表达质粒pPICZa。我们利用基因重组技术，将人抗体重链恒定区Fc基因重组至起始质粒相应的多克隆位点，并利用人工合成的寡核苷酸接头，在载体a信号肽下游分别引入相应的限制性内切酶位点，构建成scFv-Fc小分子抗体库通用表达载体pPICZa/Fc(参见实施例l)。本发明的工具载体pPICZa/Fc携带有人抗体重链恒定区FccDNA，又包括有可供其它基因插入的限制性内切酶位点，因此能够适合各种scFv-Fc小分子抗体库的克隆和重组表达(图l)。这里所说的各种抗体包括完全人源抗体、人源化鼠单抗和抗体融合蛋白等。本发明的另一个目的是应用本发明的这一抗体库表达系统克隆、筛选和表达有用的功能性scFv-Fc小分子抗体分子例如抗狂犬病毒特异性scFv-Fc小分子抗体(参见实施例23)。为了使用我们的人scFv-Fc小分子抗体库表达系统获得特异性抗狂犬病毒抗原的人scFv-Fc小分子抗体，首先使用全套扩增人VH和VK、Vx基因引物由高滴度的抗狂犬病毒抗体阳性血B淋巴细胞基因组中扩增得到全套的人VH和VK、Vx基因，与人工设计合成的Linker基因利用重叠延伸PCR方法组装得到混合scFv小分子抗体cDNA。将此混合scFv小分子抗体cDNA重组到本发明的人scFv-Fc小分子抗体库表达系统中，经甲醇诱导表达、筛选后，获得了具有狂犬病毒抗原结合活性的小分子抗体。本发明制得的抗狂犬病毒抗体具有完全人源的可变区序列。与已发表的抗体序列的同源性比较分析显示，其重链可变区和轻链(Kappa链)可变区各自相应的三个CDR区基因序列均为本抗体特有的全新基因，因此，可以认为该抗体序列是具有狂犬病毒结合活性的新的人源抗体序列(实施例4)。在酵母表达体系中，外源DNA是经过同源重组整合至酵母基因组DNA上进行表达的，表达载体通过同源重组将外源基因整合入酵母菌基因组而随同酵母菌的染色体一起复制，同源重组时，毕赤酵母表达质粒可通过体内和体外两种方式多拷贝的整合于毕赤酵母菌的基因组中，多拷贝的整合在大多数情况下，可显著增加外源蛋白的表达水平。我们利用本研究室构建的完整人重链及轻链表达载体pPICZaCH和pPICZaCK(见中国专利，申请号200410010991.8)构建人狂犬病毒重链、轻链重组质粒，利用分步整合的方法，依次转化酵母感受态细胞X33，随机挑取7个2倍Zeocin抗性克隆并提取酵母基因组DNA进行PCR反应，结果5个克隆均扩增得到了全长轻链和重链Fd抗体cDNA，从而证明了分步整合方法的高整合效率，从而使全长重链及轻链在酵母菌中正确配对成完整、稳定的人抗狂犬病毒完整抗体(参见实施例5)。将筛选获得的人抗狂犬病毒抗体重链可变区cDNA和轻链可变区cDNA，分别重组到本研究室构建的完整人重链及轻链表达载体pPICZaCH和pPICZaCK(见中国专利，申请号200410010991.8)构建人狂犬病毒重链、轻链重组质粒，分步整合的方法转化毕赤酵母。经甲醇诱导表达并纯化后，通过聚丙烯酖胺凝胶电泳、免疫印迹技术鉴定重组抗体分子的完整性，并以酶联免疫吸附方法(ELISA)检测表达产物的狂犬病毒抗原结合活性。结果表明，如上得到的表达产物具有狂犬病毒抗原特异结合活性(参见实施例6)。另外，按本发明上述方法制得的抗狂犬病毒抗原抗体是一种完全的人源全分子抗体，它不同于现有的Fab，ScFv等抗狂犬病毒小分子抗体。本发明的抗体既能够特异识别并结合狂犬病毒抗原，又能够通过其Fc段发挥抗体的效应功能，中和并清除外界侵入的抗原物质，而且不会产生人源化抗体常常引发的HAMA。因此，本发明制备的人源抗体可望用于临床预防和治疗由狂犬病毒引起的狂犬病。本发明涉及蛋白质生产和鉴定方法，特别是涉及在巴斯德酵母中表达人抗狂犬病毒抗体的方法。巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)是20世纪80-90年代发展起来的极具潜力的酵母表达系统，由于其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点而得到越来越广泛的应用。作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母具有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点①属于单细胞生物，故保留了易于操作和生长速度快的特点(可高密度发酵培养，在发酵罐中细胞干重可达130g/L以上)；②营养要求低，培养基成分简单，生产成本低，特别适用于工业化大规模生产；③通过同源重组，可将表达载体稳定地整合到宿主染色体中，连续传代中不易丢失；.④具有强有力的乙醇氧化酶基因(AOX)启动子，可严格调控外源基因的表达；⑤表达量高，许多蛋白的产率可达到每升克以上水平；◎表达的蛋白质既可存在于胞内又可分泌至胞夕卜，巴斯德毕赤酵母自身蛋白质的分泌量很低，十分有利于目的产物纯化；⑦作为真核表达系统，可对表达的蛋白进行翻译后的正确加工和修饰；⑧糖基化程度低。毕赤酵母表达系统由一个外源基因表达框和AOX1启动子、多克隆位点(MCS)和一个从A0X1基因上拷贝下来的终止序列(TT)组成。同时，大多数载体都包含作为筛选标记的HIS4基因和为拷贝增殖而存在的序列(如ColEI复制起始点和抗氨苄青霉素基因)。另外，还含有使外源基因能以替代或插入方式整合到染色体的A0X1部位的A0X13'非编码区序列。本发明所使用的载体是由启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点等元件构成。另外分泌型载体还需要有信号肽序列。最常用的启动子是A0X1启动子，它的甲醇诱导性很强，因而它控制下的外源基因能得到较高的表达。细胞中绝大多数乙醇氧化酶活力是由A0X1提供的。当在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，A0X1转录受到抑制；而在以甲醇为唯一生长碳源时，则可诱导A0X1基因的转录和蛋白质表达。选择标记(HIS4)—般是对应于营养缺陷型受体的野生型基因。巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白质很少，所以分泌表达是一种理想的表达方式。同时，胞外表达更有利于蛋白质的提取和纯化。本发明优选的信号肽是ct因子(aMF)。ct因子信号序列由87个氨基酸组成，来自于啤酒酵母(S.cerevsia)的a性成熟因子前导序列，并且己将这段序列编码的信号肽插人到巴斯德毕赤酵母的表达载体中。本发明的巴斯德毕赤酵母表达载体可以是胞内表达的，也可以是分泌表达的。这些载体都包括一个由0.9kb的5'A0X1序列片段和约0.3kb的转录终止基因的3'序列组成的表达盒。分泌型表达载体可以是pPIC9,pPIC9k、pHIL-Sl、pPICZa、pYAM75P6E6等；胞内表达的载体可以是pHIL-D2、pA0815、pPIC3K，pPICZ，pHWO10E121，pGAPZ、pGAPZa等。本发明优选的是pPICZa。一般用于外源基因表达的巴斯德毕赤酵母菌株包括Y-11430、M-6100-3、GS115、KM71、SMD1168等，本发明优选的是巴斯德毕赤酵母X-33菌株。得到携带目的基因的重组表达载体后，可使用锂盐法、PEG法、原生质球法和电穿孔法等方法转化巴斯德毕赤酵母宿主细胞。其中，本发明优选的转化方法是电穿孑L法(参见Sambrook，ed.MolecularCloning:ALaboratoryManule(2nd.ed.)，Vols.l-3，ColdSpringHarborLabomtory(1998))。导入酵母体内的重组表达载体只有与酵母染色体上的同源区发生重组，整合到染色体上，外源基因才能够稳定存在并得以表达。本发明中，为了稳定地表达目的基因，可以在His或5'AOXl的单酶切位点将质粒载体线性化，使之通过单交换整合到酵母细胞染色体中，从而得到表型为Mut+并具有高甲醇利用能力的转化子。用于本发明的巴斯德毕赤酵母含有典型高等真核生物的许多翻译后修饰功能。这些功能包括信号肽的加工、蛋白质折叠、二硫键的形成、O-及N-型糖基化和酰化等。其中，最重要和研究最多的是糖基化作用。蛋白质的糖基化链参与细胞识别、激素受体结合、蛋白质定位及宿主一微生物间相互作用。糖基化过程是经一系列剪接并产生由Mans-6-GluNAC2(高甘露糖型)组成的寡核糖的反应。巴斯德毕赤酵母能够将碳水化合物连接到分泌表达的外源蛋白质上。巴斯德毕赤酵母修饰糖链的平均长度为814甘露糖，而且外链不含a-l，3甘露糖，所以其表达的糖蛋白特别适于治疗应用。绝大多数情况下，巴斯德毕赤酵母(P.Pastoris)中整合多拷贝外源基因会提高重组蛋白表达产量，所以本发明优先选择分泌型、高拷贝标记和易操作的穿梭载体，特别是pPICZa作为人抗狂犬病毒抗体的表达载体。另外，由于在His位点整合时，染色体突变的His位点可与表达盒的HIS4基因位点之间发生基因交换会导致表达盒的丢失，故一般优先选择AOXl位点。本发明中，发酵培养所使用的培养基可以是BMGY/BMMY，BMG/BMM,MGY/MM等培养基，但优选的是成分中含有缓冲液的BMGY/BMMY或BMG/BMM培养基。作为唯一的碳源和能源，甲醇的加入量一般为培养体积的0.5-1.0%(V/V)。发酵培养过程中，可使用已知的方法检測由被转化细胞分离物所产生的人抗狂犬病毒抗体含量，并从中选择有高产率的细胞分离物，用于放大生产。可使用饱和硫酸铵盐析、离子交换层析、亲合层析等方法分离并纯化所需的人抗狂犬病毒抗体。本发明首次在酵母(毕赤酵母X-33)中高效分泌表达了人抗狂犬病毒抗体，建立了稳定的人抗狂犬病毒抗体毕赤酵母高效表达体系。与在大肠杆菌中的表达相比，本发明的方法具有如下特点①表达体系稳定，含目的基因的表达盒通过同源重组整合进入酵母的染色体中，菌种稳定，不存在质粒丢失的问题；②有效的分泌表达，目的蛋白质的表达受醇氧化酶启动子的严格控制，可在甲醇诱导下启动表达并将表达产物分泌到培养基中，而且毕赤酵母本身的蛋白很少分泌到培养基中，使目的蛋白更易于纯化；③表达产量高；④不存在内毒素污染问题；⑤大规模发酵生产成本低。具体实施方式以下借助实施例描述本发明的最佳实施方式。这些实施例旨在进一步举例阐明本发明，而不是以任何方式限制本发明待批权利要求的范围。实施例1:pPICZo/Fc表达载体的构建1.1PCR扩增人抗体Fc片段取质粒pPICZa-H(含有人抗体重链全长序列)lOOng，扩增Fc上游引物5，一TAAGGGCCCCTGAGCCCAAATCTTGTG—3'(SEQID跳1)扩增Fc下游引物5，一CCGTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGG—3，(SEQIDNO:2)利用这两条扩增Fc引物在0.2mlEP管中建立以下反应体系上述cDNA反应液20^1MgCl26^110xLAPCR缓冲液8^1TaKaRaLATaqlpl扩增Fc上游引物ljil扩增Fc下游引物lul灭菌蒸馏水终体积lOOul在PCR仪上进行循环扩增。扩增程序为①94°C2min②94°C30s，58°C30s,72°C1.5min，28个循环③72°ClOmin扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小，确定是否获得可重组到表达载体pPICZa的目的基因(产物上、下游分别带有ApaI和XbaI酶切位点)。1.2PCR产物的回收将PCR扩增的Fc片段经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下用手术刀片切下相应分子大小的条带，称重后移入EP管中。根据DNA片段纯化/回收试剂盒说明进行回收。1)按凝胶重量加入3倍体积的溶液B(6MNaC104，0.03MNaAcpH5.2,少量酚红)，65"C水浴溶化凝胶。2)将溶液移至含树脂的离心柱中，静置2min，8000g离心60s。3)加入0.5ml溶液C(100mMNaClpH7.5，10mMEDTApH7.5，50mMTris陽HClpH7.5)8OOOg离心60s。4)重复上述步骤，15000g再离心甩干柱内残余液体。5)将离心柱置于新的EP管中，加入5(TC预热的溶液D(TE),静置2min,15000g离心60s，管底即为所需DNA。1.3在pPICZa表达载体中插入人工合成的寡核苷酸1)将人工合成的互补的寡核苷酸FhTCGAGAAGAGACATCTGTTGTAGACTCACGGGCCCG(SEQIDNO:3)及F2:AATTCGGGCCCGTGAGTCTAC:AACAGATGTCTCTTC(SEQIDNO:4)各取l吗加入TE至40nl体积，IOO'C煮沸15min，缓慢冷却至室温。互补链退火后分别形成带有Xhol和EcoRI粘性末端的接头，且在EcoRI位点前引入了Apal位点。XhoI和EcoRI消化pPICZa表达载体，按上述方法回收后，与人工合成寡核苷酸16'C连接过夜。连接反应体系如下人工合成寡核苷酸0.10.3pmd载体pPICZa0.03pmo110x连接缓冲液"1T4DNA连接酶1^1灭菌蒸馏水终体积iow2)感受态细胞的制备①从37'C培养16h的XL广Blue阴性培养板上挑取单个菌落(直径23mm)，接种于含有100mlLB培养基的1L培养瓶中，250r/min，37"C震荡培养3h。②每隔2030min测定OD600,待其达到0.35时，取出含有菌液的培养瓶，冰上放置10min，使培养物冷却至(TC。③4。C，4000r/min离心10min收集细胞。④倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。⑤用60ml预冷过的O.lmol/LCaCl2-MgCl2溶液(80mmol/LMgCl2，20mmol/LCaCl2)重悬细胞沉淀。4°C,4OOOr/min离心10min，回收细胞。⑦倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。⑧用4ml预冷过的O.lmol/LCaCl2重悬细胞沉淀。(D加入DMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min。⑩再加入14(^1DMSO，轻轻旋转混匀，冰上放置15min。无菌分装，-80°C冻存备用3)重组质粒的转化①取一份冻存的感受态细胞冰上融化，加入上述连接产物，轻轻混匀。②冰浴30min。③将反应管放入预热至42'C的循环水浴中，恰恰放置90s，不要摇动。④快速取出反应管并移置冰上12min。⑤加入800WSOC培养基，用水浴将培养基加温至37。C，然后将管转移到摇床上，225r/min震荡培养lh，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。⑥取200W已转化的感受态细胞涂布于含Zeocin(25ng/ml)的LB平板，37'C培养箱倒置培养1216h。4)重组载体的鉴定①随机挑取转化后的单菌落，接种于25mlLB培养基中，37'C强烈震荡培养过夜。②取0.5ml菌液，置于1.5mlEP管，加入等体积酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，用振荡器最大速度振荡lmin，充分混匀。③4。C，12OOOg离心5min，取上清0.45ml左右，移至另一个EP管中，加入等体积异丙醇混匀，4°C，12OOOg离心5min。弃上清，加0.5ml75%乙醇洗涤。⑤重复上述步骤，室温下空气蒸发残存乙醇◎lOjxlTER(含Rnase的TE)溶解沉淀，从中取出1^1进行琼脂糖凝胶电泳，同时进行酶切鉴定。⑦Apal+BglII双酶消化鉴定，1%琼脂糖凝胶电泳，根据内切酶谱鉴定正确克隆。⑧DNA测序。1.4pPICZo/Fc表达载体的构建利用合成的短链寡核苷酸链于pPICZa表达载体的a信号肽3'末端引入Apal位点，与载体上的XbaI酶切位点供基因重组到载体pPICZa相应的内切酶部位。因此用Apal+Xbal消化Fc片段PCR回收产物和载体pPICZa，按上述方法回收后常规连接，同前转化感受态细胞，挑取单菌落，提取质粒DNA,以ApaI+XbaI双酶消化鉴定并进行DNA测序。结果如附图2所示。实施例2:抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗体库表达质粒的构建献血志愿者为经过法国PM株Vero细胞纯化疫苗全程免疫(上臂三角肌注射)，且抗体滴度达到相应保护水平者。采血20ml(取lmli分离血清后用于抗体检测)，分别放入无菌肝素抗凝管中。用淋巴细胞分离液，分离提取淋巴细胞，而后用Trizol法，提取总RNA。2.1总RNA的提取2丄1淋巴细胞的分离1)加入等体积平衡盐溶液稀释外周血，缓慢混匀。2)离心管内加入淋巴细胞分离液(10ml血加入35ml分离液)，倾斜45。C，距液面lcm处沿管壁缓缓加入稀释血。3)于室温条件下2000r/min离心30min，离心管内液体分为血浆层、灰白层(淋巴细胞)、淋巴细胞分离液和红细胞层。4)吸取灰白层，用5倍体积的平衡盐溶液洗涤2次(依次以2000r/min、1500r/min于室温离心30min),收集淋巴细胞立即用于RNA的提取或存于-80。C备用o2.1.2Trizol法提取总RNA1)在上述提取淋巴细胞中加入5mlTrizo1，充分吹打混匀。2)加入lml氯仿(200nl/mlTrizol)，充分振荡摇匀，室温下放置5min。3)于4'C，12000g离心15min。4)将上层水相移至另一干净离心管中。5)加入等体积异丙醇，振荡摇匀，室温沉淀10min。6)4°C,12000g离心15min，弃上清。7)加入75%乙醇lml洗涤沉淀，4°C，12000g离心5min。8)重复上述步骤，室温下空气蒸发残存乙醇。9)将总RNA沉淀溶于50plDEPC处理的水中，-80°〇保存备用。10)取lpl稀释100倍后经紫外分光光度计测定浓度和纯度，琼脂糖凝胶电泳观察RNA的完整性。RNA含量按下面公式计算-RNA(pg/ml)=4(^0026(^稀释倍数OD260/OD280=1.82.0表示纯度合格2.2RT-PCR克隆人抗体重链及轻链可变区(VH、Vk及VX)cDNA及鉴定l)RT反应取总RNA样品1吗，加入1^01igodT，70。C变性10min，冰浴lmin，然后加入下列反应液MgCl24nl10xRNAPCR缓冲液2^1RNA酶抑制剂0.5nldNTP2^1AMV逆转录酶1^1无RNA酶灭菌水终体积20^1于PCR仪上42'C反应60min,然后99°C5min灭活逆转录酶，合成cDNA-2(TC保存备用。2)PCR反应利用VH、Vk及VX克隆引物，其中VH克隆上游引物为VH1:5，一SAGGTGCAGCTGSWGSAGTCKGG—3'(SEQIDNO:5)VH2:5，~CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG—3，(SEQIDNO:6)VH3:5，~CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG~3，(SEQIDNO:7)VH4:5，~GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC_3，(SEQIDNO:8)VH克隆下游引物为VHbl:5，一TGARGAGACGGTGACCRKKGTSCC—3，(SEQIDNO:9)VHb2:5，一TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC—3'(SEQID跳10)VK克隆上游引物为-Vk1:5，~GAMATYSWGWTGACSCAGTCTCC_3'(SEQIDNO:11)Vk2:5，一GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC—3'(SEQIDNO:12)Vk3:5,~GAAACGACACTCACGCAGTCTCC—3，(SEQIDNO:13)Vk4:5，一GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC—3'(SEQIDNO:14)vk克隆下游引物为VkM:5，一ACGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC—3，(SEQIDNO:15)Vicb2:5，一ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC—3，(SEQIDNO:16)VKb3:5，一ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC—3'(SEQID跳17)VX克隆上游引物为VX1:5，~CAGTCTGYSYTGACKCAGCCKSC—3'(SEQIDNO:18)VX2:5，一TCYTMTGWGCTGACTCAGSMMCC—3，(SEQIDNO:19)TO:5，~CACGTTATACTGACTCAACCGCC—3'(SEQIDNO:20)锡5'—CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC—3，(SEQIDNO:21)VX5:5，一AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA—3，(SEQIDNO:22)VX克隆下游引物为VXB:5,—ACCTARRACGGTSASCTKGGTCCC—3，(SEQIDNO:23)在0.2miEP管中建立以下反应体系上述cDNA反应液20jxlMgCl26nl10xLAPCR缓冲液8nlTaKaRaLATaqlpl克隆上游引物克隆上游引物灭菌蒸馏水终体积100^1在PCR仪上进行循环扩增，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。3)回收VH、Vk、VX片段PCR产物，分别常规连接入pMD-T载体，DNA测序鉴定PCR所得VH、Vk、VX片段。2.3scFv抗体片段的组装2.3.1利用VH、linker及Vk组装scFv分别回收上述RT-PCR克隆所得VH、Vk片段，与相应linker(kappa链)GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACGTTTGAT(SEQIDNO:24)，通过重叠延伸PCR方法组装scFv。用于扩增scfv上游引物SI:5，_TTACTCGAGAAGAGASAGGTGCAGCTGSWGSAGTCKGG—3'(SEQIDNO:25)S2:5，一TTACTCGAGAAGAGACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG—3，(SEQIDNO:26)S3:5，一TTACTCGAGAAGAGACAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG—3'(SEQIDNO:27)S4:5，一TTACTCGAGAAGAGAGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC—3'(SEQIDNO:28)用于扩增scFv下游引物(kappa链)SkM:5，一ATTGGGCCCGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC_3，(SEQIDNO:29)SKb2:5'—ATTGGGCCCGTTTGATATCCACTTTGGTCCC—3'(SEQIDNO:30)SKb3:5，一ATTGGGCCCGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC—3，(SEQIDNO:31)1)纯化的VH片段和Vk片段各1ug，250nglinker(kappa链)片段，5P110XPCR缓冲液(含Mg2+)，5110mraol/L的dNTP混合液，最后加去离子水至50uL进行PCR反应，反应程序为94。C5min后，加入0.5y1(2.5U)Taq聚合酶；94。Clmin，60°C4min，72°C2min，进行25个循环；72°C延伸10min。2)于上述反应液中加入lPl(2.5U)Taq聚合酶，5pl10XPCR缓冲液(含Mg2+)，2P110mmol/L的dNTP混合液，2y1扩增scFv上游引物，2n1扩增scFv下游引物(kappa链)，最后加去离子水至50ul。进行PCR反应，反应程序为94°Clmin，55°C2min，72°C2min，进行30个循环；72°C延伸10min。1%琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。2.3.2利用VH、linker及组装scFv分别回收上述RT-PCR克隆所得VH、片段，与相应linker(lambda链)GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACCTARRAC(SEQIDNO:32)，通过重叠延伸PCR方法组装scFv。用于扩增scFv下游引物(lambda链).SX1):5，一ATTGGGCCCCTARRACGGTSASCTKGGTCCC—3，(SEQIDNO:33)2.4scFv-Fc小分子抗体表达质粒pP[CZo/scFv-Fc的构建PCR扩增上述组装所得scFv片段，常规方法回收。扩增产物用XhoI+Apal消化后与相应限制性内切酶消化的pPICZo/Fc表达载体常规连接。1)超级感受态细胞的制备参见《分子克隆》相应章节。2)连接产物转化超级感受态细胞XLrblue，将此转化产物接种于5mlSOC培养基，37C培养1小时后，取10020(^l涂含有Zeocin抗性的平皿，剩余菌液转入一三角瓶，加入10mlLB培养基(含Zeocin25pg/ml),37。C振摇1小时后，加入LB培养基至100ml左右，37C振摇过夜。随机挑取Zeocin平板上菌落1020个，小提质粒后，以XhoI+Apal双酶消化鉴定，检测scFv片段的插入效率。结果如附图3所示。实施例3:scFv-Fc小分子抗体在毕赤酵母中的表达3.1线性化重组质粒的制备scFv-Fc重组质粒pPICZo/scFv-Fc转化超级感受态细胞XLrblue，37。C振摇过夜培养后所得菌液，按质粒提取试剂盒说明进行提取。1)用1.5mlEP管收集35ml菌液，12000g离心30s，吸干上清；2)加入150^1溶液B(50mMTris-Cl,1OmMEDTA),10^1溶液A(RNaseA)，充分振荡悬浮，室温放置5min;3)加入300pl溶液C(l%SDS,0.2MNaOH)，温和反复颠倒混匀46次，室温放置5min;4)加入45(^1溶液D(4M盐酸胍)，反复颠倒混匀46次；5)12000g离心5min，去沉淀；6)将上清置于离心柱中，静置2min;7)8000g离心30s,弃下清；8)加入50(HU溶液E，8000g离心30s,弃下清；9)加入500nl溶液F，8000g离心30s，弃下清；10)12OOOg再次离心lmin以甩干残余液体；11)将离心柱置于新的离心管中，室温敞开离心管盖放置510min，加入305(Hd预热的溶液G(TE)，保温5min，12000g离心lmin，管底即为质粒DNA;12)取重组质粒15吗，以限制性内切酶PmeI消化，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀；13)线性化的质粒用15pl二蒸水溶解，置冰上备用。3.2酵母感受态的制备1)从毕赤酵母X33的YPD阴性培养板上挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，225r/min，30'C震荡培养8h。2)取其中500^1菌液接种于含150mlYPD培养基的培养瓶中，225r/min，3(TC震荡培养过夜。3)监测OD6(K)，待其达到1.31.5时，取出含有菌液的培养瓶置于冰上，放置10min，使培养物冷却至0'C。4)4°C，1500r/min离心5min收集细胞。5)倒出培养液，将管倒置lmin以使最后的痕量培养液流尽。6)用2S0ml预冷过的二蒸夸重悬细胞沉淀，4°C，l500r/min，离心5min。7)125ml预冷过的二蒸水重悬细胞沉淀，4'C，1500r/min，离心5min。8)20ml预冷过的lMD-山梨醇重悬细胞沉淀，4°C，1500r/min，离心5min。9)500pl预冷过的lMD-山梨醇重悬细胞沉淀，轻轻旋转混匀，置于冰上，当天使用。3.3转化1)分别取80pl上述感受态菌，与不同质量的线性化重组表达质粒混合(分别为100ng、500ng、l吗、2吗、5吗、IO吗)，移入0.2cm电转化杯，冰浴5min。2)擦干水汽，置电转仪上，选择酵母参数fimgi-pulse，电转化。3)立即加入lml冰浴的山梨醇，将混合物转到1.5mlEP管中。4)30。C静置孵育12h。5)分别取50100nl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100jig/ml)的YPD平板，3(TC培养箱倒置培养23天，观察转化子的生长。3.4转化子的表达1)从scFv-Fe小分子抗体转化菌的YPD培养板上分别挑取10个Zeocin抗性克隆接种于10mlBMGY培养基中，30。C震荡培养24h，至00600达2.06.0收集细胞。2)10mlBMMY重悬细胞沉淀，30'C震荡培养，诱导表达。在诱导过程中，每2411补充一次甲醇至终浓度0.5%，同时补充灭菌二蒸水，使发酵液总体积保持不变。'3)在培养O天，l天，2天，3天，4天，5天等时间点各取lml发酵液，离心菌体，上清利用兰州生物制品研究所抗狂犬病抗体ELISA检测试剂盒，进行初步蛋白活性筛选分析。4)如此重复三轮小分子抗体的表达、筛选。实施例4:scFv-Fc小分子抗体表达产物狂犬病毒抗原结合活性分析4.1阳性转化子酵母基因组DNAPCR分析经过三轮筛选，煮冻煮法提取所得阳性酵母克隆菌株基因组DNA，利用扩增VH、Vk、VX引物分别进行PCR扩增，扩增所得产物回收后连接入pMD-T载体，进行DNA测序，以确定VH、Vk、VX片段序列及分类。4.2不同阳性克隆RS3、RS9的ELISA分析1)scFv-Fc小分子抗体表达的检测用0.1M的NaHC03(pH8.6)溶液包被抗人IgG抗体(1:1000稀释)，4'C过夜；4%脱脂奶封闭，37°C1小时；加入表达上清，37°C1小时；加入酶标抗人IgG二抗(1:800稀释)，37。Cl小时；兰州所显色液显色，2MH2S04终止反应，检测490nm处的光吸收值。2)scFv-Fc小分子抗体抗原结合活性的检测根据兰州生物制品研究所抗狂犬病抗体ELISA检测试剂盒，分别对RS3和RS9第96h蛋白表达上清进行ELISA检测。表1不同克隆RS3和RS9scFv-Fc小分子抗体的表达和抗原结合活性分析(^土5)阳性对照阴性对照空白RS3RS9<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>从表1所示的结果可以看出，克隆RS3和RS9具有较好的scFv-Fc小分子抗体表达及狂犬病毒抗原结合活性。4.3SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分别取ELISA检测阳性scFv-Fc小分子抗体，培养上清进行SDS-PAGE(分离胶12%,浓缩胶5%)。每孔加样60pl，40V电泳至浓縮胶与分离胶交界处，调整电压到IOOV，恒压电泳至分离胶底部，考马斯亮蓝染色分析。结果如附图4所示。4.4WesternBlot分析1)常规SDS-PAGE(分离胶12%,浓縮胶5%)。2)剪1块与凝胶大小相同的硝酸纤维素膜(NC膜)和6块3mm滤纸。3)将剪好的滤纸与纤维素膜在转移缓冲液(48mmoi/LTris，39mmol/L甘氨酸，20%甲醇)中浸泡35min。4)待电泳结束后，取下凝胶，按以下顺序安装阳极侧~^海绵一3张滤纸一NC膜一凝胶一3张滤纸一海绵一阴极侧。在放置每一层时，均要去除它们之间的气泡，以免影响转移效果。5)用塑料支架夹紧上述各层，置于转移电泳仪内，以恒流200mA转移2h。6)取下NC膜，用铅笔在膜的上缘作好标记。将膜置于平皿中，加入20mmol/LTris-Cl(pH7.5)室温漂洗10min。7)加入2。/。BSA(其量以浸过膜即可)室温条件下轻轻振荡2h。8)加入洗涤液(20mmol/LTris-Cl，pH7.5;0.2%Tween20)室温漂洗2次，510min/次。9)将纤维素膜放入杂交袋内，加入1:500稀释的山羊抗人IgG-HRP，室温条件下摇动孵育23h。10)取出纤维素膜，加入洗涤液室温漂洗4次，510min/次。TMB试剂显色，成像。结果如附图4所示。实施例5:人抗狂犬病毒全长重链及轻链抗体表达质粒的构建以来源于人抗狂犬病毒scFv库的特异性单抗RS3基因为模板，分别进行PCR扩增VH及Vk基因，按如下比例建立PCR反应体系人抗狂犬病毒scFv库的特异性单抗RS3基因50ng;含Mg^的10xPCR缓冲液lOpl;dNTPs8^1(各2.5腿ol/L);VH上游引物为5，-CAGGTCGACCTGCTGCAGTCGGGGGC-3，(SEQIDNO:34)VH下游引物为5，-CTAGGGCCCGAAGAGACGGTGAC-3，(SEQIDNO:35)。它们分别含有内切酶Sail和Apal(划线部位)的识别序列。Vk上游引物为5'-CGAACTAGTGTTGACCCAGTCTCCA-3，(SEQIDNO:36)，vk下游弓I物为5，-AGCCGGTCCGCGTTTGATTTCCACT-3，(SEQIDNO:37)。它们分别含有内切酶Spel和Cpol(划线部位)的识别序列。反应体系中含上述引物均为lpl(20pmol尔l);Taq酶lpl(5U尔1);灭菌超纯水至终体积10(^1。PCR反应条件是94°C4分钟；94°C30秒，56°C30秒，72°C1分钟，共28个循环，然后72°C8分钟。对扩增产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析，观察片段大小，确定是否得到正确目的基因。(2)人抗狂犬病毒全长重链及轻链抗体表达质粒的构建完整重链及轻链表达载体pPICZaCH及pPICZaCK由本实验室自己构建，已将人CH及Ck基因重组到表达载体pPICZaC上，并在载体a信号肽3'末端分别引入了Spel及Sail识别序列，供可变区基因插入(见中国专利，申请号200410010991.8)。分别进行0.8%琼脂糖凝胶电泳分析回收PCR扩增的VH和Vk基因片段。回收后，分别将VH和Vk基因片段用Sail+ApaI(VH)和Spel+CpoI(Vic)消化，完整重链及轻链表达载体pPICZaCH及pPICZaCK也分别用相应的内切酶消化，分别将获得的VH和Vic基因片段重组到载体相应的内切酶部位，构建成表达质粒。连接反应体系包括酶切后的目的基因片段(VH和Vk基因片段)0.10.3pmol;相应酶切后的完整重链及轻链表达载体(pPICZaCH及pPICZaCK)0.03pmol;DNA连接酶200U和10x连接缓冲液1^1;灭菌超纯水至终体积IOW，16。C连接30分钟。按照常规方法，从37'C培养16小时的XL,-Bhie阴性培养板上(不含抗生素的LB琼脂平板)挑取单个菌落(直径23mm)，接种于含有100mlLB培养基的1L培养瓶中，以制备感受态大肠杆菌细胞，并于-8(TC冻存备用。取一份冻存的感受态细胞融化后，加入上述连接产物，进行常规转化。然后取200^1已转化的感受态细胞涂布于含Zeocin(25ng/ml)的低盐LB琼脂平板上，37"培养箱中培养1216小时。(3)重组载体的鉴定随机挑取转化后的单菌落，接种于含Zeocin(25ng/ml)的低盐LB培养基中，37'C强烈震荡培养过夜，然后常规提取质粒DNA。取lpl溶解的DNA沉淀物进行琼脂糖凝胶电泳定量分析和酶切鉴定。内切酶鉴定可见Sall+Xbal消化出现1400bp左右片段(VH+CH)，Spel+Cpo1消化出现700bp左右片段(Vk+Ck),挑选酶切鉴定正确的克隆，提取质粒，用于DNA序列分析。实施例6:重组人抗狂犬病毒全长抗体的表达(1)人抗狂犬病毒全长重链抗体表达质粒转化宿主细胞取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取2025吗pPICZo/(VH+CH)重组质粒经Pmel酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用10nl超纯水溶解后置冰上备用。从毕赤酵母X-33的YPD阴性培养板上(不含抗生素的YPD琼脂平板)挑取单个菌落，接种于5mlYPD培养基中，250rpm,3(TC震荡培养8小时，以常规制备酵母电转化感受态细胞。然后取80pl上述感受态菌，与2025吗线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50100nl转化后的菌液涂布于含Zeocin(100ng/ml)的YPD平板上，3(TC培养箱培养23天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法(扩增人抗体重链Fd基因引物，其它反应条件同上)筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定。而后按照实施例7中的方法进行重组重链抗体的表达分析，筛选出高表达的重链抗体菌种。(2)人抗狂犬病毒全长抗体表达菌株的获得取测序正确的培养菌液，按质粒提取试剂盒说明书提取质粒DNA并用琼脂糖凝胶电泳法进行定量分析。取2025吗pPICZo/(VK+CK)重组质粒经Pmel酶消化(线性化)后，用酚/氯仿抽提并用乙醇沉淀。线性化的质粒用l(Hil超纯水溶解后置冰上备用。取上述筛选出的重链抗体表达阳性菌株，接种于5mlYPD培养基中，250rpm,3(TC震荡培养8小时，以常规制备酵母电转化感受态细胞。然后取80nl上述感受态菌，与2025吗线性化的重组表达质粒混合，移入0.2cm电转化杯内进行电转化。取50100pl转化后的菌液涂布于含不同Zeocin浓度(100pg/ml，15(^g/ml，170ng/ml，190ng/ml，200ng/ml)的YPD平板上，30。C培养箱培养23天，观察转化子的生长状况。然后用PCR方法(分别使用扩增人抗体重链Fd基因引物和扩增人抗体轻链全长基因，其它反应条件同上)筛选转化酵母菌。离心回收菌体后，以玻璃珠法提取酵母基因组DNA并进行PCR鉴定，鉴定结果如附图6所示。而后按照实施例7中的方法进行重组抗体的表达分析，从而获得人抗狂犬病毒全长抗体表达菌株。实施例7:重组人抗狂犬病毒全长抗体的表达产物抗原结合活性分析1.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)用SDS-PAGE法进行蛋白质分子量测定和初步定量分析。方法如下配制10%分离胶5%浓縮胶。分别取不同时间点和不同克隆的培养物上清按4:1比例加入5xSDS样品缓冲液，混匀后，煮沸35分钟。取上述样品，冷却至室温后，离心(10000rpm)30秒，取上清每孔加样20^1。40V电泳至浓縮胶与分离胶交界处，调整电压到IOOV，继续恒压电泳分离。考马斯亮蓝染色并脱色后，观察分析结果。结果如附图7所示。2.将狂犬病免疫球蛋白表达阳性酵母菌株接种于1L摇瓶发酵，0.5%甲醇诱导，表达上清经过硫酸铵沉淀浓缩后，进行Western-blot及ELISA分析。(1)表达产物的Western印迹分析按照常规方法将狂犬病毒抗原经SDS-PAGE后，转印到硝酸纤维素(NC)膜上，室温干燥3060分钟。将上述NC膜置于平皿中，加入20ml封闭液(含0.2。/。BSA的TTBS)，室温轻轻振荡23小时或4"C封闭过夜。封闭结束后，将NC膜放入杂交袋中加入表达的人抗狂犬病全抗体，室温振荡14小时。膜用TTBS漂洗35次后，用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体至1:2001:1000，加入杂交袋中，与NC膜一起室温振荡24小时。加入lml0.3%(W/V)NiCl或CoCl2及10^130%&02溶液。洗膜后，将膜移入显色液中，室温下轻轻摇动并观察显色反应。结果如附图8所示。(2)重组人抗狂犬病毒抗体的ELISA分析狂犬病毒抗原进行包被，5%脱脂奶粉封闭，依次滴加不同时段表达的人抗狂犬病全抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG为二抗，兰州所显色液显色，加入lmol/L硫酸终止反应后，检测490nm处的光吸收值。结果如图9所示。表2克隆R5抗狂犬病毒抗体诱导表达后不同时段的发酵上清的ELISA分析结果(xts)<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>从表2所示的结果可以看出，克隆R5完整抗体表达上清具有良好的狂犬病毒抗原结合活性。序歹lj表<110>吉林圣元科技有限公司<120>重组人抗狂犬病毒抗体<140><141><160>6<210>1<211>27<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>1TAAGGGCCCCTGAGCCCAAATCTTGTG<210>2<211>29<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>2CCGTCTAGATCATTTACCCGGAGACAGGG<210>3<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的互补的寡核苷酸。<400>3TCGAGAAGAGACATCTGTTGTAGACTCACGGGCCCG<210>4<211>36<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工合成的互补的寡核苷酸。<400>4AATTCGGGCCCGTGAGTCTACAACAGATGTCTCTTC<210>5<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4SAGGTGCAGCGSWGSAGTCKGG<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4CAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4GAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4TGARGAGACGGTGACCRKKGTSCC<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4TGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC<210>11<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4GAMATYSWGWTGACSCAGTCTCC<210>12<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4GATGTTGTGATGACTCAGTCTCC<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4GAAACGACACTCACGCAGTCTCC<210>14<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4GAAATTGTGCTGACTCAGTCTCC<210>15<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4ACGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC<210>16<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4ACGTTTGATATCCACTTTGGTCCC<210>17<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4ACGTTTAATCTCCAGTCGTGTCCC<210>18<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4CAGTCTGYSYTGACKCAGCCKSC<210>19<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4TCYTMTGWGCTGACTCAGSMMCC<210>20<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4CACGTTATACTGACTCAACCGCC<210>21<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4CAGGCTGTGCTCACTCAGCCGTC<210>22<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4AATTTTATGCTGACTCAGCCCCA<210>23<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>"C223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4ACCTARRACGGTSASCTKGGTCCC<210>24<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>k卿a链linker。<400>4GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACGTTTGAT<210>25<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>々23〉根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGASAGGTGCAGCTGSWGSAGTCKGG<210>26<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGACAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG<210>27<211>38<212>DNA<213>人工序列<220><223>根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGACAGGTCAACTTAAGGGAGTCTGG<210>28<211>38<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4TTACTCGAGAAGAGAGAGGTGCAGCTGTTGCAGTCTGC<210>29<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4ATTGGGCCCGTTTGATYTCCASCTTGGTCCC<210>30<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4ATTGGGCCCGTTTGATATCCACTTTGGTCCC<210>31<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv询PCR扩增引物。<400>4ATTGGGCCCGTTTAATCTCCAGTCGTGT(〕CC<210>32<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>lambda链linker。<400>4GGTTCCGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTTCTGGTGGTGGTGGTACCTARRAC<210>33<211>32<212>DNA<213>人工序列<220>〈23〉根据特定核苷酸序列设计的用作扩增scFv的PCR扩增引物。<400>4ATTGGGCCCCTARRACGGTSASCTKGGTCCC<210>34<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>^23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>4CAGGTCGACCTGCTGCAGTCGGGGGC<210>35<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>〈23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建表达载体的PCR扩增引物。<400>4CTAGGGCCCGAAGAGACGGTGAC<210>36<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>《23〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCRT增引物。<400>4CGAACTAGTGTTGACCCAGTCTCCA<210>37<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉根据特定核苷酸序列设计的用作构建克隆载体的PCR扩增引物。<400>4AGCCGGTCCGCGTTTGATTTCCACT权利要求1.本发明涉及一新的重组人抗狂犬病毒抗体及应用。2、本发明所涉及的重组人抗狂犬病毒抗体，其主要特征在于应用毕赤酵母人源抗体库对人抗狂犬病毒scFv-Fc小分子抗体进行分泌型表达筛选。3、本发明所涉及的重组人抗狂犬病毒抗体，其主要特征在于应用毕赤酵母并以分步整合法对完整的人抗狂犬病毒抗体进行了分泌型表达。4、本发明所涉及的重组人抗狂犬病毒抗体，其主要特征在于抗体蛋白功能由存在于抗体基因轻链和重链可变区的决定簇互补区(ComplementDeterminingRegions,CDRs)CDR1、CDR2和CDR3中特异性核苷酸序列决定的，其相应的氨基酸序列构成了抗体的特异性抗原结合区域，如说明书附图。5、本发明所涉及的重组人抗狂犬病毒抗体，其主要特征在于其轻链和重链各自相应的三个CDR序列为本抗体特有的全新序列。重链三个CDR区的氨基酸序列包括CDRl为YTFTSYYIH;CDR2为T鹏GGSTSYAEKFQD;CDR3为DLRGYISNWSTLFMDV。轻链三个CDR区的氨基酸序列包括CDRl为RASQDIRKSLN;CDR2为DASNLEA;CDR3为QQYHHLPPWL6、重组人抗狂犬病毒抗体RS3scFv-Fc抗体，其特征在于为一种可在原核或真核细胞中获得稳定有效表达基因重组的人抗狂犬病毒蛋白基因工程scFv-Fc抗体，由重链可变区，轻链(Kappa链)可变区及重链恒定区Fc段组成。其重链恒定区Fc基因来源于载体pPICZaIgH,已在专利申请号为200410010991.8的专利申请中陈述。在scFv基因和Fc基因之间含有Apal酶切位点。7、本发明所涉及的重组人抗狂犬病毒抗体，其主要功能特征在于特异性狂犬病毒抗原结合活性，具有中和狂犬病毒和抗狂犬病毒感染的活性。8、根据上述7条权利要求，重组人抗狂犬病毒抗体的用途特征在于利用上述获得中和性抗体的决定簇互补区、可变区、scFv-Fc或全抗体基因，可以在任何其他原核及真核细胞中表达和生产此抗体基因或以此为基础改建后的含有此抗体基因的任何其他基因，获得具有中和狂犬病毒感染的抗体产物，其基因表达产物可望在临床上用于预防和治疗由狂犬病毒引起的狂犬病。9、根据权利要求4和5中所述的CDR氨基酸序列为本抗体特有的抗体序歹U，任何新的工程抗体可变区基因或相关产物基因不应含有与上述任何两种CDR序列完全相同或基本同源的序列。全文摘要本发明涉及重组人源抗体的生产方法，特别是涉及重组人抗狂犬病毒抗体的生产方法。其主要特征在于该重组抗体是由存在于抗体重链和轻链基因可变区中的高变区(CDRs)特异性基因序列决定的并可在原核和真核细胞中获得表达的特异性结合狂犬病毒的中和性抗体。其今后的可能用途在于利用该抗体中CDR区或部分或全基因，可在原核细胞和真核细胞的任何表达系统中生产该抗体，可在临床上用于预防和治疗狂犬病。文档编号C12N15/13GK101235086SQ20071005530公开日2008年8月6日申请日期2007年2月2日优先权日2007年2月2日发明者王丁丁,颜炜群申请人:吉林圣元科技有限责任公司