一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体，所述抗体包括轻链和重链，其中轻链可变区氨基酸序列见SEQ?ID?NO.3，重链可变区氨基酸序列见SEQ?ID?NO.4，本发明通过酶联免疫实验和免疫转印实验，证实了所述抗体能够与狂犬病毒特异性的结合。本发明所述的中和抗体能够有效检测狂犬病毒，对其检测的灵敏度达0.06ng/ml。本发明所述的抗体能够用于制备检测、治疗狂犬的试剂盒和药物。本发明公开了上述抗体的制备方法。本发明所述的抗体为全人源抗体使用安全、无副作用，可用于大规模生产。
【专利说明】一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，具体而言涉及一种全人源抗狂犬病毒的中和抗体，本发明还涉及所述抗体的制备方法与其在制备治疗或检测狂犬病毒药物或试剂盒中的应用。
【背景技术】
[0002]单克隆抗体，是指仅由一种类型的细胞制造出来的抗体。单克隆抗体由可以制造这种抗体的免疫细胞与癌细胞融合后的细胞产生的，这种融合细胞既具有瘤细胞不断分裂的能力，又具有免疫细胞能产生抗体的能力。融合后的杂交细胞(杂种瘤)可以产生大量相同的抗体。应用于医疗中时，在识别抗原中的显示微小变化有助于减小副作用。由单克隆抗体做成的抗体药是目前治疗多种疾病的有效方法。单克隆抗体的体外抗病毒中和活性和体内保护机体抵抗病毒攻击已获得许多实验证明，如鼠抗甲肝病毒、汉坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、CMV病毒等中和性单克隆抗体可以在体内100%保护动物免受病毒攻击。单克隆抗体具有三种独特的作用机制，分别为靶向效应、阻断效应和信号传导效应。单克隆抗体药物主要在治疗肿瘤、自身免疫性疾病和感染性疾病等方面疗效突出。
[0003]单克隆抗体药物发展经历了四个阶段，分别为:鼠源性单克隆抗体、嵌合性单克隆抗体、人源化单克隆抗体和全人源单克隆抗体。在第一个阶段中，鼠源单克隆抗体是用小鼠制备的普通单克隆抗体药物，一方面抗体不能有效的激活人体中补体和FC受体相关的效应系统，被人体免疫系统识别产生人抗鼠抗体(HAMA)，在人体循环系统中很快被清除掉，另一方面它毒副作用明显，常引起人体的不良反应，大大制约了其在临床实验及相关应用领域的发展；第二代人鼠嵌合性单抗药物对小鼠抗体表面氨基酸残基进行人源化改造，使其人源化程度达到70%左右，仍有很大的毒副作用；而后出现的第三代人源化单抗的人源化程度达到95%左右，更加接近于人体自身的抗体，大大降低了毒副作用。全人源抗体是从人体免疫B细胞中直接分离，作为治疗性抗体基本没有排异反应，具有不可替代的优势。人源化及全人源单克隆抗体由于副作用小，在体内停留时间长，更有利于治疗。
[0004]狂犬病是一种由狂犬病病毒引起的人畜共患传染病，发病后致死率为100%。该病广泛分布于世界各地，平均每年约有5万多人死于狂犬病(Knobel DL，et al.2005)。中国是狂犬病的高发区，居亚洲(亚洲是世界高发区)第二位。我国著名科学家中国科学院院士吴阶平教授在中华医学会第21次全国代表大会上所作的《开拓进取、迎接21世纪》的报告中，把狂犬病与艾滋病、病毒性肝炎、癌症和吸毒被列为21世纪的重点防治疾病。一旦被携带狂犬病毒的动物咬伤，最有效的防治方法是尽快使用抗狂犬病毒的中和性抗体。
[0005] 目前用于狂犬病的紧急预防性治疗药物主要是血源性免疫球蛋白，人抗狂犬病毒免疫球蛋白(humanrabies immune globulin, HRIG)和马抗狂犬病毒免疫球蛋白(Equinerabies immune globulin,ERIG)。现在中国使用的大部分是马源的狂犬病毒中和性免疫球蛋白(ERIG)。因为是异源性血清，ERIG的副反应极大，可引起血清病或过敏性休克。人源的狂犬病血清现也有少数几家公司生产，但是因为要用免疫过人的血清，其产量非常有限，价格昂贵，而且与所有的血清制品一样，有传染其他疾病的可能。[0006]鉴于此，本领域急需建立全人源无副作用的单克隆抗体来代替血清制品。为解决上述问题本发明人通过单细胞PCR等技术，筛选得到全人源抗狂犬病毒的中和抗体，本发明所述抗体具有全人源、特异性强、可以体外大量制备适用于大规模工业化生产。
【发明内容】
[0007]用异源血清中和狂犬病毒会引起严重的副作用，虽然用人源血清中和狂犬病毒效果相对较好，但也存在以下缺陷:一方面产量低，无法满足市场需求，另一方面也存在因使用血清制品获得其他传染病的风险。为解决上述问题，本发明提供了一种全人源抗体，所述抗体能够有效中和狂犬病毒，没有副作用，同时可以用于大规模生产。
[0008]本发明通过收集抗狂犬病毒免疫球蛋白滴度较高的志愿者的外周血，分离特定的浆细胞，通过钓取单个细胞的抗体基因，并在体外表达，做功能验证实验，筛选得到I株中和活性较好的抗狂犬病毒的抗体R064。将抗体R064的基因序列进行测序，得到其基因序列，通过分析进一步得到其蛋白序列，通过比对，得出其骨架区和可变区的氨基酸序列。所述单克隆抗体R064包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID NO=USEQ ID NO:2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示。
[0009]本发明所述的单克隆抗体R064的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示。所述单克隆抗体R064的重链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1XDR2、⑶R3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10 所示。
[0010]本发明通过PeliClass human IgG subclass ELISA kit抗体分型试剂盒鉴定了R064抗体的免疫蛋白分型。
[0011]本发明通过ELISA实验检测了单克隆抗体R064与狂犬病毒的结合活性，结果显示本发明所述的单克隆抗体R064与狂犬病毒的结合具有剂量依赖性，说明所述抗体的结合是特异性的结合。本发明通过灵敏性实验检测，结果显示本发明所述的抗体对狂犬病毒的最低检测浓度达到0.06ng/mL.[0012]本发明通过体内中和活性检测，结果显示本发明所述的单克隆抗体R064对狂犬病毒具有良好的中和活性。
[0013]基于上述筛选克隆得到的抗狂犬病毒抗体R064的轻、重链可变区基因，可构建和表达多种小分子基因工程抗体，如单链抗体、单域抗体、嵌合抗体、抗体融合蛋白、Fab抗体、Fab'、F(ab)2等；其中所述的单链抗体如单链Fv ;或任何其他重组的、或⑶R接枝分子；或重链和轻链可变区可结合其他适当的抗体区域。
[0014]本发明的所述的抗狂犬病毒抗体分子R064或其片段也可连接化学物部分。这些化学物部分可以是多聚物、荧光标记物、细胞毒性因子、放射性核素等。化学物部分优选可提供抗体在体内半衰期的多聚物。适合的多聚物包括(但不限于)聚乙二醇、右旋糖酐和
单甲基聚乙二醇。
[0015]本发明抗体和抗体片段可以连接荧光或化学发光标记物，如荧光团如稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、异硫氰酸酯、藻红蛋白、水母发光蛋白标记物、生物素/亲和素、旋光标记物和稳定自由基。
[0016]本发明抗体和抗体片段分子也可交联细胞毒性因子，例如白喉毒素、蓖麻毒素A链、α.八叠球菌、Phytoiacca americana蛋白、PAP I, PAP II和PAPS、苦瓜抑制物、局限
曲霉素、酹霉素和依诺霉素。
[0017]对本发明的抗体或抗体片段对应的氨基酸或核苷酸序列进行浅显的或微小的修改也在本发明的保护范围内，包括(但绝不限于)把一个氨基酸残基替换成另外一个具有类似特征的氨基酸。具有特征类似的氨基酸被本领域所熟知。例如可互相替换的极性/亲水氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、半胱氨酸、苏氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、天冬氨酸和谷氨酸；可互相替换的非极性/疏水氨基酸，包括甘胺酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸；可互相替换的酸性氨基酸，包括天冬氨酸和谷氨酸；可以互相替换的碱性氨基酸，包括组胺酸、赖氨酸和精氨酸。
[0018]本发明所述的抗体、抗体片段或抗体突变体的表达，可通过标准的分子生物学技术，将获得编码部分或全长轻链和重链的DNA，克隆到不同的表达载体中，使该基因有效地连接于转录和翻译控制序列。选择和使用的表达宿主细胞相容的表达载体和表达调控序列。该抗体轻链基因和抗体重链基因可以插入到不同的载体，或者更通常地，这两种基因都被插入到同一个表达载体中。通过标准方法(例如，连接抗体基因片段和载体上的互补性限制位点，或者，如果不存在限制位点，进行平端连接)将该抗体基因插入到表达载体中。本文所述的该抗体的轻链和重链可变区可用于产生任何抗体同类型的全长抗体基因，其通过以这样的方式将它们插入到已经编码期望的同种型的重链恒定区和轻链恒定区的表达载体，使得VH片段有效连接到载体中的重链恒定(CH)片段，VL片段有效连接到载体中的轻链恒定(CL)片段。此外或可选地，该重组表达载体可以编码促进宿主细胞分泌抗体链的信号肽。该抗体链基因可以被克隆到载体中，使得信号肽符合读码框地连接抗体链基因的氨基端。该信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽(即源自非免疫球蛋白的信号肽)。
[0019]本发明的抗狂犬病毒抗体分子可通过重组技术生产在原核细胞中表达。如将编码本发明抗体分子的核酸插入到PET的质粒中，并在大肠杆菌/T7系统中表达。将重组后的表达载体可以通过任何已知的方法导入宿主细胞。将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法为本领域所熟知，包括右旋糖酐 介导的转染、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染、原生质体融合法、电穿孔法、多核苷酸的脂质体包封、生物枪注射以及把DNA直接显微注射进细胞核内。
[0020]本发明的抗狂犬病毒抗体分子可通过重组技术生产在真核细胞中表达。作为表达宿主的哺乳动物细胞为本领域所熟知，包括许多可从美国菌种典藏中心(ATCC)获得的永生细胞系。这些细胞系主要包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝癌细胞、549A细胞、3T3细胞、以及许多其他细胞系。通过测定哪株细胞系具有高表达水平而选出特别优选的细胞系。其他可用的细胞系包括昆虫细胞系、两栖动物细胞、细菌细胞、植物细胞以及真菌细胞。当把编码重链或其抗原结合部位、轻链和/或其抗原结合部位的重组表达载体导入哺乳动物宿主细胞时，可通过培养此宿主细胞持续足以使抗体能够在宿主细胞中表达的一段时间而产生此抗体,或更优选地，使抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中。
[0021]本发明抗狂犬病毒抗体R064的表达，优选在293T细胞中表达具体步骤如下:
[0022]1.将抗狂犬病毒抗体R064的重链与轻链可变区基因克隆到pcDNA3.3上，得到重组表达载体。[0023]2.将重组表达载体用转染试剂共转染293T细胞，转染后6_8小时换新鲜培养基，并在37°C 5% CO2培养箱中培养48-72小时。
[0024]3.收集转染上清,离心弃去细胞碎片,使用蛋白(Protein)A亲和层析法进行抗体纯化。
[0025]本发明的抗狂犬病毒抗体R064或抗原结合片段与可药用的载体一起组合制备成药剂组合物。尽管本发明的范围包括了可通过任何途径(例如通过口、盐、局部或肺)施用于受试者的药剂组合物，但优选通过静脉注射途径。
[0026]可药用载体为本领域所熟知，如包括生理相容的水性和非水性载体、稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、抗微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收减缓剂等类似物。优选的载体要适于注射进入受试者体内。
[0027]可用于本发明药物组合物的合适的水性和非水性载体的例子包括水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等等)及他们的适当组合、植物油，例如橄榄油、以及可注射的有机酯，例如油酸乙酯。通过使用例如外衣材料(如卵磷脂)、通过在分散状态保持所需的颗粒大小，以及通过使用表面活性剂，可保持合适的流动性。
[0028]可药用的抗氧化剂的例子包括:水溶的抗氧化剂如抗坏血酸、盐酸半胱氨酸、硫酸氢钠等；油溶的抗氧化剂如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚(BHA)、丁基羟基甲苯(BHT)等。
【专利附图】
【附图说明】
[0029]图196孔板单细胞抗体基因的PCR琼脂糖凝胶电泳图；
[0030]图2单克隆抗体R064的蛋白电泳图，1:未处理的R064蛋白，M:蛋白marker，2:变性后R064蛋白的重链和轻链；
[0031]图3免疫转印验证单克隆抗体R064与狂犬病毒特异性结合，1:常温条件保存的R064蛋白，2:4°C条件保存的R064蛋白，3:_20°C条件保存的R064蛋白；
[0032]图4酶联免疫吸附试验检测单克隆抗体R064与狂犬病毒的结合；
[0033]图5单克隆抗体R064与狂犬病毒结合的灵敏性检测。
【具体实施方式】
[0034]通过参阅下述实施例可以更容易地了解本发明的内容，这些实施例只是为进一步说明本发明，并不意味着限定本发明的范围。
[0035]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0036]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0037]实施例一 R064单克隆抗体的筛选
[0038]选取5-10名正常人志愿者，签署《知情同意书》，分别注射狂犬疫苗。选择上述样本中抗体效价最高且浆细胞比例最高的时间点，抽取志愿者血液10_15ml，利用密度梯度离心的方法分离外周血单个核细胞(PBMC)。细胞计数后利用BD流式细胞仪分选CD3-，CD19+，⑶27+的单个B细胞到96孔PCR板中，使PCR板中每个孔含有一个B细胞，_80°C冻存备用。
[0039]用PCR的方法从单个B细胞中分离抗体可变区基因
[0040]I)反转录合成cDNA第一条链:将含有单个B细胞的96孔板加入各亚型重链与轻链的恒定区引物与反转录酶，涡旋混匀，42°C反应I小时，95°C加热5分钟，然后置于冰上，反转录得到cDNA ；
[0041]2)PCR分离抗体基因:配制PCR体系，包括RT反应产物，Taq酶，dNTPs，及各亚型重链与轻链抗体的特异性引物，经过95°C预变性3分钟，变性30秒，62°C退火30秒，72°C延伸30秒等进行30个PCR循环。PCR产物用1.2%的96孔琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，结果见图1。
[0042]将凝胶电泳鉴定为阳性的基因片段进行测序，通过IMGT软件对其测序结果进行分析，将从同一样品孔中筛选得到的均有功能的一对重链、轻链可变区基因分别利用TA克隆的方法连接到pcDNA3.3载体上。
[0043]将连接产物转化DH5a感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB平板上37°C培养16小时，随机挑取12个单菌落用特异性引物进行PCR鉴定，在阳性转化子中鉴定出了含有抗体重链或轻链基因的转化子。
[0044]通过ELISA结合实验,筛选得到I株结合活性较好的抗狂犬病毒的抗体,命名为R064。
[0045]将抗体R064的基因序列进行测序，测序结果显示单克隆抗体R064轻、重链可变区核苷酸分别如序列表中SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4所示。用www.expasy.0rg在线软件将编码R064单克隆抗体的轻、重链可变区核苷酸序列翻译为其编码的氨基酸序列，R064的轻、重链可变区氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，根据Kabat数据库确定轻链可变区序列中的 互补决定区CDRl、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID N0:5、SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示。重链可变区序列中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如序列表中SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示。
[0046]实施例二 R064单克隆抗体表达纯化
[0047]1.材料
[0048]ImoL/L TRIS_HCL、0.1moL/L 磷酸缓冲液、293T 细胞、Protein A Sepharose CL4B蛋白柱购自北京本元正阳生物技术有限公司。
[0049]2.方法和结果
[0050]将配对的重链与轻链基因表达载体用PolyFect (Qiagen, Valencia, CA)转染试剂共转染293T细胞，转染后6-8小时换新鲜培养基，并在37°C 5% CO2培养箱中培养48-72小时。
[0051]收集表达上清，离心弃去细胞碎片，加入ImL pH8.0，0.1moL/L磷酸缓冲液并用ρΗ9.0, ImoL/L TRIS-HCL调整pH至9.0。把细胞上清加入已经用0.1moL/L磷酸缓冲液pH8.0平衡好的Protein A Sepharose CL4B蛋白柱中，用上述缓冲液洗柱子,直到流出液中检测不到杂蛋白为止。用PH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱，收集流出液，并立即用ImoL/LpH8.5TRIS-HCL缓冲液中和，用pH7.2,0.0lM PBS透析72h。取样在紫外分光光度计上测0D260、0D280，计算蛋白质含量，然后置于4°C保存，纯化后单克隆抗体R064的蛋白电泳图见图2。
[0052]实施例三单抗R064重链同种型(Isotype)的鉴定
[0053]1.材料[0054]PeliClass human IgG subclass ELISA kit (Catalog No:M1551)、ELISA包被液、PBST、TMB、H2SO4。
[0055]2.方法与结果
[0056]具体操作方法参照说明书，最后置于450nm下测量吸光度。
[0057]结果如表1，可以看出单克隆抗体R064的重链为IgGl。
[0058]表1单克隆抗体R064重链种型鉴定
[0059]
【权利要求】
1.一种抗狂犬病毒的单克隆抗体及其片段，包括轻链⑶R1-3和重链⑶R1-3，其特征在于，所述轻链⑶R1-3的氨基酸序列为: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:5所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:6所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:7所示； 所述重链⑶R1-3的氨基酸序列为: CDRl:如序列表中SEQ ID NO:8所示； CDR2:如序列表中SEQ ID NO:9所示； CDR3:如序列表中SEQ ID NO:10所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体及其片段，其特征在于，所述轻链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示，所述重链可变区的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。
3.编码权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段的核苷酸。
4.权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备检测狂犬病毒的试剂、药剂或试剂盒中的应用。
5.权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段在制备治疗狂犬病毒的药物中应用。
6.一种载体，其特征在于，所述载体含有编码权利要求1-2任意一项所述的单克隆抗体或其片段的核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞含有权利要求6所述的载体。
8.一种药用组合物，特征在于，所述的药物组合物含有权利要求1-2中任意一项所述的单克隆抗体或其片段和药学上可接受的载体。
9.权利要求8所述的药物组 合物，其特征在于，所述的药学上可接受的载体为稳定剂、抗氧化剂、溶剂、分散介质、外衣层、抗微生物剂、缓冲液、血清蛋白、等渗和吸收减缓剂中的一种或多种。
10.权利要求1或2所述的全人源的单克隆的抗狂犬病毒中和抗体在发现有效中和抗原表位及开发狂犬病毒重组蛋白及亚单位疫苗中的用途。
【文档编号】G01N33/569GK103467598SQ201310442989
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月26日 优先权日:2013年9月26日
【发明者】李姝 , 余小玲, 王月明 申请人:北京泰诺迪生物科技有限公司, 广州泰诺迪生物科技有限公司