专利名称：一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物疫病检测，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒，同时还涉及一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒用途，适用于检测猪血清中的伪狂犬病毒gE蛋白抗体水平。
背景技术：
伪狂犬病(Pseudorabies,PR)是由伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus, PrV)引起的包括家畜和多种野生动物的一种以发热、奇痒及脑脊髓炎为症状的重要传染病。该病给养猪业造成了巨大的经济损失，猪是本病的天然宿主和储存者。预防、控制和最终根除该病是我国当前面临的一项艰巨任务。在伪狂犬病的根除计划中，监测和检测猪血清中伪狂犬病病毒gE蛋白抗体是非常重要的一个环节。因为目前市面上的伪狂犬疫苗基本上都是 gE基因缺失的疫苗，接种疫苗的猪只，血清中不含有猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体。如果检测出了 gE蛋白抗体，说明猪已经被伪狂犬病病毒的野毒感染。可将感染的猪淘汰，彻底根除伪狂犬病。目前国内检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体一般采用间接ELISA方法等，这些方法敏感性不高，因次不可避免会对实际结果造成误判。本发明应用猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体及阻断ELISA检测技术，使试剂盒具有很好的敏感性和特异性。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒， 该试剂盒的优点是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的的单克隆抗体，提高了检测的灵敏性和特异性。本发明的另一个目的是在于提供了一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒的应用。将猪伪狂犬病毒作为抗原包被于ELISA板上，然后加待检血清孵育，再加入酶标记的猪伪狂犬病毒gE单抗，显色时应出现两种情况，如果待检血清是阳性，那么此时加入的酶标单抗就会被阳性血清中的抗体阻断，酶标仪检测数值就会越低。如果是待检血清阴性，那么酶标单抗就会继续与ELISA板上猪伪狂犬病毒抗原反应，得到的数值就会越高。 该试剂盒特异性好、敏感性高。与美国IDEXX公司猪伪狂犬病毒gl蛋白抗体ELISA试剂盒的检测符合率为97%。有着良好的应用前景。为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的杂交瘤细胞株2E6分泌的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株 (该伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定，畜牧兽医学报，1998年02期)。
所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、洗涤液、显色液A、 显色液B、终止液。所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的阳性对照为猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清。所述的洗涤液为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含 O. 25%体积比氢氟酸溶液。所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有O. 2mg/mL TMB pH5. O的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述的样品稀释液液为含2. 5mg/mL的明胶的DMEM培养基。所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术(参见文献沈关心、周汝麟，现代免疫学实验技术，武汉湖北科学技术出版社，，1998)，用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂 A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT (购自SIGMA公司)选择性培养基进行培养后，再用猪伪狂犬病毒鄂A株和伪狂犬病gE/gl基因缺失株(参见中国发明专利申请公开说明书，专利申请号200510019513. 8)进行间接免疫荧光筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清和猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗免疫的阴性对照血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为2E6。一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是I)从试剂盒中取出酶标板(包被有病毒抗原的检测板)，用样品稀释液将待检血清做2倍稀释(60 μ L样品稀释液和60 μ L待检血清混合)，取100 μ L混合液加入酶标板中，同时阳性对照和阴性对照各加2孔，每孔ΙΟΟμ L。2)轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37°C温育45分钟。3)弃去孔中的溶液，加入洗涤液，200 μ L/孔，静置3分钟倒掉，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。4)每孔加酶标单抗100 μ L，置37°C温育20分钟后洗板5次(方法同步骤3)。5)每孔加显色液A、显色液B各一滴(约50 μ L)，混匀，室温(18 25°C，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(约50 μ L)，10分钟内用酶标仪测定每孔OD63tol 读值。本发明试剂盒判定标准为试验成立条件是阴性对照孔平均OD63tol值与阳性对照孔平均OD63tlnm值之差大于或等于O. 3。S =样品孔OD63tlnm值，N =阴性对照孔平均OD63tlnm值。 若S/N比值小于或等于O. 35，样品判为PRV-gE抗体阳性。若S/N比值小于或等于O. 4但大于O. 35，该样品必须重测，如果结果相同，则过一段时间后重新从动物取样进行检测。若S/ N比值大于O. 4，样品判为PRV-gE抗体阴性。本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果I.由于酶标单克隆抗体的使用，特异性好，灵敏度高。2.检测时间短，一般I. 5个小时内即可出结果；
3.结果判定采用S/N比值法，科学合理，准确性高。实施例I :一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的杂交瘤细胞株2E6分泌的单克隆抗体，所述的猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A 株(该伪狂犬病毒鄂A株来源见参考文献陈焕春等，猪伪狂犬病病毒鄂A株的分离鉴定， 畜牧兽医学报，1998年02期)。所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、洗涤液、显色液A、 显色液B、终止液。所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液。所述的阳性对照为猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清，所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清。所述的洗涤液为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含
O.25%体积比氢氟酸溶液。所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有O. 2mg/mL TMB pH5. O的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液。所述的样品稀释液液为含2. 5mg/mL的明胶的DMEM培养基。所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术(参见文献沈关心、周汝麟，现代免疫学实验技术，武汉湖北科学技术出版社，，1998)，用纯化的猪伪狂犬病毒(鄂 A株)免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)进行细胞融合，用HAT (购自SIGMA公司)选择性培养基进行培养后，再用猪伪狂犬病毒鄂A株和伪狂犬病gE/gl基因缺失株(参见中国发明专利申请公开说明书，专利申请号200510019513. 8)进行间接免疫荧光筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清和猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗免疫的阴性对照血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选到一株具有阻断效果的单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为2E6。试剂盒组装试剂盒含96孔ELISA检测板2块，酶标抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体I瓶 (20mL/瓶)，阴、阳性对照各2管(I. 5mL/管)，样品稀释液I瓶(50mL/瓶)，20倍浓缩洗涤液I瓶(30mL/瓶)，底物液A、底物液B、终止液各I瓶(IOmL/瓶)，附说明书I份。20倍浓缩洗涤液160克氯化钠、IOml Tween-20溶入IOOOml蒸馏水中。封闭液含O. 5% BSA的磷酸盐缓冲液。样品稀释液为含有质量百分含量为O. 25%的明胶的DMEM培养基。 终止液O. 25 %体积比氢氟酸阳性、阴性对照的制备将筛选获得的猪伪狂犬病毒标准阳性血清按1000U/ml加入青霉素和链霉素，无菌过滤，作为阳性对照；将筛选获得的猪标准阴性血清，按1000U/ml加入青霉素和链霉素， 无菌过滤，作为阴性对照。实施例2 :抗原包被板的制备
病毒培养及纯化BHK细胞用含10%体积比小牛血清的DMEM于37°C培养，细胞长成单层后,倒掉上清,接种少量病毒,加维持液(含3%体积比小牛血清的DMEM)，液体刚盖住细胞层即可，37°C吸附I小时后，添加维持液至原来培养细胞时的体积，37°C温箱继续培养，待80%以上细胞出现病变时，将细胞瓶置_20°C冰箱中，反复冻融3次，收集病毒液。收集的病毒液5000r/min 4°C离心30min去沉淀。上清用27000r/min 4°C离心I小时,沉淀用少量pH7. 20. 01mol/L PBS重悬。以PBS制备质量分数20%、35%、45%和60%质量体积比的不连续梯度蔗糖，加样品至梯度界面上，4°C 27000r/min离心90min。收集45%浓度处的蛋白带至离心管中，用PBS稀释重悬，27000r/min离心2小时脱糖。最后用PBS悬浮沉淀。_20°C保存备用。将病毒抗原用pH9. 6的碳酸盐缓冲液稀释为500ng/mL，按100 μ L/孔加于聚苯乙烯微孔板中，4°C放置过夜·甩干；按150 μ L/孔用含O. 5% BSA ρΗ7. 4的磷酸盐缓冲液4°C 封闭I小时、甩干；按100 μ L/孔用含20%质量体积比蔗糖ρΗ7. 4的磷酸盐缓冲液室温保护3小时；置干燥室干燥后，装入含干燥剂的包装中密封保存。实施例3 :抗伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体的制备及标记饲养细胞的制备在融合前一天，取一只正常雌性BALB/c鼠，颈椎脱臼处死，75%体积比酒精消毒 5min，甩干后移入超净工作台内，固定于经紫外消毒的泡沫板上，用灭菌眼科剪、弯头镊子剪开皮肤(不可损伤腹膜)，经钝性剥离使腹膜充分暴露。用IOmL—次性注射器吸满含 20%体积比胎牛血清的HAT选择培养液注入小鼠腹腔，右手固定注射器不动，左手用镊子夹取酒精棉轻揉小鼠腹部，再用注射器抽出腹腔内的培养液，注入灭菌平皿中，加上述培养液调整细胞密度至IO6个/mL，用多道移液器分种至4块96孔细胞培养板，每孔IOOuL,置 37°C,5% C02培养箱中培养。制备免疫脾细胞取合适浓度的纯化PRV病毒抗原与等体积佐剂充分混匀，免疫5周龄的Balb/C小鼠，注射剂量为60 100微克。每间隔两周皮下免疫一次、连续免疫三次后，融合前3天腹腔加强免疫。第一次免疫时使用弗式完全佐剂，第二、三次使用弗式不完全佐剂，加强免疫时不使用佐剂。取经最后加强免疫的BALB/c鼠，眼球摘除放血，分离血清作阳性对照用。将小鼠按上法进行消毒和剥离皮肤，无菌取出脾脏，放入已盛有基础培养液的平皿中清洗，剥离结缔组织。将脾脏移入另一盛有IOmL基础培养液的平皿中，用针头在顶端穿孔，用一次性无菌注射器吸取5mL基础培养液，从脾脏一端缓慢注入，使液体从脾脏另一端针孔流出，重复 3次。将脾细胞悬液转至IOmL无菌离心管中，IOOOrpm离心lOmin，细胞沉淀用基础培养基离心洗涤一次，然后将细胞重悬，计数后备用。制备骨髓瘤细胞在融合前两周将在液氮中冻存的SP2/0骨髓瘤细胞取出复苏，用加有8-氮鸟嘌呤的1640完全培养基选择培养三代，以保持HGPRT缺陷型。选择生长旺盛，形态良好的细胞作种子细胞用1640完全培养基进行扩大培养。融合当天，取刚好处于对数生长期，形态良好的细胞(细胞浑圆、透亮、大小均一、排列整齐，呈半致密分布)，IOOOrpm离心IOmin,弃去培养液，用基础培养液洗2次后将细胞重悬，记数后备用。
细胞融合先将免疫脾细胞1000r/min离心5min去掉上清，于37°C放置备用。将IX IO7个 SP2/0与IO8个免疫脾细胞于50mL离心管中混匀，离心lOmin。倒空上清，用灭菌的滤纸吸干管壁，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动。将装有细胞混合物的离心管放于37°C水浴中。 然后在Imin内慢慢滴入预温至37°C的50%体积比PEG O. 8mL(Sigma)，边加边轻轻用吸管尖搅拌。继续搅拌lmin。然后慢慢加入37°C预温的基础液10mL。具体方法为第一分钟逐滴滴入lmL。第二分钟加lmL，第3_4分钟加3mL，第5分钟加其余的5mL，每次加时需缓慢加入，并不断轻轻地搅拌。最后加入30mL 1640液,也需慢慢加入。800r/min离心5min,去上清于37°C放置5min。用HAT培养基悬浮，同时也用HAT培养基悬浮饲养脾细胞与融合后的细胞混合，根据需要补加适量的HAT培养基，分种于96孔细胞培养板中，约250 μ L/孔。 一次融合可接种4块96孔板。于37°C 5% CO2培养箱中培养。融合后第二天开始观察，有无污染，于第5天补加I滴培养基，第8天吸去100 μ L培养基换HT培养基100 μ L。待融合细胞集落长至培养孔1/4，培养基略变黄时，进行抗体检测。阳性细胞的筛选和克隆阳性细胞用间接免疫荧光的方法初步筛选将BHK细胞培养于2块96孔细胞培养板中，快长成单层时，一块接种伪狂犬病毒鄂A株，另一块接种gE/gl基因缺失株伪狂犬病毒。36小时后，当出现病变时用丙酮固定。然后各加入待筛选的杂交瘤的培养上清，37°C温育I小时，用pH7.20.01mol/L的PBS洗三次，再加入I 200稀释的羊抗鼠IgG-FITC，37°C 避光反应30min，洗涤三次后，置荧光显微镜下观察。当接种鄂A株伪狂犬病毒的细胞孔有绿色荧光，而对应的接种gE/gl基因缺失株伪狂犬病毒的细胞孔没有荧光时，此细胞孔内细胞判为阳性细胞。选取生长旺盛，形态良好的阳性细胞用有限稀释法进行克隆。单抗鉴定将初步筛选的阳性细胞孔的上清收集起来，在包被好抗原的酶标板上加100 μ L 稀释好的对照阴、阳性猪血清，于37°C温育30min，洗涤三次后，再加上述阳性细胞孔的上清ΙΟΟμ L，37°C反应30min，洗涤三次，加稀释好的羊抗鼠IgG-HRP，再洗板三次，加入底物液显色，用HF酸终止反应之后，在630nm的波长下测值。当加入阳性血清孔的OD值明显低于加入阴性血清孔OD值时，此单抗既为具有阻断作用的单抗。单克隆抗体生产用常规培养液培养上述鉴定阳性杂交瘤细胞株。大量生产单克隆抗体，可采用小鼠体内诱生法。通过将上述得到的产生抗伪狂犬病毒抗体的杂交瘤细胞注入经不完全弗式佐剂处理的雌性小鼠出 8周龄)腹腔内，10天后收集腹水，离心除去固体成分，其上清液即含有抗PRV病毒gE蛋白的单克隆抗体。抗体的纯化采用辛酸-硫酸铵法,具体如下向一份预处理过的腹水中加入两份
0.06mol/L(pH = 5. 0)的乙酸缓冲液，用0. lmol/L的盐酸调pH值至4. 7。室温搅拌下在 30min内逐渐滴加入辛酸(每毫升稀释前的腹水加33 μ L)，4°C静置2小时，12000rpm离心 30min,弃沉淀。上清经滤纸过滤后调pH至7. 4。在4°C冰浴下缓慢加入pH为7. 4的饱和硫酸铵，使硫酸铵最终饱和度不超过45%，搅拌30min，静置2 4小时或4°C过夜。4°C下 12000r/min离心20min弃去上清。沉淀用0. O lmol/L的PBS (pH = 7. 4)重悬,用pH为8. O 的10mmol/L Tris-Hcl透析过夜。收集抗体后用分光光度计检测其浓度。
伪狂犬病毒单克隆抗体的辣根过氧化物酶标记称取5mg辣根过氧化物酶(HRP)溶于ImL双蒸水中，加500 μ L新配制的O. 06mol/L 的NaI04，4°C放置30min，勿超过此时间，此时溶液呈草绿色，加入O. 5mL乙二醇(O. 16mol/ L)室温避光反应30min。再加入5mg/mL的纯化抗体lmL，在O. 05M pH9. 5的碳酸盐缓冲液中4°C透析过夜。吸出后加5mg/mL新配的NaBH40. 2mL 4°C放置2小时，再加等体积的饱和硫酸铵溶液，4°C放置30min，7000r/min离心lOmin，弃上清，用生理盐水重悬，再在O. 15M pH7. 4的PBS中透析过夜。收集透析袋中标记的抗体进行工作浓度标定，然后分装(每个批次的酶标抗体都要进行工作浓度标定)。实施例4 一种检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫试剂盒的应用，其步骤是I)从试剂盒中取出酶标板(包被有病毒抗原的检测板)，用样品稀释液将待检血清做2倍稀释(60 μ L样品稀释液和60 μ L待检血清混合)，取100 μ L混合液加入酶标板中，同时阳性对照和阴性对照各加2孔，每孔ΙΟΟμ L。2)轻轻振匀孔中样品(勿溢出)，置37°C温育45分钟。3)弃去孔中的溶液，加入洗涤液，200 μ L/孔，静置3分钟倒掉，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干。4)每孔加酶标单抗100 μ L，置37°C温育20分钟后洗板5次，(方法同步骤3)。5)每孔加显色液A、显色液B各一滴(约50 μ L)，混匀，室温(18 25°C，以下相同)避光显色10分钟。每孔加终止液一滴(约50 μ L)，10分钟内用酶标仪测定每孔OD63tol 读值。应用中所使用效果实验的情况如下I特异性试验用猪伪狂犬病病毒ELISA抗体检测试剂盒检测猪伪狂犬病、猪瘟、猪口蹄疫(O 型)、猪乙型脑炎和猪繁殖与呼吸综合征等标准阳性血清和猪伪狂犬病阴性血清，除PRV标准阳性血清的的S/N值显著小于O. 35外，其余血清S/N值大于O. 4，符合阴性血清的判定标准，表明这种方法的特异性良好。表I特异性血清的检测
权利要求
1.一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒，其特征在于包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体是以猪伪狂犬病毒为免疫原得到的单克隆抗体、猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株；所述的试剂盒还包括酶标板、样品稀释液、阳性对照、阴性对照、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液；所述的酶标板是以猪伪狂犬病毒在包被酶标板时用O. lmol/L, pH9. 6的碳酸氢钠溶液作为包被缓冲液；所述的阳性对照为猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清；所述的阴性对照为未感染过猪伪狂犬病毒的健康猪阴性血清；所述的洗涤液为含有O. 05%体积比Tween-20的PBS缓冲液；所述的终止液为含O. 25%体积比氢氟酸溶液；所述的显色液A为含有50mg/mL过氧化氢脲的柠檬酸盐缓冲液，显色液B液为含有 O. 2mg/mL TMB pH5. O的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液；所述的样品稀释液液为含2. 5mg/mL的明胶的DMEM培养基。
2.根据权利要求I所述的一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒，其特征在于所述的单克隆抗体，其制备过程是采用杂交瘤细胞技术，用纯化的猪伪狂犬病毒鄂A 株免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞进行细胞融合，用HAT选择性培养基进行培养后，再用猪伪狂犬病毒鄂A株和伪狂犬病毒gE/ gl基因缺失株进行间接免疫荧光筛选，筛选的阳性细胞株经有限稀释法克隆，再用猪伪狂犬病毒感染的猪阳性对照血清和猪伪狂犬病毒基因缺失疫苗免疫的阴性对照血清进行阻断ELISA筛选，最终筛选出单克隆抗体，分泌此抗体的细胞株命名为2E6。
3.权利要求I所述的一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒在检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫中的应用，其步骤是O从试剂盒中取出酶标板，用样品稀释液将待检血清做2倍稀释60μ 样品稀释液和 60μ 待检血清混合，取IOOPL混合液加入酶标板中，同时阳性对照和阴性对照各加2孔，每孔 ΙΟΟμ ；2)轻轻振匀孔中样品，置37°C温育45分钟；3)弃去孔中的溶液，加入洗涤液，200μ /孔，静置3分钟倒掉，重复洗板5次，最后一次在吸水纸上拍干；4)每孔加酶标单抗lOOPL，置37°C温育20分钟后洗板5次；5)每孔加显色液A、显色液B各一滴，混匀，室温避光显色10分钟，每孔加终止液一滴， 10分钟内用酶标仪测定每孔OD63tlnm读值。
全文摘要
本发明公开了一种猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体的酶联免疫的试剂盒及应用，包括辣根过氧化物酶标记的猪伪狂犬病毒gE蛋白单克隆抗体、猪伪狂犬病毒为伪狂犬病毒鄂A株；还包括酶标板、样品稀释液、阴(阳)性对照、显色液、洗涤液、终止液；该试剂盒在检测猪伪狂犬病毒gE蛋白抗体中的应用，其步骤a、从试剂盒中取出酶标板，将稀释好的待检血清加入抗原包被板中，同时设阴、阳性对照孔；b、振匀孔中样品，甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗；c、每孔加酶标单抗，洗涤，加显色液，室温避光显色，加终止液，用酶标仪测定每孔OD630nm读值。该试剂盒特异性好，灵敏度高。检测时间短；结果判定采用S/N比值法，准确性高。
文档编号G01N33/531GK102608315SQ201210039359
公开日2012年7月25日 申请日期2012年2月21日 优先权日2012年2月21日
发明者但汉并, 刘学刚, 卢顺, 徐高原, 王艳伟, 董晓辉, 金梅林, 陈焕春 申请人:武汉科前动物生物制品有限责任公司