专利名称：：一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组病毒，尤其涉及一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用
背景技术：
：细菌人工染色体(bacteriaartificialchromosome,Bac)是高通量低拷贝的质粒载体，最大可以容纳300kb的DNA,并能稳定传代。Bac技术为疱疫病毒反向和正向遗传研究提供了新方法(ShizuyaH,BirrenB,KimUJ,etal.Cloningandstablemaintenanceof300-Kilobase-pairfragmentsofhumanDNAinEscherichiacoliusinganF-factor-basedvector[J].ProcNatlAcadSciUSA,1992,89(18):8794-8797.)。目前该技术在多种疱疫病毒相继成功应用，如I型单纯疱疫病毒(StavropouLosTA,StrathdeeCA.Anenhancedpackagingsystemforhelper-dependentherpessimplexvirusvectors[J],JVirol,1998，72:7137-7143.)、EBV(DelecluseHJ,HilsendegenT,PichD,etal.Propagationandrecoveryofintact,infectiousEpstein-Barrvirusfromprokaryotictohumancells[J].ProcNatlAcadSciUSA,1995:8245-8250.)、人巨细胞病毒(HCMV)(WagnerM,RuzsicsZ,KoszinowskiUH.Herpesvirusgeneticshascomeofage[J]·TrendsMicrobiol,2002,10(7):318-324.)、BHV-1ZJ株(张存，叶伟成，王一成，等.牛I型疱疹病毒感染性细菌人工染色体的构建和gN基因缺失病毒的细胞繁殖特性[J].科学通报，2009，54(24)3823-3829.)等。TK基因缺失的猪伪狂犬病毒(PRV)ZJ株Bac也于2010年成功克隆(尹文玲，叶伟成，张存，等.猪伪狂犬病毒浙江株感染性细菌人工染色体克隆的构建[J].病毒学报，2010，26(4):331-335.)。PRV属于疱疫病毒科α疱疫病毒亚科成员，大小约143kb,含有多个可缺失的非必需基因。PRV基因缺失疫苗的成功应用，使该病在世界范围内得到了有效控制。目前以PRV-Bac系统为载体表达其它病原主要保护性抗原基因已成为基因工程活载体疫苗研究的热点(OsterriederN,SchumacherD,TrappS.Establishmentanduseofinfectiousbacterialartificialchromosome(BAC)DNAclonesofanimalherpesviruses[J].BerlMunchTierarztlffochenschr,2003,116(9-10):373-380.)。迄今为止，以伪狂犬病毒为载体已成功表达了CSFVE2(潘兹书，张楚瑜，陈玉栋，等.表达猪瘟病毒E2基因和gfp报道基因的伪狂犬病病毒双基因转移载体的构建[J].武汉大学学报(理学版)，2002，48(4)466-470.),PPVVP2(吕建强，陈焕春，赵俊龙，等.表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病毒的构建及其生物学特征研究[J].病毒学报，2004，20(2)134-137.)、PCV2Cap(琚春梅，陈焕春，郗鑫，等.表达猪2型圆环病毒0RF2基因的重组伪狂犬病病毒的构建及鉴定[J].中国农业科学，2006，39(8):1716-1722.)和PRRSVGP5蛋白(方六荣，肖少波，江云波，等.表达猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP5的重组伪狂犬病毒TK-/gG-/GP5+的构建及其生物学特性初步探讨[J].病毒学报，2004，20(20):250-254.)。猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和PRV是猪的三种重要的传染病，经常存在混合感染，因此研制出这三种病毒的重组疫苗对生产实践具有重要的意义。
发明内容本发明提供了一种重组猪伪狂犬病毒，该病毒可以共表达猪细小病毒VP2基因和猪圆环病毒Cap基因，可以对猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)和PRV三种病毒产生免疫。一种重组猪伪狂犬病毒，该病毒含有由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因。Cap基因是PCV2的主要结构蛋白基因，编码病毒的衣壳蛋白，可自装配成病毒样粒子，是目前PCV2疫苗研究的主要候选基因。VP2蛋白是构成PPV病毒粒子的主要结构蛋白，在体外表达后，不仅具有良好的免疫原性，还可以自我装配成病毒样颗粒，形态大小、血凝性与全病毒的相似，将其接种动物后可以诱导产生强烈的免疫应答反应，可以抵抗PPV强毒的攻击，三个基因共表达蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。优选的，该病毒包含Pcmv-V2C_BGH-pA表达框；其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV;BGH-pA表示人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾。所述的外源基因替换了该病毒的gE基因。优选的，该病毒的TK基因部分缺失，，缺失位置为第387694个碱基，可以降低病毒毒性。所述的猪细小病毒VP2基因碱基序列如SEQIDNO.I所示。所述的口蹄疫病毒2A基因碱基序列如SEQIDNO.2所示。所述的猪圆环病毒Cap基因碱基序列如SEQIDNO.3所示。本发明还提供了一种重组猪伪狂犬病毒的构建方法，包括(I)将PHA2质粒插入到原始猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；(2)将rPRV基因组转化大肠杆菌DHlOB菌株，获得pPRV；其中pPRV为感染性细菌人工染色体，包含PRV的全基因组，记为质粒pPRV，一般情况下，r起始表示重组病毒，P起始表示质粒。(3)将pPRV的标记基因GFP的CMV启动子更换为EFl启动子，获得pPRV_EFl；(4)将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EFl的gE基因，获得pPRV_V2C_ΔgE；其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV;BGH-pA人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾；(5)pPRV-V2C-ΛgE与pCAGGS_NLS/Cre两种质粒共转染Vero细胞系，筛选获得删除pHA2质粒的rPRV-V2C-ΔgE。本发明还提供了所述的重组猪伪狂犬病毒在制备动物疫苗中的应用。本发明通过缺失gE基因及TK基因部分序列对伪狂犬病病毒起到了减毒的作用，能通过检测gE或者TK蛋白抗体区分免疫动物和自然感染动物(鉴别诊断)，能同时免疫保护猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒等引起的三种疾病。图I为pPRV-V2C-ΔgE、pPRV-V2C_Kan-ΔgE、pPRV-ΔgE、pPRV-EFl，pPRV质粒限制性核酸酶切电泳图MarkerDL15000；IKbladder；AIpPRV-V2C-Kan-AgE；2pPRV-ΔgE；3pPRV-EFl；4,5pPRV-V2C-ΛgE为BamHI单酶切结果；BIpPRV-V2C-AgE；2pPRV-AgE；3:pPRV_EFl；4pPRV为BamHI单酶切结果；C重组PRV-BacPCR鉴定Marker250bp;I:以pPRV_V2C_ΔgE为模板PCR扩增获得4135bp的片段；2:以pPRV-AgE为模板PCR扩增获得617bp的片段；3:以pPRV-EFl为模板PCR扩增获得2351bp的片段(以上所用引物均为PRV-dgE-seq-s和PRV-dgE-seq-as)；图2为PRV重组病毒噬斑图谱；a.rPRV-Bac-EFl病毒嗤斑；b.rPRV-Bac-EFl病毒突光嗤斑；c.rPRV-Bac病毒噬斑；d.rPRV-Bac病毒荧光噬斑；e.rPRV-ΛgE病毒噬斑；f.rPRV-ΛgE病毒荧光噬斑；g.rPRV-V2C-ΔgE病毒噬斑；h.rPRV_V2C_ΔgE病毒荧光噬斑；图3为四种不同重组PRV病毒在BHK-21细胞上的噬斑面积柱状图；图4为图4rPRV-V2C-ΔgE、rPRV-ΔgE、rPRV-Bac、rPRV-Bac-EFl在BHK-21细胞上的生长曲线,其中(a)细胞外；(b)细胞内；图5为PRV-Bac-EFl浙江株表达PPVVP2蛋白(a)和PCV2Cap蛋白(b)westernblotting分析图；M.Proteinmarker；a1,2.rPRV_V2C_ΔgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液；3.rPRV-ΔgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液；bLrPRV-AgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液；2.rPRV-V2C_AgE病毒感染的BHK-21细胞裂解液。具体实施例方式I、引物设计与合成PPV、PCV2和PRV引物分别参考序列GeneBank(NC_014665.I)、GenBank(HQ591381.I)和GenBank(NC_006151)设计，由生工公司合成，序列见上表。引物a、b用于构建pPRV-V2C-AgE突变体，斜体序列与PRVgE上下游序列同源，下划线序列与pEP-CMV-in的Pcmv启动子上游和BGH-pA下游同源；引物c、d用于缺失PRVgE基因(US8)，上游引物下划线部分与pEPKanS质粒模板结合的序列；粗体序列与PRVUS8CDS起始密码子上游同源，斜体序列与US8下游同源，下游引物粗体序列与PRVUS8CDS下游同源，斜体序列和US8起始密码子上游同源，下划线部分为与PEPKanS质粒模板结合的序列；引物e、f用于pPRV-BacZJ株的Pcmv启动子更换,下划线部分与pEP_EFl质粒序列同源，斜体序列和PRVUL27序列上下游同源；引物g、h用于Bac突变体测序验证，弓丨物分别与PRVUS8上游-159bp和下游458bp序列同源，其PCR扩增产物可以根据大小、测序来验证US8的缺失、插入，产物大小如下2351bp(pPRV-Bac-EFl)，617bp(pPRV-AgE)，4135bp(pPRV-V2C-ΔgE)。表I权利要求1.一种重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒含有由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因。2.根据权利要求I所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒包含Pcmv-V2C-BGH-pA表达框；其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV;BGH-pA表示人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾。3.根据权利要求I或2所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒的gE基因被所述外源基因替换。4.根据权利要求I或2所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，该病毒的TK基因部分缺失。5.根据权利要求I所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述的猪细小病毒VP2基因碱基序列如SEQIDNO.I所示。6.根据权利要求I所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述的口蹄疫病毒2A基因碱基序列如SEQIDNO.2所示。7.根据权利要求I所述的重组猪伪狂犬病毒，其特征在于，所述的猪圆环病毒Cap基因碱基序列如SEQIDNO.3所示。8.—种重组猪伪狂犬病毒的构建方法，包括(1)将pHA2质粒插入到原始猪伪狂犬病毒的TK基因内，获得rPRV；(2)将rPRV基因组转化大肠杆菌(E.coli)DHlOB菌株，获得pPRV；(3)将pPRV的标记基因GFP的CMV启动子更换为EFl启动子，获得pPRV_EFl；(4)将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EFl的gE基因，获得pPRV_V2C_ΔgE；其中V2C表示由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因；Pcmv表示启动子CMV;BGH-pA人β球蛋白基因多聚腺苷酸尾；(5)pPRV-V2C-AgE与pCAGGS_NLS/Cre两种质粒共转染Vero细胞系，筛选获得删除pHA2质粒的rPRV-V2C-ΔgE。9.根据权利要求I7任一所述的重组猪伪狂犬病毒在制备动物疫苗中的应用。全文摘要本发明公开了一种重组猪伪狂犬病毒及其构建方法和应用，该病毒含有由猪细小病毒VP2基因、口蹄疫病毒2A基因和猪圆环病毒Cap基因依次连接构成的外源基因。该方法包括(1)构建包含PRV全基因组的细菌人工染色体pPRV；(2)将pPRV中的CMV启动子替换为EF1启动子；(3)将Pcmv-V2C-BGH-pA表达框替换pPRV-EF1的gE基因，获得pPRV-V2C-ΔgE；(4)pPRV-V2C-ΔgE与pCAGGS-NLS/Cre两种质粒共转染Vero细胞系，筛选获得删除pHA2质粒的rPRV-V2C-ΔgE。本发明重组病毒同时能免疫猪细小病毒、猪圆环病毒、伪狂犬病毒等引起的三种疾病。文档编号C12N15/63GK102618508SQ20121010078公开日2012年8月1日申请日期2012年4月9日优先权日2012年4月9日发明者云涛,余斌,倪征,华炯钢,叶伟成,崔尚金,张存,张燕,陈柳申请人:浙江省农业科学院