专利名称：一种安全快速从血液中提取基因组dna的方法
技术领域：
本发明公开一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，涉及血液总DNA制备技术， 属于动物分子生物学技术研究领域。
背景技术：
基因组DNA (genomic DNA)是遗传信息的载体，是最重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，是进行基因操作的主要物质基础，在基因组学研究中占有重要地位。脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA) 一类带有遗传信息的生物大分子，由4种主要的脱氧核苷酸(dAMP、dGMP、dCMT和dTMP)通过3'，5'-磷酸二酯键连接而成。它们的组成和排列不同，显示不同的生物功能，如编码功能、复制和转录的调控功能等。为了进行测序、杂交和基因的表达，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提。DNA的提取是分子生物学研究中的基本技术，DNA样品的质量对实验的成败至关重要。经典方法中，从样品溶液中去除蛋白质采用酚/仿抽提，其标准程序是酚抽提一次， 酚/仿抽提一次，氯仿抽提一次，有些情况下还要重复几次，这样就大大增加了工作量。同时，酚具有高度腐蚀性，易引起严重的烧伤；氯仿则作用于中枢神经系统，具有麻醉作用，对心、肝、肾有损害，吸入或经皮肤吸收引起急性中毒。所以，传统的操作方法对操作人员的身体伤害非常大。目前，虽然有相关的试剂盒，但是其中大部分均含有对身体不利的有毒有害物质。
发明内容
本发明提供一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，克服了现在常用的方法中有害溶剂对人体危害的影响，具有提取的基因组DNA质量良好、且省时省力、降低成本等特本发明公开的安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，采用以下技术方案 利用Triton X-100和SDS裂解血细胞，而无需蛋白酶K的处理，缩短了消化的时间、节
约了实验的成本；利用饱和NaCl沉淀蛋白质，通过离心使蛋白质分离出去，这就避免了有机溶剂对人体的危害和对环境造成污染。具体步骤如下
(1)取200-300份抗凝血和400-500份低盐缓冲液加入I.5 ml离心管中，充分混匀， 室温下I 000-1500 RPM离心8-12 min，弃上清；
(2)加入400-500份低盐缓冲液，充分混匀，室温下I000-1500 RPM离心3-8 min, M 复上一步骤；
(3)小心吸出上清，加入300份细胞裂解液，移液器吹打混匀，60-70°C水浴8-12min ；
(4)加入70-80份饱和NaCl，充分混匀，室温下10000-12000 RPM离心3-8 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
(5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000-12000 RPM离心2_5 min,弃上清；
(6)加入400-600份冰浴的70%-80%乙醇，颠倒混匀数次，10000—12000 RPM离心1-5min,弃上清；
(7)烘箱中 60-70 °C 干燥 5-15 min，加入 80-150 μ I ddH20，60-70 °C 水浴 10-20 min, -20°C保存。上述的试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 6-7. 8):12-13份Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份为水。(2)细胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液。
本发明的提取方法平均基因组DNA得率介于Rapid Method法和试剂盒法之间，基因组 DNA得率较理想，能较好地满足研究的需要。DNA纯度通常用A260/A280比值来检测，本发明的提取方法测得的A260/A280比值为I. 35 I. 68，平均为I. 46 ;而Rapid Method法和试剂盒法的平均A260/A280比值分别为1.37、1.56。分子克隆中报道，没有酚的核酸样品其 A260/A280比值应为I. 2左右。本发明的积极效果在于减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；防止和抑制DNase 对DNA的降解；排除有机溶剂、金属离子及其他核酸分子的污染；使蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；提取的DNA具有一定的长度；纯化后存在对酶有抑制作用的物质。是一种绿色、快速、操作简单的从动物血液中提取基因组DNA的方法。克服了现在常用的方法中有害溶剂对人体危害的影响，避免了以往从血液中提取 DNA过程中，使用酚、仿、异丙醇等对身体有害的有机溶剂，同时也避免了使用蛋白酶K等昂贵的试剂，整个过程不到I小时，非常快速，且DNA质量良好。所以本发明从科研人员的人身健康出发，并保证提取的基因组DNA质量良好、且省时省力、降低成本。
图I基因组DNA的电泳分析；
M λ DNA /EcoR I +Hind TTT Marker ； 1-4 :本发明的提取方法；5 Rapid Method 法；6 试剂盒法；
图2基因组DNA的PCR产物电泳分析；
M DNA Marker ;1_4:本发明的提取方法5 Rapid Method法；6 :试剂盒法；0 :阴性对昭.
图3基因组DNA的酶切产物电泳分析；
M λ DNA /EcoR I +HindIII Marker ; 1-3:基因组 DNA ;E: EcoR I ；B: BamH I。
具体实施例方式下面结合具体实施实例，进一步阐述本发明
实施例I:
试剂的配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 6)800ml蒸馏水溶解I. 21gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 38g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0· 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸钠)，Iml Triton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。操作步骤
1)取梅花鹿的200μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀，室温下I 000 RPM离心10 min，弃上清；
2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min,弃上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心I min，弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。实施例2 试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 6)800ml蒸馏水溶解I. 21gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 38g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0· 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入Ig SDS(十二烷基硫酸钠)，Iml Triton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。操作步骤
1)取马鹿的200μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀， 室温下I 000 RPM离心10 min，弃上清；
2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min,弃上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心I min，弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。实施例3 试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 7) 800ml蒸馏水溶解I. 27gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 5g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0· 78g MgCl2、0. 46gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入O. 8克SDS (十二烷基硫酸钠)，O. 8ml Triton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。
操作步骤
1)取(驯鹿、坡鹿、水鹿、麋鹿、點鹿、白唇鹿)各200μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀，室温下I 000 RPM离心10 min，弃上清；
2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min,弃上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心I min，弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min，既得，_20°C保存。实施例4 试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7.6)800ml蒸馏水溶解I. 3克Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 3g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0· 74g MgCl2、0. 46gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入I. 2g SDS (十二烷基硫酸钠)，I. 2ml Triton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。操作步骤
1)取猪的200μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀，室温下I 000 RPM离心10 min,弃上清；
2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min,弃上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心I min，弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。实施例5 试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 8)800ml蒸馏水溶解I. 22gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 29g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0· 74g MgCl2、0. 49gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入I. Ig SDS (十二烷基硫酸钠)，I. ImlTriton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。操作步骤
I)取牛的200 μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀，室温下I 000 RPM离心10 min,弃上清；2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min,弃上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心I min，弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。实施例6 试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 8)800ml蒸馏水溶解I. 29gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 29g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0· 74g MgCl2、0. 5gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入I. Ig SDS (十二烷基硫酸钠)，I. ImlTriton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。操作步骤
1)取羊的200μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀，室温下I 000 RPM离心10 min,弃上清；
2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000 RPM离心2 min,弃上
清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10 000 RPM离心I min，弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。实施例7 试剂配制
(I)低盐缓冲液(pH 7. 8) 800ml蒸馏水溶解I. 19gTris碱(三羟甲基氨基甲烷)、3. 4g Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、0. 76g MgCl2、0. 47gNaCl。加浓盐酸调pH至所需值，加蒸馏水定容至1L。(2)细胞裂解液200ml低盐缓冲液中加入O. 9gSDS (十二烷基硫酸钠)，O. 9mlTriton X-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)。操作步骤
1)取鸡的200μ I抗凝血和400 μ I低盐缓冲液加入I. 5 ml离心管中，充分混匀，室温下I 000 RPM离心10 min,弃上清；
2)加入500μ I低盐缓冲液，充分混匀，室温下I 000 RPM离心5 min，重复上一步骤；
3)小心吸出上清，加入300μ I细胞裂解液，移液器吹打混匀，65°C水浴10 min ；
4)加入75μ I饱和NaCl，充分混匀，室温下12 000 RPM离心5 min，将上清转移到新的I. 5 ml离心管中；
5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000RPM离心2 min，弃上清；
6)加入500μ I冰浴的70%乙醇，颠倒混匀数次，10000 RPM离心I min,弃上清；
7)烘箱中65°C干燥5min，加入100 μ I ddH20，65°C水浴15 min,既得，-20°C保存。试验例I :
基因组DNA的质量评估。(I)琼脂糖凝胶电泳
为了评估基因组DNA的完整性，分别取梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、 猪、牛、羊、鸡的DNA样品3 ul，0. 7%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统中观察电泳结果并拍照保存。见图I。(2)分光光度法
为了评估基因组DNA的浓度和纯度，分别取梅花鹿、马鹿、驯鹿、水鹿、白唇鹿、麋鹿、點鹿、猪、牛、羊、鸡的DNA样品各10 ul于190 ul ddH20中，充分混匀，分光光度计分别测定其A260和A280的吸光值，计算得到DNA样品的浓度和纯度。DNA纯度通常用A260/A280比值来检测，本发明的提取方法测得的A260/A280比值为I. 35 I. 68，平均为I. 46 ;而Rapid Method法和试剂盒法的平均A260/A280比值分别为I. 37、I. 56。分子克隆中报道，没有酚的核酸样品其A260/A280比值应为I. 2左右。这说明本发明的提取方法提取的DNA纯度较好。结果如下表
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(3)PCR扩增
为了验证本发明的提取方法提取所得基因组DNA是否影响PCR扩增，对本发明的提取方法提取的基因组DNA进行PCR扩增，以梅花鹿基因组为例说明，得到的PCR产物如图2所
/Jn οPCR 试剂的工作浓度Taq 酶 5U/ul，10PCR buffer 包含 500 mM KCl 和 15 mM MgC12，dNTPs 100 μ M，牛特异性引物20 μ M。PCR扩增反应在PCR System 9700上进行， 15 ul 体系ddH20 9.3ul、10 X Buffer I. 5ul、dNTPs 2. Oul、引物 I 和引物 2 各 0.5ul、7^ 酶 0.2ul、DNA 模板 I. Oul。
PCR 反应条件94°C 5min ；94°C 30s,60°C 30s, 72°C 30s, 30 cycles ；72°C 5min。反应结束后取5 ul PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果。从图2中可知，所有的DNA样品均扩出了 124 bp左右的tRNA_Val_16S rRNA目的片段，而阴性对照没有扩出目的片段。可见，本发明的提取方法提取所得基因组DNA具有较好的质量，无抑制Taq酶活性的物质,适用于PCR扩增反应。与Rapid Method法相比，以本发明的提取方法提取所得基因组DNA作为模板进行PCR扩增，所得的PCR产物量更多。(4)基因组DNA的酶切反应
为了验证本发明的提取方法提取所得基因组DNA是否影响酶切反应，以梅花鹿基因组为例，使用EcoR I和BamH I限制性酶对基因组DNA进行酶切(图3)。反应体系为1ul EcoR I 或BamH I，2 ul IOK buffer(200 mM Tris-HCl ρΗ8· 5， 100 mM MgCl2,10 mM DTT，I 000 mM KCl),6 ul 基因组 DNA，补加 ddH20 至终体积为 10 ul。 混匀后37 1水浴反应3 h，反应结束后取5 ul酶切产物在O. 7%琼脂糖凝胶中进行电泳检测，凝胶成像系统中记录实验结果。从图中可知，提取的基因组DNA经过EcoR I和BamH I酶切后，电泳图中仅有非常弱的弥散条带，说明本发明提取的基因组DNA是限制性酶的良好底物，可以成功地进行酶切。
权利要求
1.一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，包括以下步骤(1)取200-300份抗凝血和400-500份低盐缓冲液加入到离心管中充分混匀，室温下 1000-1500 RPM 离心 8-12 min，弃上清；(2)加入400-500份低盐缓冲液，充分混匀，室温下1000-1500RPM离心3_8 min，重复上一步骤；(3)吸出上清，加入300份细胞裂解液，移液器吹打混匀，60-70°C水浴8-12min ；(4)加入70-80份饱和NaCl，充分混匀，室温下10000-12000RPM离心3-8 min，将上清转移到离心管中；(5)加入2倍体积室温下的无水乙醇，充分混匀，室温下10000-12000RPM离心2_5 min,弃上清；(6)加入400-600份冰浴的70%-80%乙醇，颠倒混匀数次，10000-12000RPM离心1-5 min,弃上清；(7)烘箱中60-70 °C 干燥 5-15 min,加入 80-150 μ I ddH20,60-70 °C 水浴 10-20 min, -20 °C保存。
2.根据权利要求I所述安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，其特征在于所述的试剂配制(1)低盐缓冲液(pH7. 6-7. 8):12-13份Tris碱(三羟甲基氨基甲烷)，32-35份Na2EDTA (乙二胺四乙酸二钠)，7-8份MgCl2,4-5份NaCl，余份为水；(2)细胞裂解液4-6份SDS十二烷基硫酸钠，4-6份TritonX-100 (聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液。
全文摘要
本发明公开一种安全快速从血液中提取基因组DNA的方法，利用TritonX-100和SDS裂解血细胞，利用饱和NaCl沉淀蛋白质，通过离心使蛋白质分离出去，减少对溶液中DNA的机械剪切破坏；防止和抑制DNase对DNA的降解；排除有机溶剂、金属离子及其他核酸分子的污染；使蛋白质、多糖、脂类等降低到最低程度；提取的DNA具有一定的长度；纯化后存在对酶有抑制作用的物质。是一种绿色、快速、操作简单的从动物血液中提取基因组DNA的方法。
文档编号C12N15/10GK102604935SQ201210100069
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月9日 优先权日2012年4月9日
发明者吴琼, 杨福合, 査代明, 苏伟林, 荣敏, 邢秀梅 申请人:邢秀梅