专利名称：通过失活糖多孢红霉菌sace_3446基因提高红霉素产量的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体是通过失活或缺失糖多孢红霉菌染色体上红霉素生物合成负向调控基因SACE_3446，构建基因工程菌株，提高发酵生产红霉素产量。
背景技术：
放线菌次级代谢产物具有广泛的用途，如抗生素、抗癌剂、免疫调节剂、驱虫剂、昆虫防治剂[1，2]。目前发现的23000种生物活性次级代谢产物中，有10000多种是放线菌产生的。然而，这些次级代谢物原始产量非常低，需要通过筛选才能获得エ业生产高产菌株。过去エ业菌株主要通过随机物理或化学诱变方法获得[3，4]。传统的随机诱变技术不但耗时，而且无法对育种进行理性设计[3]。本发明目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株。 糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，其次级代谢产物红霉素A是重要的广谱大环内酯类抗生素，目前红霉素系列化学衍生物(克拉霉素、阿奇霉素、罗红霉素、泰利霉素等)被广泛用来治疗感染性疾病[5]。由于红霉素及其衍生物毎年的世界销售量达数百亿美元，吸引了许多科学家来研究如何提高其产量[6]。2007年，Oliynyk等[7]报道了糖多孢红霉菌NRRL23338的基因组序列，但糖多孢红霉菌调控基因研究很少，到目前为止只有W必(SACE_2077) [6]和SACE_7040[8]的调控基因研究报道。原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、AsnC、MarR> NtrC (EBP)、OmpR> DeoR、Cold shock、GntR 和 Crp 等 16 个家族，其中TetR家族成员在DNA结合域方面具有螺旋-转角-螺旋(HTH)的结构特征[9]。TetR家族在细菌中普遍存在，大约有2000多个成员，但到目前为止人们只发现100多个成员的特征。糖多孢红霉菌染色体上有101个TetR家族基因[7]。
发明内容
本发明通过研究糖多孢红霉菌A226 TetR家族基因，筛选与红霉素生物合成相关调控因子，发现敲除或失活糖多孢红霉菌A226染色体上SACE_3446基因，红霉素产量明显提闻。本发明技术方案如下
通过失活糖多孢红霉菌SACE_3446基因，提高红霉素产量的技术方法，其特征在于使得糖多孢红霉菌A226染色体上的SACE_3446基因失活或缺失，获得糖多孢红霉菌红霉素高产突变菌株，用于发酵生产红霉素。糖多孢红霉菌产红霉素负向调控基因缺失突变体，SACE_3446基因是糖多孢红霉菌产红霉素的负向调控基因，糖多孢红霉菌A226染色体上的SACE_3446基因失活或缺失。通过失活糖多孢红霉菌SACE_3446基因提高红霉素产量的方法，使得糖多孢红霉菌A226染色体上的SACE_3446基因失活或缺失获得糖多孢红霉菌产红霉素负向调控基因缺失突变体，用于发酵生产红霉素。
许多微生物的天然产物(如抗生素和其它ー些生物活性物质)都是其次级代谢物。基于在天蓝色链霉菌(如SC01135、SC01712)和灰色链霉菌(如AtrA)中发现了具有重要调控作用的TetR家族转录调控子，本发明尝试着从糖多孢红霉菌中筛选參与红霉素生物合成的TetR家族转录调控子。本发明研究中筛选到了红霉素生物合成负调控子SACE_3446，通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌染色体上SACE_3446基因，能够获得红霉素高产菌株，为エ业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_3446基因时红霉素产量明显增加，表明SACE_3446是ー个參与红霉素生物合成的负调控子。当在糖多孢红霉菌」bldD突变体菌株(BldD是红霉素生物合成正调控子，BldD失活使红霉素产量较出发菌株明显降低)中敲除SACE_3446基因时，发现J bldD/Δ SACE_3446双突变体菌株红霉素产量恢复，这种变化说明SACE_3446的靶基因可能位于BldD靶基因的下游，但是具体的调控机制有待于进一歩的研究。这些结果表明SACE_3446是编码红霉素生物合成的负调控子，通过失活糖多孢红霉菌染色体上SACE_3446基因可以提高红霉素的产量。同时，红霉素生物合成基因调控是 一个网络，通过基因工程途径失活SACE_3446基因上下游的负向调控基因，或増加其上下游的正向调控基因拷贝，也可提高发酵红霉素产量。
图I染色体同源重组技术示意图。硫链丝菌肽抗性基因(tsr)替换了糖多孢红霉菌A226染色体上SACE_3446基因 图2 SACE_3446在糖多孢红霉菌染色体上的位置。參见NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/gene term=SACE_3446)
图3 J SACE— 3446突变体鉴定及糖多孢红霉菌红霉素产量分析
(A)3446突变体鉴定，M, 5000bp DNA Marker; I,糖多孢红霉菌A226基因组作为阴性对照；2，pUCTSRA3446作为阳性对照；3，J MCF_3446突变体。(B)糖多孢红霉菌各菌株在TSB培养基中30°C发酵7天产物抑菌试验
I, A226,出发菌株；2，Zl bldD, A226 中缺失；3，Λ SACE_3446，A226 中SACE_3446 基因缺失；4，Δ bldD/Δ SACE_3446, A226 中和 SACE_3446 基因双缺失；5，Zl bldD/Δ SACE_3446/pZMW,空质粒 pZMW 导入 Zl bldD/Δ SACE_3446; 6，Zl bldD/Δ SACE_3446/pZMW3446,质粒 pZMW3446 导)K Δ bldD/Δ SACE_3446; 7, Λ SACE_3446/pZMW,空质粒 pZMW 导入」SACE_3446; 8，」SACE_3446/pZMW3446，质粒 pZMW3446 导入Λ SACE_3446; 9，A226/pZMW3446, pZMW3446 导入 A226。图4 Zl SACE_3446/pZMW3446 和 Zl bldD/Δ SACE_3446 的鉴定·
⑷况必基因恢复的PCR鉴定M, 5000bp DNA Marker; I, 从新/况必基因组中扩增出的SACE_3446基因PCR产物；2，hk厶SACE—3446/PZMW3446基因组中扩增出的安普霉素抗性基因PCR产物；
(B)Δ bldD/Δ SACE_3446 双敲突变体的 PCR 鉴定· M, 5000bp DNA Marker;1，J 况必的基因组；2，PUCTSRA3446质粒作为阳性对照；3，A226基因组作为阴性对照；(1，3)条带的差异表明SACE_3446基因被硫链丝菌肽抗性基因替换。
具体实施例方式本发明实施方式不局限于糖多孢红霉菌A226菌株；本发明实施方式中使用但不局限于染色体片段同源重组方法获得糖多孢红霉菌SACE_3446基因失活或缺失。材料与方法
1.1菌株、质粒与生长条件
试验中使用到的菌株和质粒见表I。大肠杆菌在37° C的液体LB(Luria-Bertani)培养基[11]或在添加I. 25%琼脂的LB平板上培养。红霉素生产菌糖多孢红霉菌A226及其工程菌株在30° C胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基或在含有2. 2%琼脂的R3M[12]平板上
培养。 材料、DNA操作与测序
PEG3350、溶菌酶、TES、酪蛋氨基酸、硫链丝菌肽、安普霉素从Sigma公司购买。TSB、酵母提取物、蛋白胨购买于Oxoid公司。甘氨酸、琼脂粉、氯化钠和其它生物学试剂都购于试剂公司。大肠杆菌和糖多孢红霉菌的一般操作技术按照标准操作[11，15]。引物的合成和DNA测序由上海捷瑞生物工程有限公司完成。表I试验中使用到的菌株和质粒
权利要求
1.通过失活糖多孢红霉菌SACE_3446基因、提高红霉素产量的技术方法，其特征在于通过基因工程途径使糖多孢红霉菌iSaccharopolyspora erythraea)染色体上的SACE_3446基因失活或缺失，获得糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株，用于发酵生产红霉素。
2.通过与SACE_3446基因相关基因改变、提高红霉素产量的技术方法，其特征在于以糖多孢红霉菌SACE_3446基因或其表达产物为出发点，寻找到与红霉素生物合成相关的新基因或蛋白，通过对寻找到的所有基因进行突变、增加拷贝等办法构建糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于糖多孢红霉菌是糖多孢红霉菌A226。
全文摘要
本发明公开了一种通过失活糖多孢红霉菌染色体上负向调控基因SACE_3446提高红霉素产量的方法。糖多孢红霉菌是红霉素产生菌，红霉素及其衍生药物克拉霉素、阿奇霉素、泰利霉素等在临床上广泛应用，工业生产中筛选红霉素高产菌株尤为重要。本发明从糖多孢红霉菌TetR家族中筛选到红霉素生物合成负向调控基因SACE_3446。糖多孢红霉菌SACE_3446基因缺失突变体比出发菌株的红霉素产量明显提高，SACE_3446基因互补后又回复红霉素到低产量，说明SACE_3446基因是红霉素生物合成的负向调控基因。通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌SACE_3446基因可以提高红霉素产量。因红霉素生物合成基因调控是一个网络系统，以SACE_3446为对象可以寻找到SACE_3446调控因子作用的上游和下游调控因子，通过改变糖多孢红霉菌SACE_3446调控因子的上游或下游调控因子基因，同样也可用于提高红霉素产量。
文档编号C12R1/645GK102816814SQ201210099708
公开日2012年12月12日 申请日期2012年4月7日 优先权日2012年4月7日
发明者张部昌, 朱林, 黄训端 申请人:安徽大学