葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途的制作方法

专利名称：葡萄糖诱导性失活及降解抗性转运蛋白基因及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白基因及其用途，特别涉及对低 聚糖(麦芽糖、麦芽三糖等)分解性优异的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类、其制造方法等。
背景技术：
在制造啤酒、发泡酒、威士忌等麦芽发酵饮料时，将麦芽等进行糖化后的麦汁中所 含有的糖主要为葡萄糖、麦芽糖和麦芽三糖这3种。这些来自麦芽的糖的比率，根据糖化方 法可具有若干变化，但在不添加酶剂、不添加糖化淀粉的情况下，则无大的改变，可以说大 约是1 5 1的比例。其中，葡萄糖是单糖，是最适合于酵母的糖，首先被分解。酵母中有多种基因在葡萄糖存在下转录过程受到抑制，将这种抑制控制称为葡萄 糖阻遏。将麦芽糖、麦芽三糖转运到酵母中所必需的多种转运蛋白均受到此种抑制。并且 已知这些受到葡萄糖阻遏的基因的产物，即使在翻译后，也会在葡萄糖存在下失活。已知 α-葡萄糖苷转运蛋白也属于这一类，在葡萄糖存在下被快速降解。因为麦芽糖、麦芽三糖 分解的第一步骤是通过该转运蛋白将其转运到酵母细胞内，所以如果转运蛋白被降解，则 这些分解也会停止，这就是将转运蛋白的表达称为分解的限速步骤的理由。非专利文献 1 Brondijk, Τ. H.，van der Rest, Μ. Ε.，Pluim, D.，deVries, Y. de.， Stingl, K. , Poolman, B., and Konings, W. N. (1998)J BiolChem 273 (25)，15352-15357非专利文献2 Medintz, I.，Wang, X.，Hradek, Τ.，and Michels, C. Α. (2000) Biochemistry 39 (15)，4518—4526非专利文献3 Gadura,N. ,and Michels,C. Α. (2006)Curr Genet 50 (2)，101-114

发明内容
发明要解决的课题在这种情况下，期望提供包含不易因葡萄糖而导致失活或降解的低聚糖转运蛋 白、且使麦芽糖等低聚糖的分解能力提高的酵母。解决课题的方法本发明者为了解决上述课题进行了刻苦研究，开发出了用于筛选不易因葡萄糖而 导致失活、降解的转运蛋白(以下称为“葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白”)或包含 其的酵母的新方法，并且根据该筛选方法，找到了葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白 或包含其的酵母，从而完成了本发明。即，本发明涉及编码葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白的基因、被该基因编 码的转运蛋白、该基因的表达受到调控的转化酵母、通过使用该基因的表达受到调控的酵 母来制造酒类的方法等。更加具体地说，本发明提供以下所示的多核苷酸、含有该多核苷酸 的载体、导入了该载体的转化酵母、使用该转化酵母的酒类的制造方法等。(1)多核苷酸，其编码由使序列号4、6、8或10的氨基酸序列发生突变后的突变序列组成、且具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白，其中，使序列号4、6或8的氨基酸序列的第39 52位的氨基酸序列(QGKKSDFDLSHLEY 或QGKKSDFDLSHHEY)、或者序列号10的氨基酸序列的第44 57位的氨基酸序列 (GKKDSAFELDHLEF)中发生1 5个氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突变。(2)如上述1所述的多核苷酸，其编码由使所述第39 52位的氨基酸序列或第 44 57位的氨基酸序列以外的序列部分进一步发生1 15个氨基酸的缺失、取代、插入及 /或添加的突变后的突变序列组成的转运蛋白。(3)如上述1或2所述的多核苷酸，其中，使序列号4、6或8的氨基酸序列的第 46 51位的氨基酸序列(DLSHLE或DLSHHE)、或者序列号的10的第51 56位的氨基酸 序列(ELDHLE)中发生1 5个氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突变。(4)多核苷酸，其包含由序列号 25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47 或 49 的 碱基序列组成的多核苷酸。(5)多核苷酸，其包含由序列号29、33、35、39、41、43或47的碱基序列组成的多核苷酸。(6)多核苷酸，其包含编码由序列号 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48 或 50的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。(7)多核苷酸，其包含编码由序列号30、34、36、40、42、44或48的氨基酸序列组成 的蛋白质的多核苷酸。(8)如上述1 7中任一项所述的多核苷酸，其为DNA。(9)蛋白质，其为由上述1 8中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。(10)载体，其中含有上述1 8中任一项所述的多核苷酸。(11)转化酵母，向其中导入了上述10所述的载体。(12)如上述10所述的酿造用酵母，其中，通过导入上述10所述的载体，提高了低 聚糖分解能力。(13)如上述12所述的酿造用酵母，其中，通过增加上述9所述的蛋白质的表达量， 提高了低聚糖分解能力。(14)酒类的制造方法，其中，使用上述11 13中任一项所述的酵母。(15)如上述14所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是麦芽饮料。(16)如上述14所述的酒类的制造方法，其中，酿造的酒类是葡萄酒。(17)酒类，其为利用上述14 16中任一项所述的方法制造的酒类。(18)获取包含具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白的酵母的方法，其 中，包括步骤(1)，将多个被测酵母在含有2-脱氧葡萄糖的低聚糖培养基上培养，将生长 繁殖水平作为指标，筛选包含不易因葡萄糖而导致失活或降解的转运蛋白的酵母；步骤(2)，通过比较步骤(1)中筛选的酵母中包含的转运蛋白的氨基酸序列和因 葡萄糖而导致失活或降解的水平已知的转运蛋白的氨基酸序列，鉴定有助于提高因葡萄糖 而导致的失活或降解的难度的氨基酸残基或氨基酸序列；步骤(3)，根据步骤(2)中获得的氨基酸序列信息，设计编码具有葡萄糖诱导性失 活/降解抗性的转运蛋白的多核苷酸；以及
步骤(4)，将步骤(3)中设计的多核苷酸导入酵母中，将该酵母在低聚糖培养基上 培养，测定该酵母中包含的转运蛋白的葡萄糖诱导性失活/降解抗性、该酵母的低聚糖分 解能力、增殖速度及/或在麦汁中的发酵速度。(18a)上述18所述的方法，其中，上述步骤(1)中多个被测酵母是自然界中存在的 酵母，或者是使从自然界中获得的发生突变的酵母。(18b)上述18所述的方法，其中，上述步骤(4)中的导入步骤(3)设计的多核苷 酸的酵母包含在Mal31p蛋白质的氨基酸序列中引入定点突变后的突变型Mal31p蛋白质、 在Maieip蛋白质的氨基酸序列中引入定点突变后的突变型Maieip蛋白质、在Mttlp蛋白 质的氨基酸序列中引入定点突变后的突变型Mttlp蛋白质、或者在Agtlp蛋白质的氨基酸 序列中引入定点突变后的突变型Agtlp蛋白质。发明的效果通过使用本发明涉及的酵母，本发明具有可加快含有麦芽糖、麦芽三糖等低聚糖 的酒醪的发酵速度的优点。本发明涉及的转运蛋白基因可导入任何酿造用酵母或实验室酵 母中。特别是在大量含有葡萄糖、果糖等单糖的发酵原液中含有本发明涉及的转运蛋白可 转运的低聚糖(麦芽糖、麦芽三糖、松二糖(Turanose)、海藻糖(trehalose)等)的情况下， 更加有效。


图1是表示实验室酵母株在2-脱氧葡萄糖存在下的生长繁殖的不同的图。图2是表示MAL21基因的碱基序列。图3是表示Mal2 Ip的氨基酸序列。图4是表示Mal21p、Mal31p及Mal61p在葡萄糖存在下的降解速度的图。图5是表示突变型Mal31p在葡萄糖存在下的降解速度的图。图 6 是表示 Mal21/Mal31/Mal61/Mttl/Agtl 的比对。图 7 是表示 Mal21/Mal31/Mal61/Mttl/Agtl 的比对(接续图 6)。图8是表示突变型Agtlp在葡萄糖存在下的降解速度的图。图9是表示具有突变型MAL61基因的菌株在2_脱氧葡萄糖存在下的生长繁殖的 不同的图(对降解速度产生大的影响的氨基酸残基的鉴定)。图10是表示突变型Maieip在葡萄糖存在下的降解速度的图(对降解速度产生大 的影响的氨基酸残基的鉴定)。图11是表示具有天然型MTTl和突变型MTTl基因的菌株在2-脱氧葡萄糖存在下 的生长繁殖的不同的图。图12是表示高表达MAL21基因的实验室株在麦芽糖培养基上的生长繁殖的图。图13是表示高表达MAL21基因的下面啤酒酵母株的发泡酒或者发泡酒(富含葡 萄糖)麦汁中麦芽糖发酵速度的图。图14是表示高表达不易因葡萄糖而导致降解的转运蛋白的上面啤酒酵母的麦汁 中麦芽糖发酵速度的图。图15是表示质粒pJHXSB的组成图。图16是表示质粒ρJHIXSB的组成图。
图17是表示质粒pYCGPY的组成图。图18是表示质粒pUP3GLP的组成图。图19是表示质粒pYCp49H的组成图。
具体实施例方式本发明者认为，如果能够控制翻译后的转运蛋白因葡萄糖而导致的失活或降解， 即使在葡萄糖存在下，麦芽糖及麦芽三糖也可被酵母更高效地分解。基于这种想法进行了 刻苦研究，结果从自然界中发现了不易被降解的α-葡萄糖苷转运蛋白Mal21p，并且证明 Mal21p的降解速度远远低于其他转运蛋白。此外，利用UV使转运蛋白基因发生突变，采用独特的方法成功筛选出了具有葡萄 糖诱导性失活或降解抗性的转运蛋白。更加具体地说，使容易因葡萄糖而导致失活或降解 的α “葡萄糖苷转运蛋白Mal31p和Agtlp发生突变，获取了多种不易被降解的转运蛋白。 并且从这些突变型转运蛋白的氨基酸序列及Mal21p的氨基酸序列中，鉴定出有助于提高 降解难度的氨基酸残基。其结果是，对于下面啤酒酵母具有的新型α-葡萄糖苷转运蛋白 Mttlp，根据其信息通过进行氨基酸取代，成功地将其改造为不易因葡萄糖而导致失活或降 解的转运蛋白。此外，通过高表达发现的或者新获取的不易因葡萄糖而导致失活或降解的 转运蛋白，确实成功地提高了在麦芽糖培养基中的增殖速度。且在啤酒酿造中可提高麦芽 糖的分解速度。根据这种设想和研究成果，本发明得以完成。本发明中获得的基因及其核苷酸序列，以及被这些基因编码的转运蛋白及其氨基 酸序列如下所示。序列号1 :MAL21的核苷酸序列序列号2 :Mal21p α -葡萄糖苷转运蛋白的氨基酸序列序列号3 :MAL31的核苷酸序列序列号4 :Mal31p α -葡萄糖苷转运蛋白的氨基酸序列序列号5 :MAL61的核苷酸序列序列号6:Mal61 α -葡萄糖苷转运蛋白的氨基酸序列序列号7 =MTTl的核苷酸序列序列号8 =Mttlp α -葡萄糖苷转运蛋白的氨基酸序列序列号9 =AGTl的核苷酸序列序列号10 =Agtlp α -葡萄糖苷转运蛋白的氨基酸序列序列号25 :MAL61[D46G]的核苷酸序列序列号26 :Mal61p[Gly46]的氨基酸序列序列号27 :MAL61[L50H]的核苷酸序列序列号28 :Mal61p[His50]的氨基酸序列序列号29 :MAL61 [D46G, L50H]的核苷酸序列序列号30 :Mal61p[Gly46, His50]的氨基酸序列序列号31 =AGTl [E56K]的核苷酸序列序列号32 =Agtlp[Lys56]的氨基酸序列序列号33 =AGTl [E56G]的核苷酸序列
序列号34 =Agtlp[Gly56]的氨基酸序列序列号35 =MTTl [D46G]的核苷酸序列序列号36 =Mttlp[Gly46]的氨基酸序列序列号37 :MAL31 [E51V]的核苷酸序列序列号38 :Mal31p[Val51]的氨基酸序列序列号39 :MAL31[S48P]的核苷酸序列序列号40 :Mal31p[Pro48]的氨基酸序列序列号41 :MAL31[H49P]的核苷酸序列序列号42 :Mal31p[Pro49]的氨基酸序列序列号43 :MAL31 [L50P]的核苷酸序列序列号44 :Mal31p[Pro50]的氨基酸序列序列号45 :MAL31 [E51K]的核苷酸序列序列号46 :Mal31p[Lys51]的氨基酸序列序列号47 :MAL31 [L50F, E51K]的核苷酸序列序列号48 :Mal31p[Phe50, Lys5I]的氨基酸序列序列号49 :MAL31 [H49R]的核苷酸序列序列号50 :Mal31p[Arg49]的氨基酸序列本说明书中使用的“ α _葡萄糖苷转运蛋白”是指与α _葡萄糖苷的跨膜转运相关 的蛋白质，这种α-葡萄糖苷转运蛋白包括麦芽糖转运蛋白、麦芽三糖转运蛋白等。1.本发明的多核苷酸首先，本发明提供的多核苷酸是编码由使序列号4、6、8或10的氨基酸序列发 生突变后的突变序列组成、且具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白的多核苷酸， 其中，使序列号4、6或8的氨基酸序列的第39 52位的氨基酸序列(QGKKSDFDLSHLEY 或QGKKSDFDLSHHEY)、或者序列号10的氨基酸序列的第44 57位的氨基酸序列 (GKKDSAFELDHLEF)中发生1 5个(优选1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸的 缺失、取代、插入及/或添加的突变的多核苷酸(具体为DNA，以下有时也简称为“DNA”)。 本发明还包括由使上述氨基酸序列的第39 52位或第44 57位的氨基酸序列的氨基 酸序列以外的序列部分，进一步发生1 15个(优选1 14个、1 13个、1 12个、1 11个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、1 5个、1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突变后的突变序列组成的上述转运蛋 白。进一步，本发明的优选蛋白质，包括使上述序列号4、6或8的氨基酸序列的第 46 51位的氨基酸序列(DLSHLE或DLSHHE)、或者序列号10的第51 56位的氨基酸序 列(ELDHLE)中发生1 5个(优选1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸的缺失、 取代、插入及/或添加的突变的上述转运蛋白。本发明的优选转运蛋白，包括由序列号26、 28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列组成的蛋白质，更优选包括由序 列号30、34、36、40、42、44或48的氨基酸序列组成的蛋白质。此外，作为本发明的转运蛋白，可例举，由在序列号26、28、30、32、34、36、38、40、 42、44、46、48或50的氨基酸序列中，缺失、取代、插入及/或添加例如1 15个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个(1 数个)、1 5个、1 4个、1 3个、1 2个、 1个氨基酸残基后的氨基酸序列组成，并且具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白。 通常情况下，上述氨基酸残基的缺失、取代、插入及/或添加的数量越小越好。此外，作为这种蛋白质，可例举，具有与序列号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、 46,48或50的氨基酸序列具有约90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95% 以上、96%以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2 %以上、99. 3 %以上、 99. 4%以上、99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上、99. 8%以上、99. 9%以上的同一性的氨 基酸序列，并且具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白。通常情况下，上述同源性数 值越大越好。<葡萄糖诱导性失活/降解抗性的评价>在本发明中，葡萄糖诱导性失活/降解抗性，可按例如以下方法进行评价。首先， 确认表达各转运蛋白的菌株在含有0 2mM 2-脱氧葡萄糖的麦芽糖等的最小必需培养基 (无氨基酸酵母氮源(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids) 6. 7g/L、麦芽糖等 20g/L，但 对于营养缺陷型转化株，含有其营养素)、或者在含有0 8. OmM的2-脱氧葡萄糖的麦芽 糖完全合成培养基(SCM)(无氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麦芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、 尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L_组氨酸盐酸盐20mg/ml、L_精氨酸盐酸盐20mg/ml、 L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-异亮氨酸30mg/ml、L-赖氨 酸盐酸盐30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L_天冬氨酸100mg/ml、L_缬 氨酸150mg/ml、L-苏氨酸200mg/ml、L-丝氨酸400mg/ml)中的生长繁殖状况，即使产生葡 萄糖诱导性失活/降解信号的酵母，也要从中筛选其转运蛋白具有麦芽糖转运活性并发挥 作用的菌株。接着，将该菌株接种到YPD(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/ L)中，30°C振荡培养过夜。将培养液接种到YPM培养基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/ L、麦芽糖5g/L)中，使0D660 = 1.0，30°C振荡培养2.5小时，并收集菌。测取60个0D660 单位的细胞，使其悬浮于30ml预先在30°C保温的降解速度测定用培养基[无氨基酸酵母氮 源(不含氨)(Yeast Nitrogen Base w/o amino acids and ammonia) 1. 7g/L、葡萄糖 20g/ L、环己酰亚胺中，30°C进行温育。在适当的时间(0、10、20、30及40分钟或者0、
30、60、90及120分钟)抽取细胞悬浮液样品5ml，快速离心弃除上清液，将细胞用乙醇干冰 冷冻。根据常规方法检测冷冻细胞中的转运蛋白，测定蛋白条带的强度，由其减少速度计算 半衰期。在本发明中优选转运蛋白，例如与Mal31p比较，具有2倍以上、3倍以上、4倍以上、 5倍以上、6倍以上或8倍以上的半衰期。本发明还包括在严谨条件下与本发明的多核苷酸杂交，并且编码具有葡萄糖诱导 性失活/降解抗性的转运蛋白的多核苷酸，该本发明的多核苷酸为编码由使序列号4、6、 8或10的氨基酸序列发生突变后的突变序列组成、且具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的 转运蛋白的多核苷酸，其中，使序列号4、6或8的氨基酸序列的第39 52位的氨基酸序列 (QGKKSDFDLSHLEY或QGKKSDFDLSHHEY)、或者序列号10的氨基酸序列的第44 57位的氨 基酸序列(GKKDSAFELDHLEF)中发生1 5个(优选1 4个、1 3个、1 2个或1个) 氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突变的多核苷酸等。本发明的优选多核苷酸为上述特定的多核苷酸，具体为含有由序列号25、27、29、
31、33、35、37、39、41、43、45、47或49的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸，更优选多核苷酸为含有由序列号29、33、35、39、41、43或47的碱基序列组成的多核苷酸的多核苷酸。在 下述实施例中，已证明在Mal21p、突变Mal31p、突变Mal61p及突变Mttlp中序列号4、6或 8的第46 51位的氨基酸序列与葡萄糖诱导性失活/降解抗性相关，在Agtl中序列号10 的第51 56位的氨基酸序列与葡萄糖诱导性失活/降解抗性相关，因此，在进行突变时期 望考虑该序列信息。在此，“在严谨条件下进行杂交的多核苷酸(DNA) ”是指，以由序列号25、27、29、31、 33、35、37、39、41、43、45、47或49的碱基序列的互补碱基序列组成的DNA，或者编码序列号 26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列的DNA的全部或一部分作为探 针，通过使用菌落杂交法、噬菌斑杂交法或Southern杂交法等所得到的DNA。杂交方法，可 使用例如 Molecular Cloning 3rd Ed.、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons 1987-1997等中所记载的方法。本说明书中所述的“严谨条件”，可以为低严谨条件、中严谨条件及高严谨条件中 的任一种。“低严谨条件”，例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS、50%甲酰胺、32°C 的条件。此外，“中严谨条件”，例如为5XSSC、5XDenhardt溶液、0.5% SDS、50%甲酰胺、 42 °C的条件。“高严谨条件”，例如为5 X SSC、5 X Denhardt溶液、0. 5 % SDS、50 %甲酰胺、 50°C的条件。在上述条件中，温度越高，越可能高效获得具有高同源性的DNA。但是，影响杂 交严谨性的因素有温度、探针浓度、探针长度、离子强度、时间、盐浓度等多种因素，本领域 技术人员可通过适当选择这些因素实现同样的严谨性。此外，杂交中使用市售试剂盒时，可使用例如Alkphos Direct LabellingReagents (Amersham Pharmacia公司制)。此时，根据试剂盒中附带的说明方案， 与标记后的探针保温过夜后，在55°C的条件下用含有0. 1 % (w/v) SDS的1次洗涤缓冲液洗 涤膜后，可检出杂交后的DNA。除上述以外，作为可杂交的DNA，可例举，通过FASTA、BLAST等同源性搜索软件，使 用默认参数计算时，与编码序列号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基 酸序列的DNA具有约90%以上、91%以上、92%以上、93%以上、94%以上、95%以上、96% 以上、97%以上、98%以上、99%以上、99. 1 %以上、99. 2%以上、99. 3%以上、99. 4%以上、 99. 5%以上、99. 6%以上、99. 7%以上99. 8%以上、99. 9%以上同一性的DNA。此外，氨基酸序列、碱基序列的同一性，可根据Karlin及Altschul的BLAST算 法(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,872264-2268，1990 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA,90 :5873， 1993)测定。已开发出基于BLAST算法的被称为BLASTN、BLASTX的程序(Altschul SF, et al J. Mol. Biol. 215 :403，1990)。使用BLASTN分析碱基序列时，参数例如为分数(score) =100、字长(wordlength) = 12。此外，使用BLASTX分析氨基酸序列时，参数例如为分数 =50、字长=3。使用BLAST和Gapped BLAST程序时，使用各程序的默认参数。2.本发明的蛋白质本发明提供由上述多核苷酸中任一个所编码的蛋白质。本发明的优选蛋白质为 由序列号4、6、8或10的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 1 5个(优选1 14个、1 13个、1 12个、1 11个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、 1 5个、1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸后的氨基酸序列组成，且具有葡萄糖 诱导性失活/降解抗性的转运蛋白。
作为这种蛋白质，可例举，由序列号4、6、8或10的氨基酸序列中缺失、取代、插入 及/或添加上述数量的氨基酸残基后的氨基酸序列组成，且具有葡萄糖诱导性失活/降解 抗性的转运蛋白。作为这种转运蛋白，优选例举，由序列号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48或50的氨基酸序列组成的蛋白质，更优选例举由序列号30、34、36、40、42、44或48的 氨基酸序列组成的蛋白质。此外，作为这种蛋白质，可例举，具有与序列号26、28、30、32、 34、36、38、40、42、44、46、48或50的氨基酸序列有上述同源性的氨基酸序列，且具有葡萄 糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白。这种蛋白质，可使用《Molecular Cloning 3》、 《Current Protocols in Molecular Biology》、“Nuc. Acids. Res. ，10，6487(1982)”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982) ”、"Gene，34，315 (1985)，，、"Nuc. Acids. Res.，13， 4431(1985) ”、“Proc. Natl. Acad. Sci. USA，82，488 (1985) ” 等所述的定点突变引入法而获 得。本发明蛋白质的氨基酸序列中缺失、取代、插入及/或添加1 15个(优选为1 1 4个、1 13个、1 12个、1 11个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、 1 5个、1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸残基，是指在同一序列中的任意并且 1 15个氨基酸序列的位置上，缺失、取代、插入及/或添加1 15个(优选为1 14个、 1 13个、1 12个、1 11个、1 10个、1 9个、1 8个、1 7个、1 6个、1 5 个、1 4个、1 3个、1 2个或1个)氨基酸残基，缺失、取代、插入及添加中的2种以上 可同时发生。下面列举可互相取代的氨基酸残基。同一组中包含的氨基酸残基可互相取代。A 组亮氨酸、异亮氨酸、正亮氨酸、缬氨酸、正缬氨酸、丙氨酸、2-氨基丁酸、蛋氨酸、ο-甲基 丝氨酸、叔丁基甘氨酸、叔丁基丙氨酸、环己丙氨酸；B组天冬氨酸、谷氨酸、异天冬氨酸、 异谷氨酸、2-氨基己二酸、2-氨基辛二酸；C组天冬酰胺、谷氨酰胺；D组赖氨酸、精氨酸、 鸟氨酸、2，4- 二氨基丁酸、2，3- 二氨基丙酸；E组脯氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸； F组丝氨酸、苏氨酸、高丝氨酸；G组苯丙氨酸、酪氨酸。本发明的蛋白质，也可以通过Fmoc法(芴甲氧羰基法)、tBoc法(叔丁氧羰基 法)等化学合成法制备。此外，也可以利用Advanced Chem Tech公司、PerkinElmer公 司、Pharmacia 公司、Protein Technology Installment 公司、Synthecell-Vega 公司、 PerS印tive公司、岛津制作所等制造的肽合成仪进行化学合成。3.本发日月的jH本及导入该jH本的转仆Jg母本发明提供含有上述多核苷酸的载体。本发明的载体，含有上述任一项所述的多 核苷酸(DNA)。并且，本发明的载体，通常以包含表达盒的形式构成，该表达盒包含的结构要 素为(χ)在酵母细胞内可转录的启动子；(y)以正向或反向与该启动子连接的上述任一项 所述的多核苷酸(DNA)；以及(ζ)与RNA分子的转录终止及多聚腺苷化作用相关，在酵母内 发挥作用的信号。此外，要使上述本发明的蛋白质进行高表达，优选将本说明书中所述的多 核苷酸(DNA)相对于该启动子正向导入，以促进这些多核苷酸(DNA)的表达。作为向酵母中导入时使用的载体，可利用多拷贝型(YEp型)、单拷贝型(YCp型)、 染色体整合型(YIp型)中的任一种。例如，作为YEp型载体，已知有YEp24(J. R.Broach et al. , Experimental Manipulation of Gene Expression, Academic Press, New York,83,1983)；作为 YCp 型载体，已知有 YCp50(M. D.Rose et al.，gene，60，237，1987)；作为 YIp 型 载体，已知有 YIp5 (K. Struhl et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USP，76，1035，1979)，且容易获 得。此外，也可使用染色体整合型 pUP3GLP(0mura，F. et al. ,FEMS Microbiol. Lett. , 194, 207，2001)(图 18)、pJHIXSB (图 16)、pYCGPY (Kodama，Y. etal.，Appl. Environ. Microbiol.， 67，3455，2001)(图17), ρ JHXSB (图15)等单拷贝复制型质粒。用于调控酵母中基因表达的启动子/终止子，只要在酿造用酵母中发挥作用的同 时不受醪液中的糖、氨基酸等成分的浓度影响，可以任意组合。例如可利用甘油醛-3-磷酸 脱氢酶基因(TDH3)的启动子、3-磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)的启动子等。这些基因均已 被克隆，如在Μ. F. Tuite et al.，EMB0J. ,1,603(1982)中有详细记载，通过已知的方法可容 易地获得。在表达载体中使用的启动子，根据发酵醪液的糖组成、糖浓度、多种转运蛋白的 组合等，可有效地改变成具有适当转录活性的启动子。因酿造用酵母不能利用营养缺陷型标记，所以转化使用的选择性标记可利用遗 传霉素(Geneticin)抗性基因(G418r)、铜抗性基因(CUPl) (Marin etal.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 337 1984)、浅蓝菌素抗性基因(fas2m, PDR4)(猪腰淳嗣等，生物化学， 64,660,1992 ；Hussain et et al.，gene，101，149，1991)等。将上述构建的载体导入宿主 酵母内。宿主酵母，可例举可用于酿造的任何酵母，例如啤酒、葡萄酒、清酒等的酿造用酵 母等。具体地，可例举酵母属(Saccharomyces)等的酵母，在本发明中，可使用啤酒酵母 如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)W34/70 等；卡尔斯伯酵母(Saccharomyces carlsbergensis)NCYC453、NCYC456 等；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)NBRC195U NBRC1952、NBRC1953、NBRC1954等。并且还可使用威士忌酵母如酿酒酵母NCYC90等；葡萄 酒酵母如协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等葡萄酒酵母；清酒酵母如协会 酵母清酒用7号、清酒用9号等清酒酵母，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤 酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus)。制备本说明书中所述的各转运蛋白基因时使用的染色体DNA，并不限定于酿酒酵 母ATCC20598、ATCC96955等的菌株，只要是属于具有各基因的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的酵母，可以从任何酵母中制备。酵母的转化可利用通常使用的公知方法。例如可实施电穿孔法“Meth. Enzym.，194，pl82 (1990) ”、原生质球法(Spheroplast) "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978) ”、乙酸锂法"J. Bacteriology, 153，pl63 (1983) ”、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 pl929 (1978)、Methods in yeast genetics, 2000 Edition :A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual等记载的方法，但并不限于这些方法。此外，转化菌株，可以通过将宿主的营养缺陷型互补基因(例如URA3)整合到表达 质粒中，用不含尿嘧啶的琼脂培养基来筛选。或者可以通过将抗药性基因(例如环己酰亚 胺的抗药性基因YAPl或者遗传霉素(Geneticin)的抗性基因G418R)整合到表达质粒中， 用含有环己酰亚胺(例如0. 3 μ g/ml)或者遗传霉素(Geneticin)(例如300 μ g/ml)的琼 脂培养基来筛选。更具体地说，将宿主酵母在标准酵母营养培养基(如YEPD培养基 "GeneticEngineering. Vol. LPlenum Press, New York，117 (1979)，，等)中培养至 0D600nm 值为1 6。将该培养酵母离心分离并收集、洗涤，用浓度约为IM 2M的碱性离子金属离子(优选用锂离子)进行预处理。将上述细胞在约30°C下静置约60分钟后，与待导入的 DNA (约1 20 μ g)同时在约30°C下静置约60分钟。添加聚乙二醇，优选添加约4，000道 尔顿的聚乙二醇，使最终浓度约为20% 50%。在约30°C下静置约30分钟后，将上述细胞 在约42°C下加热处理约5分钟。优选用标准酵母营养培养基洗涤上述细胞悬浮液，并加入 到规定量的新鲜标准酵母营养培养基中，在约30°C下静置约60分钟。然后，将其转移到含 有作为选择性标记使用的抗生素等的标准琼脂培养基上，获得转化体。此外，对于常规克隆技术，可参照《Molecular Cloning 3K"Methods inYeast Genetics、A laboratory manual(Cold Spring Harbor LaboratoryPress> Cold Spring Harbor, NY) ”等。4. H日月白射酉力felU力诵i寸该力导白射酉-将上述本发明的载体导入适合酿造作为制造对象的酒类的酵母中，通过使用该酵 母，可制造具有特定氨基酸组成的酒类。可作为制造对象的酒类有啤酒、葡萄酒、威士忌、清 酒等，但并不限于这些。在制造上述酒类时，除使用本发明获得的酿造酵母代替亲株之外， 可利用公知的方法。因此，原料、制造设备、制造管理等可与以往的方法完全相同，不会因制 造发酵时间缩短的酒类而增加成本。也就是说，根据本发明能够使用已有的设备进行制造 而不增加成本。5.本发明酵母的获取方法获取包含本发明的具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白的酵母的方法， 包括以下步骤⑴ (4)。[步骤⑴]在步骤(1)中，首先将多数被测酵母在含有2-脱氧葡萄糖的麦芽糖培养基上培 养，将其生长繁殖水平作为指标，筛选包含不易因葡萄糖而导致失活的转运蛋白的酵母。作为被测酵母，可使用自然界存在的酵母，也可使用对从自然界获取的酵母实施 突变后的酵母。作为被测酵母，可例举，例如可用于酿造的任何酵母，例如啤酒、葡萄酒、 清酒等的酿造用酵母等。具体可以为酵母属(Saccharomyces)等酵母，在本发明中可以 使用啤酒酵母例如巴斯德酵母(Saccharomyces pastorianus) W34/70等，卡尔斯伯酵母 (Saccharomycescarlsbergensis)NCYC453、NCYC456 等，酿酒酵母 NBRC1951、NBRC1952、 NBRC1953.NBRC1954等。并且也可以使用威士忌酵母如酿酒酵母NCYC90等；葡萄酒酵母如 协会葡萄酒用1号、葡萄酒用3号、葡萄酒用4号等葡萄酒酵母；清酒酵母如协会酵母清酒 用7号、清酒用9号等清酒酵母，但并不限于这些酵母。在本发明中，优选使用啤酒酵母如 巴斯德酵母(Saccharomycespastorianus)。此外，作为被测酵母，可优选使用下述实施例中 使用的酵母。在本发明中，被测酵母优选使用引入定点突变后的酵母。定点突变的引入，可使用本领域技术人员公知的方法进行。引入定点突变时没 有限制，例如可利用(1)寡核苷酸引导的双琥珀型法(Oligonucleotide-directed Dual Amber 法，ODA法)/Takara Biomedicals、(2) LA PCR体外产生突变法/Takara Biomedicals 及(3)ExSite PCR-BasedSite-Directed Mutagenesis 试剂盒/STRATAGENE。以下对各方 法进行简单说明。(1)寡核苷酸引导的双琥珀型法(0DA法)/Takara Biomedicals
在卡那霉素抗性基因(Km)具有琥珀型突变的质粒(pKF 18k_2/19k_2等)内插入 目标基因。获得的DNA通过热变性变为单链DNA后，与修复Km的琥珀型突变的合成寡核苷 酸和用于在目标基因中引入目标突变的突变用合成寡核苷酸同时进行杂交。在维持引入的 突变的同时使该DNA进行复制，最终仅筛选Km的琥珀型突变被完全修复的DNA。筛选出的 DNA中以高准确率在目标基因中引入目标突变。(2)通过LA PCR体外产生突变的方法/Takara Biomedicals将期望引入突变的DNA片段插入任意质粒的多克隆位点中。通过引入目标基因的 目标突变的引物和多克隆位点附近的引物进行PCR(I)。另一方面，通过在目标基因的突变 引入的相反方向使多克隆位点中的一个位点(A)消失的引物，进行可覆盖插入的DNA片段 全体的PCR(II)。将PCR(I)及(II)的产物混合，进行包括引入的突变在内的插入DNA片段 全体可扩增的PCR。由此获得的DNA片段中具有目标突变的片段，因为克隆位点(A)已消 失，所以用限制性内切酶(A)酶切PCR产物后，如果进行利用位点(A)的亚克隆操作，在此 被再克隆的片段理论上引入了所有的目标突变。(3)ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis 试剂盒/STRATAGENE将期望引入突变的DNA片段插入适当的质粒内。通过在dam+(有DNA甲基化酶活 性)的大肠杆菌内增殖所获得的DNA，使GATC序列中的A成为甲基化状态。在正、反两个 方向合成用于引入目标突变的合成寡核苷酸，将这些合成寡核苷酸作为引物利用所述质粒 作为模板进行PCR。PCR之后，对于获得的DNA片段，用仅能酶切甲基化DNA的限制性内切 酶DpnI进行酶切，仅留下含有目标突变的DNA片段。将其用T4 DNA连接酶连接，形成环状 DNA后即可回收在目标基因内引入目标突变的质粒。在本发明中，为了鉴定与MAL21转运蛋白的葡萄糖诱导性降解抗性相关的残基， 或者为了使MTTl转运蛋白具有对于葡萄糖诱导性降解的抗性，将位于MAL61或者MTTl转 运蛋白N末端细胞质侧区域的第46位或者第50位氨基酸残基，分别取代为甘氨酸或者组 氨酸。即将编码天冬氨酸的密码子GAT取代为编码甘氨酸的密码子GGT，将编码亮氨酸的 密码子CTT取代为编码组氨酸的密码子CAT。可通过利用本领域技术人员公知的方法分析 突变操作结束后DNA碱基序列来进行突变引入的确认。此外，被测酵母也可使用实施突变处理后的酵母。突变处理，例如可使用紫外线照 射、放射线照射等物理方法，EMS (甲基磺酸乙酯)、N-甲基-N-亚硝基胍等药剂处理的化学 方法等任何方法(如参照大嶋泰治编著的“生物化学实验法39 酵母分子遗传学实验法”， P67-75，学会出版中心等)。上述被测酵母优选使用包含在MAL31或AGTl蛋白质的氨基酸序列中引入定点突 变后的突变型MAL31或突变型AGTl蛋白质的被测酵母。在低聚糖培养基(例如，麦芽糖培养基)上的培养，可利用公知的方法。在这种培 养过程中，将该酵母的生长繁殖水平作为指标，筛选包含不易因葡萄糖而导致失活或降解 的转运蛋白的酵母。转化株(以不具有α-葡萄糖苷转运蛋白基因的菌株作为宿主)中导入的转运蛋 白基因进行表达并发挥作用，例如，可通过在以0. 5%的麦芽糖或者麦芽三糖为唯一碳源、 含抗霉素3mg/L的最小必需培养基(无氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麦芽糖或者麦芽三糖5g/ L、抗霉素3mg/L)上有无生长繁殖来检验。即使是α-葡萄糖苷转运蛋白不发挥作用的菌株，在以麦芽糖或者麦芽三糖为唯一碳源的最小必需培养基上，也会有略微增殖。但是，如 果在以麦芽糖或者麦芽三糖为唯一碳源的最小必需培养基中加入呼吸阻断剂抗霉素，该菌 株则无法生长繁殖，所以由此可明确地判断α-葡萄糖苷转运蛋白的功能。例如利用一个 钼金勺从YPD平板(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L)上挑取供试菌株，悬 浮于Iml的灭菌水中，0D660 = 0. 2。收集菌，并再次悬浮于Iml的灭菌水中，然后再进行10 倍、100倍的稀释。将这些细胞悬浮液的系列稀释液各3 μ 1点样在试验培养基上，30°C培养 2-3天。生长繁殖的菌株，表示整合了表达载体、导入的α-葡萄糖苷转运蛋白进行表达并 发挥作用的菌株。接着，在含有0-2. OmM 2-脱氧葡萄糖的麦芽糖最小必需培养基(无氨基 酸酵母氮源6. 7g/L、麦芽糖20g/L、2-脱氧葡萄糖0-2. OmM)上、或者在含有0_8. OmM 2-脱 氧葡萄糖的麦芽糖完全合成培养基(SCM)(无氨基酸酵母氮源6. 7g/L、麦芽糖20g/L、硫酸 腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L_色氨酸20mg/ml、L_组氨酸盐酸盐20mg/ml、L_精氨酸 盐酸盐20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸30mg/ml、L-异亮氨酸 30mg/ml、L-赖氨酸盐酸盐30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨酸100mg/ml、L-天冬氨 酸100mg/ml、L-缬氨酸150mg/ml、L-苏氨酸200mg/ml、L-丝氨酸400mg/ml)上进行同样 点样，筛选在2-脱氧葡萄糖存在下也可生长繁殖的菌株。可以判断，在2-脱氧葡萄糖存在 下生长繁殖的菌株中，葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白进行表达并具有活性。[步骤⑵]下面，通过将步骤(1)筛选的酵母中包含的转运蛋白的氨基酸序列和因葡萄糖而 导致失活的水平已知的转运蛋白的氨基酸序列进行比较，鉴定有助于提高因葡萄糖而导致 的失活或降解的难度的氨基酸残基或氨基酸序列。在该步骤中，根据常规方法从筛选的酵母中分离编码转运蛋白的基因，根据常规 方法确定该基因的DNA序列，由DNA序列翻译成氨基酸序列。将所述待鉴定的氨基酸序列 和因葡萄糖而导致降解的水平已知的转运蛋白的氨基酸序列进行比较。因葡萄糖而导致降 解的水平已知的转运蛋白，例如，有α _葡萄糖苷转运蛋白Mal31p、Mal61p、Mttlp、Agtlp 以及这些转运蛋白的突变型蛋白质等(对于该各种核苷酸序列，例如参照Saccharomyces Genome Database 的 YBR298C (MAL31)及 YGR289C (AGTl)、以及 GenBank 的 X17391 (MAL61) 及DQ010171 (MTTl))。如下述实施例所述，根据该方法对具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性 特征的转运蛋白和无该特征的转运蛋白的氨基酸序列进行分析，结果确认Mal21p、Mal31p、 Mal61p及Mttlp中序列号2、4、6或8的第46 51位的氨基酸序列，Agtl中序列号10的 第51 56位的氨基酸序列与葡萄糖诱导性失活/降解抗性相关。对于各种氨基酸的位置， 参照图6及图7。[步骤⑶]在该步骤中，根据步骤(2)中获得的氨基酸序列信息，设计编码具有葡萄糖诱 导性失活/降解抗性的转运蛋白的多核苷酸。例如如上所述，因为确认Mal21p、Mal31p、 Mal61p及Mttlp中序列号2、4、6或8的第46 51位的氨基酸序列，Agtl中序列号10的 第51 56位的氨基酸序列与葡萄糖诱导性失活/降解抗性相关，所以进行突变时考虑这 种序列信息，设计例如编码将该部分的氨基酸取代为其它氨基酸后的序列的多核苷酸。此 外，如上所述，因为可取代的氨基酸的种类在某种程度上可特定，所以可设计编码将这种可 取代的氨基酸取代后的氨基酸序列的多核苷酸序列。作为基础氨基酸序列，可例举，例如从自然界获得的Mal21p (序列号2)、在下述实施例中获得的突变Mal31p (序列号38、40、42、 44,46或48)、突变Mal61p (序列号26或28)、突变Mttlp (序列号34)、突变Agtlp (序列号 32、34)等序列。[步骤4]在该步骤中，构建含有步骤(3)设计的多核苷酸的表达载体，根据常规方法将其 导入酵母中，将该酵母在低聚糖培养基(例如麦芽糖培养基)上进行培养。导入步骤(3) 设计的多核苷酸的酵母，优选包含在Mal31p蛋白质的氨基酸序列中引入定点突变后的突 变型Mal31p蛋白质、在Maieip蛋白质的氨基酸序列中引入定点突变后的突变型Maieip蛋 白质、在Mttlp蛋白质的氨基酸序列中引入定点突变后的突变型Mttlp蛋白质、或在Agtlp 蛋白质的氨基酸序列中引入定点突变后的突变型Agtlp蛋白质。进行培养时，通过测定该 酵母中包含的转运蛋白的葡萄糖诱导性失活/降解抗性、该酵母的低聚糖分解能力、增殖 速度、在麦汁中的发酵速度等，可评价该酵母的适应性。葡萄糖诱导性失活/降解抗性、低 聚糖分解能力、增殖速度、在麦汁中的发酵速度等，可通过下述实施例中使用的方法进行评 价。实施例以下通过实施例对本发明进行更加详细地说明，但本发明并不限于这些实施例。[试验方法]在本实施例中使用的试验项目和试验方法如下所示。只要无特别限制，本实施例 中的试验方法以此为标准。<MAL61, MAL31, MAL21 及 AGTl 基因的获取 >已经克隆了酿酒酵母的MAL61、MAL31、AGTl基因，并报道了其碱基序列。本说明 书中使用的MAL31(序列号3)从酵母基因组数据库(SaccharomycesGenome Database)注 册号YBR298C中获得，MAL61 (序列号5)从基因库(GenBank)注册号X17391中获得，以及 AGTl (序列号9)从酵母基因组数据库(Saccharomyces Genome Database)注册号YGR289C 中获得。因此，以MAL61、MAL31以及AGTl基因的碱基序列信息为基础，使用从具有所述各种 基因的酵母酿酒酵母中制备的染色体DNA作为PCR模板，通过PCR扩增、分离来获取MAL61、 MAL31 及 AGTl 基因。对于MAL21，已知其被III号染色体编码，但并不知道其DNA序列。但是因为考虑 到被II号染色体编码的MAL31与被VIII号染色体编码的MAL61基因具有99%以上的同一 性，所以预测与MAL21也具有相当高的同一性。实际上本实施例中的MAL21、MAL31及MAL61基因的全部基因，以仅具 有各自的α-葡萄糖苷转运蛋白的酵母的染色体DNA作为模板，使用相同引物 (5，AGAGCTCAGCATATAAAGAGACA 3，(序列号 11)禾口 5，TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3，(序列 号 12))即可获取。AGTl 是使用引物(5’ TGAGCTCACATAGAAGAACATCAAA 3，(序列号 13)和 5‘ATGGATCCATATGAAAAATATCATT 3，(序列号 14))来获取的。具体来说，MAL31 和 AGTl 是利 用酿酒酵母S288C(ATCC204508 (Rose，Μ. D. ,Winston，F. and Hieter，P. (1990) =Methods in Yeast Genetics ALaboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ColdSpring Harbor, NY))通过PCR来获取的，MAL61是利用酿酒酵母ATCC96955通过PCR 来获取的，MAL21是利用酿酒酵母ATCC20598通过PCR来获取的。
使用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒将获取的DNA片段插入到载体 pCR(注册商标)2. 1-T0P0后，通过DNA测序确认插入的基因序列。对于MAL31、MAL61、 AGTl，确认与数据库中注册的序列(注册号分别为YBR298C、X17391及YGR289C)相同。对 于MAL21，独立对10个克隆以上测序，确定了其序列(序列号1)。此外，所使用引物中起始密码子的上游有XbaI或者SacI位点，终止密码子的下游 有BamHI位点，这些位点已整合到表达载体内。通过使用染色体DNA的目标基因的PCR扩 增以及其后的分离，包括PCR引物的制备，均可利用本领域技术人员公知的方法进行。<MTT1基因的获取〉制备下面啤酒酵母Weihenstephan 34/70的基因组DNA，将质粒YCp49H(图19)作 为载体，构建DNA文库。将该文库转化到酿酒酵母HH150 (CBllAagtl ::G418R)中，涂布于 含有300μ g/ml潮霉素和0. 5%麦芽三糖的最小必需培养基上。因为CBll菌株是adel菌 株，所以作为腺嘌呤的前体的5-氨基咪唑核苷(5- 7 S 7 ^ S Ψ·； # * F )蓄积， 并进一步发生聚合从而使菌落呈红色。AGTl被破坏的ΗΗ150 (CB11 Δ agtl :G418R)菌株涂 布于以麦芽三糖为唯一碳源的培养基上时，生长繁殖非常缓慢，并且菌落为白色。如果在培 养基上添加抗霉素，可完全阻止其在以麦芽三糖为唯一碳源的培养基上的生长繁殖。但是， 因为抗霉素的毒性高，所以可通过在不使用抗霉素的情况下筛选红色菌落的试验来获取麦 芽三糖转运蛋白。在30°C培养3天，将生长繁殖的红色菌落在相同培养基上划线，并确认在 相同培养基上的生长繁殖情况。从生长繁殖良好的21个红色菌落中制备质粒，将该质粒转 化到大肠杆菌DH5ci中，利用大肠杆菌大量制备质粒。再次转化到HH150中，并涂布于相同 培养基上。从生长繁殖良好的18个红色菌落中提取质粒。将插入片段的DNA进行测序，结果在17个中发现认为与MAL61有90%同一性的转 运蛋白的相同序列。因为该基因具有与J. Dietvorst et. al. Yeast 2005 ；22 :775_788中 报道的MTTl (GenBank注册号DQ010171)完全相同的序列，所以将该基因称为MTTl (核苷酸 序列用序列号7表示，氨基酸序列用序列号8表示)。使用引物(5’TCTAGAATTACATCCAAGAC TATTAATTAACTATG 3，(序列号 15)和 5，TGGATCCGTATCTACCTACTGG 3，(序列号 16))，通过 PCR在起始密码子的上游导入XbaI位点、终止密码子的下游导入BamHI位点，从而将MTTl 基因整合到表达载体内。<表达质粒、文库构建质粒>在本发明中，使用⑴ (4)的4个表达载体，文库构建用质粒使用(5)。(l)pJHXSB (图 15)(2)pJHIXSB (图 16)(3)pYCGPY (图 17)(4)pUP3GLP (图 18)(5)YCp49H (图 19)〈酵母株〉在本发明中，在获取转运蛋白基因和进行菌株之间比较时使用菌株(1) (6)，在 利用转运蛋白高表达菌株确认生长繁殖速度、发酵速度时使用菌株(7) (10)，在获取突 变型基因时使用菌株(11)。(1)酿酒酵母 S288C(ATCC204508) (MATalpha SUC2 mal mel gal2 CUP1)
17
(2)酿酒酵母 ATCC96955(MATa MAL61 MAL62 MAL63 mal64 malll MAL12mall3 ura3-52 leu2_3 leu2_112 trpl his)(3)酿酒酵母 ATCC20598 (MATa sue MAL2 MELl his4 leu2)(4)酿酒酵母CBll (Berkley Stock Center) (MATa adel MAL61 MAL62MAL63 AGTl MAL12 MAL31 MAL32)(5)下面啤酒酵母 Weihenstephan 34/70(6)酿酒酵母 HH150 = (CBl 1 Δ agtl G418R) (MATa adel MAL61 MAL62MAL63Aagtl: :G418R MAL12 MAL31 MAL32)(7)酉良 酒酵母 HH1001 (MATa SUC2 ma 1 me 1 ga 1 2 CUP1TPI1::TPIlpr-MAL32"G418R ura3)(8)酿酒酵母 Δ 152MS(MATa mal61: :TRP1 MAL62 MAL63 mal64 malll MAL12mall3 leu2-3 leu2-112 his URA3::TDH3p::MAL62)(9)上面啤酒酵母AH135(10)下面啤酒酵母 Weihenstephan 194(11)酿酒酵母 HH1002 (MATa SUC2 mal me 1 gal2 CUP 1 TPI1::TPIlpr-MAL32"G418R ura3 dogl dog2)〈定点突变的引入〉在本实施例中，将获取的转运蛋白基因导入表达载体pJHIXSB内后，使用引物(表 1)，通过 ExSite PCR-Based Site-Directed Mutagenesis 试剂盒/STRATAGENE 引入突变。 突变引入方法的详细内容，根据STRATAGENE公司的操作指南。表1 表1定点突变使用的引物序列
突变型基因
引物序列
MAL61[D46G] MAL61[L50H] MAL61[D46G, L50HJ MIT1[D46G]
5, GTCTTTCCCATCTTGAGTACGGTCC 3,
S'-CAAAATCACTTTTCTTACCTTGCTCCT-S'
5'-ATGAGTACGGTCCAGGTTCACTAA-3· 5'-GATGGGAAAGATCAAAATCACTTTTC-3'
S'-GTCTTTCCCATCATGAGTACGGTCCA-S' 5'-CAAAATCACTTTTCTTACCTTGCTCCT-3' 5'.GTCTTTCCCATCATGAGTACGGTCC-3· S'-CAAAATCACTTTTCTTACCTTGCTCCT-S·<转运蛋白的2-脱氧葡萄糖抗性的评价>已知2-脱氧葡萄糖(2-D0G)只能代谢成2-D0G-6-磷酸，所以是不能作为碳源的 糖类似物，但产生与葡萄糖同样水平的葡萄糖阻遏或者同样水平的因葡萄糖而导致失活。 因此，在这种平板上生长繁殖的菌株，具有不易因葡萄糖而导致失活的α -葡萄糖苷转运 蛋白的可能性较高。使用以下2种培养基，通过下述方法来检验对2-D0G的抗性在[1] 含有0-2. OmM 2-脱氧葡萄糖的麦芽糖完全合成培养基(SCM)(无氨基酸酵母氮源6. 7g/L、 麦芽糖20g/L、硫酸腺嘌呤20mg/ml、尿嘧啶20mg/ml、L-色氨酸20mg/ml、L-组氨酸盐酸盐20mg/ml、L-精氨酸盐酸盐20mg/ml、L-蛋氨酸20mg/ml、L-酪氨酸30mg/ml、L-亮氨酸 30mg/ml、L-异亮氨酸30mg/ml、L-赖氨酸盐酸盐30mg/ml、L-苯丙氨酸50mg/ml、L-谷氨 酸 100mg/ml、L-天冬氨酸 100mg/ml、L-缬氨酸 150mg/ml、L-苏氨酸 200mg/ml、L-丝氨酸 400mg/ml)，或者[2]含有0_2. OmM 2-脱氧葡萄糖的麦芽糖最小必需培养基(无氨基酸酵 母氮源6. 7g/L、麦芽糖20g/L)的任一种平板上，分别将各转运蛋白表达株的细胞悬浮液的 系列稀释液3 μ 1点样在试验培养基上，30°C培养2 3天。<转运蛋白在菌体内蓄积量的测定>转运蛋白的菌体内的蓄积量，可通过例如Western印迹法进行测定。例如从IOml 培养液中回收处于对数增殖期的供试菌株，在裂解缓冲液中(8M尿素、5% (w/v)SDS,40mM Tris-HCl (pH6. 8)、0. ImM EDTAU % β _巯基乙醇)通过用玻璃珠搅拌破碎，获得细胞提取 液。用SDS-凝胶电泳分离总蛋白质为60 μ g的样本，并转印到硝基纤维素膜上，随后使用 抗Mal61p的兔多克隆抗体进行Western印迹分析。抗Mal61p的兔多克隆抗体根据以下方法获取。将编码Mal61p N末端区域 (Metl-Leul81)的DNA与pET表达载体(Novagen公司)的GST标签的下游连接，并转化到大 肠杆菌BL21 (DE3)中，将所述转化体的细胞破碎液加入到GST树脂结合柱中，通过洗脱与柱 子结合的蛋白质来制备所述抗体。详细内容根据Novagen公司的pET表达系统，GST -Bind 亲和树脂(Novagen社)内附加的操作指南。制备的融合蛋白质，通过SDS-PAGE确认纯度 后，将其作为抗原来免疫兔从而获得多克隆抗体。对于抗体的有效性，通过下述方法确认， 即将表达了 α-葡萄糖苷转运蛋白基因(MAL61，MAL31，MAL21)的酵母株和不具有该基因 的宿主株在YPM培养基(酵母浸膏10g/L、多聚蛋白胨20g/L、麦芽糖5. 0g/L)上培养，利用 上述方法使用相应的细胞破碎液和所述抗体进行Western印迹分析。利用所述抗体，仅在 表达α-葡萄糖苷转运蛋白基因的酵母株破碎液中，检测出与68kDa的α -葡萄糖苷转运 蛋白(MAL61，MAL31，MAL21)分子量一致的阳性条带。构建编码在Agtlp的C末端部串联连接2个红细胞凝集素(HA)标签的融合蛋白的 基因，利用上述方法获取表达该基因的菌株，来测定Agtlp的菌体内蓄积量。抗体使用抗红 细胞凝集素(hematoagglutinin)的小鼠单克隆抗体(Covance, Research, Products, Inc. 公司)。<转运蛋白的降解速度的测定>将表达各转运蛋白的菌株接种于YPD中，30°C振荡培养过夜。将培养液接种于YPM 培养基中，使0D660 = 1.0，30°C振荡培养2. 5小时，并收集菌。测取60个0D660单位的细 胞，使其悬浮于30ml预先在30°C保温的降解速度测定用培养基[无氨基酸酵母氮源(不含 氨)1.7g/L、葡萄糖20g/L、环己酰亚胺25yg/L]中，30°C进行温育。在适当的时间(0、10、 20,30及40分钟或者0、30、60、90及120分钟)抽取细胞悬浮液样品5ml，快速离心弃除上 清液，将细胞用乙醇干冰冷冻。根据上述方法从冷冻细胞中检测转运蛋白，测定蛋白条带的 强度，由强度的减少速度计算半衰期。<突变型Mal61p/突变型Agtlp/突变型Mttlp/突变型Mal31p>本发明的突变型Mal61p/突变型Agtlp/突变型Mttlp/突变型Map31p，分别是表 2、3、4及5所示的13个转运蛋白。表2突变型及天然型α -葡萄糖苷转运蛋白(Maieip)第39 52位的氨基酸序表4突变型及天然型α-葡萄糖苷转运蛋白(Mttlp)的第39 52位的氨基酸序
权利要求
多核苷酸，其编码由使序列号4、6、8或10的氨基酸序列发生突变后的突变序列组成、且具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白，其特征在于，使序列号4、6或8的氨基酸序列的第39～52位的氨基酸序列QGKKSDFDLSHLEY或QGKKSDFDLSHHEY、或者序列号10的氨基酸序列的第44～57位的氨基酸序列GKKDSAFELDHLEF中发生1～5个氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突变。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，编码使所述第39 52位的氨基酸序列 或第44 57位的氨基酸序列以外的序列部分进一步发生1 15个氨基酸的缺失、取代、 插入及/或添加的突变后的突变序列组成的转运蛋白。
3.如权利要求1或2所述的多核苷酸，其特征在于，使序列号4、6或8的氨基酸序列的 第46 51位的氨基酸序列DLSHLE或DLSHHE、或者序列号10的第51 56位的氨基酸序 列ELDHLE中发生1 5个氨基酸的缺失、取代、插入及/或添加的突变。
4.多核苷酸，其特征在于，包含由序列号25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47或 49的碱基序列组成的多核苷酸。
5.多核苷酸，其特征在于，包含由序列号29、33、35、39、41、43或47的碱基序列组成的 多核苷酸。
6.多核苷酸，其特征在于，包含编码由序列号26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、 48或50的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸。
7.多核苷酸，其特征在于，包含编码由序列号30、34、36、40、42、44或48的氨基酸序列 组成的蛋白质的多核苷酸。
8.如权利要求1 7中任一项所述的多核苷酸，其特征在于，其为DNA。
9.蛋白质，其特征在于，其为由权利要求1 8中任一项所述的多核苷酸编码的蛋白质。
10.载体，其特征在于，包含权利要求1 8中任一项所述的多核苷酸。
11.转化酵母，其特征在于，该转化酵母中导入了权利要求10所述的载体。
12.如权利要求11所述的酿造用酵母，其特征在于，通过导入权利要求10所述的载体， 提高了低聚糖分解能力。
13.如权利要求12所述的酿造用酵母，其特征在于，通过增加权利要求9所述的蛋白质 的表达量，提高了低聚糖分解能力。
14.酒类的制造方法，其特征在于，使用权利要求11 13中任一项所述的酵母。
15.如权利要求14所述的酒类的制造方法，其特征在于，酿造的酒类是麦芽饮料。
16.如权利要求14所述的酒类的制造方法，其特征在于，酿造的酒类是葡萄酒。
17.酒类，其特征在于，其为利用权利要求14 16中任一项所述的方法制造的酒类。
18.获取包含具有葡萄糖诱导性失活/降解抗性的转运蛋白的酵母的方法，其特征在 于，包括步骤1，将多个被测酵母在含有2-脱氧葡萄糖的低聚糖培养基上培养，将其生长繁殖 水平作为指标，筛选包含不易因葡萄糖而导致失活或降解的转运蛋白的酵母；步骤2，通过比较步骤1中筛选的酵母中包含的转运蛋白的氨基酸序列和因葡萄糖而 导致失活或降解水平已知的转运蛋白的氨基酸序列，来鉴定有助于提高因葡萄糖导致的失 活或降解的难度的氨基酸残基或氨基酸序列；步骤3，根据步骤2中获得的氨基酸序列信息，设计编码具有葡萄糖诱导性失活/降解 抗性的转运蛋白的多核苷酸；以及步骤4，将步骤3中设计的多核苷酸导入酵母中，将该酵母在低聚糖培养基上培养，测 定该酵母中包含的转运蛋白的葡萄糖诱导性失活/降解抗性、该酵母的低聚糖分解能力、 增殖速度及/或在麦汁中的发酵速度。
全文摘要
本发明涉及葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白基因及其用途，特别涉及对低聚糖(麦芽糖、麦芽三糖等)分解性优异的酿造酵母、使用该酵母制造的酒类、其制造方法等。特别是本发明涉及Mal21p、突变Mal31p、突变Mal61p、突变Mtt1p、突变Agt1p等葡萄糖诱导性失活/降解抗性转运蛋白、编码该转运蛋白的基因、利用该转运蛋白的酒类的制造方法等。
文档编号C12C11/02GK101952425SQ20088000063
公开日2011年1月19日 申请日期2008年9月9日 优先权日2008年9月9日
发明者大村文彦, 畠中治代 申请人:三得利控股株式会社