专利名称：甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA和使用所述反义DNA增加贮藏根产量的方法
技术领域：
本发明涉及可用于生产高产性贮藏根的甘薯扩张蛋白cDNA的反义 DNA。更具体来说，本发明涉及甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA、携带 所述反义DNA的转化载体、和使用所述反义DNA增加贮藏根产量的方 法。
背景技术：
自从Cosgrove及其同事(McQueen-Mason等人，1992, Plant Cell 4， 1425-1433)发现扩张蛋白以来，人们已经对其进行了深入研究。在早期的 研究中，扩张蛋白被认为是至少部分介导植物细胞壁的pH依赖性伸展和 细胞的生长的细胞壁松弛酶(loosening enzyme)(Cosgrove, 2000, Nature 407， 321-326)。其后，发现扩张蛋白以a-形式或P-形式存在(Shcherban等 人，1995, PNAS 92， 9245-9249)。
最近，己经发现扩张蛋白除了参与调节细胞扩展外，还参与调节多 种其它植物过程，所述过程包括形态发生(Ruan等人，2001, Plant Cell 13， 47-60)、果实的软化(Rose等人，2000, Plant Physiology 123， 1583-1592; Civello等人，1999， Plant Physiology 121， 1273-1280)、花粉管的生长 (Cosgrove等人，1997， PNAS 94, 6559-6564)、重力感应根(graviresponding root)的伸长(Zhang禾Q Hasenstein, 2000， Plant Cell Physiology 41， 1305-1312)、和根部细胞的伸长(Lee等人，2003， Plant Physiology 131， 985-997)(参见综述，Lee等人，2001， Cur, Opin, Plant Biol. 4， 527-532)。
此外，已充分研究了扩张蛋白在水作稻(flooded rice)和番莉中的表达 模式。已经发现，扩张蛋白在番茄的茎端分生组织(shoot apical meristem) 中表达以使初始叶原基发生(Reinhardt等人，1998, Plant Cell 10,1427-1437)。克隆了一种扩张蛋白基因(五x/^)并且通过携带有该基因的转 化体发现，该基因在番茄果实的生长和成熟中发挥重要作用(Brummdl等 人，1999，PlantCe11， 11:2203-2216)。扩张蛋白mRNA在细胞壁的生长速 率或松弛程度刚要开始增加前累积，表明扩张蛋白基因的表达与细胞伸 长相关(Cho和Kende， 1997a， Plant Cell 9, 1661-1671; 1997b， Plant Physiology 113， 1137-1143; 1998， PlantJoumal 15, 805-812)。观察到扩张 蛋白在其中过表达的转基因稻类植株的子叶的长度与野生型相比进一步 增加了 31。/。 97。/。(Choi等人，2003 Plant Cell, 15: 1386-1398)。然而该转 基因稻类植株由于雄性不育而不能够结种。
另一方面，因为甘薯贮藏根含有大量的淀粉和多种无机营养物，其 对人类是一种良好的能量来源，并且由于其具有高含量的纤维(对机体有 用的材料)，因而是具有有益健康效果的高附加值作物。
最近，由于通过植物发酵获得的生物乙醇作为替代性能源的来源而 受到关注，甘薯贮藏根也被认为是一种有用的替代性能源作物。
考虑到增强替代性能源的价格竞争力，增加替代性能源作物栽培的 单位面积的生产力是非常重要的。
此外，很少有关于贮藏根产量的分子机理的研究，这是因为贮藏根
的材料不适合于分子研究，其原因如下(l)由于具有大量的多糖，不易
提取DNA禾PRNA;和(2)由于贮藏根在地下生长，不易监测贮藏根的生 长，因而限制了调节甘薯贮藏根发育的分子育种研究。
因此，己经存在对调节甘薯贮藏根发育的分子育种的需要和对能够 通过分子育种显著增加产量的转基因甘薯的需要。
发明内容
因此，鉴于现有技术中所存在的上述问题而实现了本发明，并且本 发明的一个目的是提供甘薯扩张蛋白(/6五x;7a"w'")cDNA的反义DNA，通 过该反义DNA可以制备高产性的甘薯。
本发明的另外一个目的是提供使用/Mx戶"^ cDNA的反义DNA通 过抑制扩张蛋白的表达而增加贮藏根产量的方法。
4本发明的又一个目的是提供一种高产性的转基因甘薯，所述甘薯包
含携带所述/^Exp^7w'w cDNA的反义DNA的载体。
因此为了实现上述目的，本发明提供了增加贮藏根产量的方法，所述方法包括抑制扩张蛋白基因在植物的细胞中的表达。
根据本发明的优选实施方式，所述方法还包括向所述植物引入来源于甘薯扩张蛋白基因(/6五Jcpara/")的cDNA的反义DNA。
根据本发明的优选实施方式，所述方法还包括向二元载体中插入所述扩张蛋白基因的反义DNA，并向所述植物引入该二元载体。
所述反义DNA包含SEQ IDNO.:9的核苷酸序列。
所述植物是甘薯。
根据本发明的另外一个方面，本发明提供了制备高产性转基因甘薯的方法，所述方法包括向甘薯引入甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA。
根据本发明的又一个方面，本发明提供了适合于扩增包含SEQ IDNO.: 9的核苷酸序列的DNA片段的PCR引物，所述引物由SEQ ID NO.:10或SEQ ID NO.: 11所示的核苷酸序列中的一条序列表示。
本发明提供了可用于转化植物的cDNA(来源于甘薯6atoto力的扩张蛋白cDNA)的反义DNA，并且获得的转基因植物能够通过抑制根的伸长生长从而加速贮藏根的生长。因此，本发明可用于生产高产性的转基因贮藏根。
通过下面的结合附图的详细说明，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它优点，其中
图1是显示克隆全长甘薯扩张蛋白cDNA的初次PCR(primary PCR)的结果的图2是显示将初次PCR的产物作为模板，克隆全长甘薯扩张蛋白cDNA的再次PCR(secondary PCR)的结果的图3是显示根据本发明通过PCR克隆的全长甘薯扩张蛋白cDNA的
图；图4显示甘薯扩张蛋白cDNA的氨基酸序列和其它植物扩张蛋白cDNA的氨基酸序列的比较；
图5显示甘薯扩张蛋白cDNA和其它植物扩张蛋白cDNA之间的氨基酸序列同源性；
图6显示在检测甘薯扩张蛋白基因的表达模式中使用的甘薯组织；
图7给出显示在甘薯中甘薯扩张蛋白基因的表达模式的Northern印迹分析的结果；
图8显示在构建二元载体的各个处理阶段所获得的结果，所述二元载体用于将本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA携带到甘薯中；
图9是显示p/6^c/ a"w'"-anti 二元载体的结构的示意图，所述二元载体用于将本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA携带到甘薯中；
图10显示在甘薯中诱导的胚性愈伤组织(embryogenic callus),所述愈伤组织用于将本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA转入甘薯；
图11是显示用于检验在甘薯转化体中/6五Jc/ ara/w cDNA的反义DNA的插入的电泳结果的图，所述甘薯转化体表达本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA;
图12是显示用于检验在甘薯转化体中/6五;c; ^m'"的表达的电泳结果的图，所述甘薯转化体表达本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA;
图13显示甘薯转化体和野生型甘薯在离体切割10天后根部生长的比较，所述甘薯转化体表达本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA;
图14显示甘薯转化体和野生型甘薯在离体切割10天后在细胞水平上的根部生长的比较，所述甘薯转化体表达本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA;
图15显示甘薯转化体和野生型甘薯的生长的比较，所述甘薯转化体表达本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA;和
图16显示甘薯转化体和野生型甘薯的贮藏根产量的比较，所述甘薯转化体表达本发明的甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA。
具体实施方式
下面将参考
本发明的优选实施方式。
首先，本发明的发明人取得了以下成功克隆了甘薯扩张蛋白
(/6^para/力的cDNA、使用所述cDNA的反义DNA构建了适合于植物转
化的二元载体、和将所述载体转化到甘薯中。发现该转基因甘薯的贮藏
根产量有显著的增加。
因此，本发明提供了甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA,所述反义
DNA包含SEQ ID NO.: 9的核苷酸序列。
所述cDNA的反义DNA具有1，213 bp (碱基对)长度的核苷酸序列。另夕卜，本发明提供了用于转化植物的二元载体(p/6五x戸肌'"-anti)，所
述二元载体携带甘薯(/;wwoea 6atotoy)扩张蛋白cDNA(m&^""w'")的反义
DNA。
所述植物转化载体是能够在植物中稳定表达感兴趣的外源基因的二元载体。
在pMBPl载体中，本发明的甘薯扩张蛋白cDNA(/6&戶"^)的反义DNA位于CaMV35S启动子和NOS终止子之间。本领域技术人员应该能够理解的是，可以使用任何其它的植物转化载体来代替pMBPl载体。
另外本发明提供了在二元载体上携带本发明的甘薯扩张蛋白cDNAC/M^a^'w)的反义DNA的转基因甘薯。
所述二元载体可使用农杆菌(Agrobacterium)或基因枪引入到植物中。在本发明的一个实施方式中，使用基因枪法(Sanford等，1993)转化甘薯。
除甘薯之外，本发明的甘薯扩张蛋白cDNA(/6五x/^"w'")的反义DNA还可转入任何适于具有增加的贮藏根产量的植物贮藏根中。
另外，本发明提供了一对用于PCR扩增本发明的甘薯扩张蛋白cDNA(/6五jc戸ra!'")的反义DNA的引物，所述引物以SEQ ID NO.: 10和SEQ ID NO.: 11表示。
另外，本发明提供了通过利用扩张蛋白cDNA的反义DNA抑制该扩张蛋白基因的表达而增加贮藏根产量的方法。
另外，本发明提供了增加贮藏根产量的方法，所述方法通过将扩张蛋白cDNA的反义DNA插入二元载体并将该二元载体引入到植物中来进行。如上所述，扩张蛋白家族基因中的一些基因已被公开，但在本发明之前的报告中没有任何地方提到扩张蛋白基因用于增加贮藏根产量的应
用。根据本发明，可将各种扩张蛋白cDNA的反义DNA引入到植物中以增加它们的贮藏根产量。
实施例l:甘薯扩张蛋白cDNA的克隆
从甘薯的新鲜块根(tuber)分离总RNA并将其用于构建EST(Expressed Sequence Tag,表达序列标签)文库。使用这一文库克隆2,859个EST并以NCBI登录号BU690119 BU692977存储在国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)(You等人，2003， FEBS Letters 536， 101-105)。其中发现仇&p朋w'"(NCBI登录号BU691452)具有约为1 kb的长度，将其鉴定为缺少起始密码子ATG的部分cDNA。为了获得全长/6￡x/ a" '"，在/W^戶肌'"-特异性引物(SEQ IDNO.: 3)和T3载体引物存在的情况下，以已经存在的早期甘薯贮藏根发育的EST文库作为模板进行PCR。然而在预期的5'全长大小的位置没有可见条带(图1)。
在预期的全长位置从琼脂糖凝胶切下凝胶块，从所述凝胶块洗脱DNA片段，并将所述DNA片段用作模板，以由基因特异性嵌套引物(SEQIDNO.: 4)和T3引物组成的一套引物进行PCR。作为结果，获得了具有约350 bp长度的PCR产物(图2)。
将PCR产物插入pGEM-T Easy载体中进行测序分析，并鉴定到/^&cpcmw'"的5'序歹!j。
在核苷酸序列的基础上，合成了在其末端分别带有BamHI和Kpnl限制位点的5，引物和3'引物。使用这些引物进行RT-PCR而获得全长iM!xpa"j/"(图3)。
实施例2:全长/6^C/7a"W"核苷酸序列的测序和分析
通过PCR克隆1.2 kb的全长cDNA并插入到pGEM-T Easy载体中，随后将其进行扩增。测序分析表明，化五x/^附/"长l，213bp并且由33bp的5，-UTR(untranslated region,非翻译区)、717 bp的ORF(open readingframe,开放阅读框)和463 bp的3'-UTR组成。这一全长/Mx戶肌'"cDNA
8以登录号DQ515800在NCBI注册。由238个氨基酸残基构成的该/^Ex:;wm'"氨基酸序列除N-末端区域外高度保守(图4)，并且与番茄和胡椒的扩张蛋白氨基酸序列有高达78%的同源性(图5)。
实施例3:组织的Northern印迹分析
1.Northern印迹
利用处于不同发育阶段的各种组织通过Northern印迹检测/6￡!xj7<myz>2的表达模式o
为了分离总RNA，使用甘薯的处在不同发育阶段的根、茎、叶片和叶柄作为RNA的来源。也就是说，从下列组织中分离总RNA:非贮藏根阶段的组织，例如根(FRN:非贮藏根阶段的须根)、茎(莲-FRN)、叶片(叶片-FRN)和叶柄(叶柄-FRN);早期贮藏根阶段的组织，例如根(早期贮藏根阶段的须根，FRES);贮藏根阶段的组织，例如根(SR)、茎(茎-SR)、叶片(叶片-SR)和叶柄(叶柄-SR);和晚期贮藏根阶段的组织，例如根(晚期贮藏根阶段的须根，FRLS)(图6)。使用4.4 M胍盐-SDS裂解缓冲液(Chirgwin等人，1979)/5.7 M CsCl梯度法(Glisin等人，1974)进行总RNA的提取。将约20吗所提取的总RNA在1%的琼脂糖-甲醛凝胶上进行电泳并转移到Tropilon-plusTM尼龙膜(Tropix，美国)上。
通过PCR对2.5 ng的携带有l kb扩张蛋白EST克隆的质粒进行扩增来得到探针，所述PCR在最终体积为lOpl的PCR混合物中进行，所述PCR混合物含有100 (iM除dCTP之外的dNTP混合物、100 |oM dCTP-生物素、各为10一的载体 (pBluescript II)、弓|物T3(5,-AATTAACCCTCACTAAAGGG-3， ； SEQ ID NO.: 7)和T7(3,-CGGGATATCACTCAGCATAATG-5，； SEQ ID NO.: 8)、 lxPCR缓冲液、和1单位Taq聚合酶，开始是在95'C预变性5分钟，之后是35个以下循环在95。C变性10秒、在65'C退火30秒、和在72。C延伸30秒。
使用QIAquick PCR纯化试剂盒(QIAGEN,德国)纯化PCR扩增的生物素化探针并将其以约100 ng的量加到膜上，随后在65。C杂交18小时。按以下方法洗涤膜在室温下，用2xSSC/l。/。SDS洗涤两次，每次5分钟；然后在室温下，用0.1xSSC/lQ/。SDS洗涤两次，每次15分钟；最后在室温下，用lxSSC洗涤两次，每次5分钟。使用Southern-star 试剂盒(Tropix，美国)进行探针检测。使用封闭缓冲液(lxPBS, 0.2%I-BlockTM试剂和0.5n/。SDS)处理印迹并使用碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素进行标记，随后使用CDP-StarTM(即用型，Ready to Use)处理。将膜暴露于X射线胶片(Fujifilm，日本)IO分钟 1.5小时。2. /Z 5x戶ra/"的表达模式
在PCR中使用生物素标记的甘薯/6五Jcpa"w'" EST克隆(约1 kb)，并将其在Northern印迹中用做探针。
在非贮藏根阶段的组织中检测到历五x/^似/"的表达，所述组织包括FRN、茎-FRN、叶片-FRN和叶柄-FRN，其中FRN和叶柄-FRN具有最高的表达水平。然而在晚期贮藏根阶段的块根组织中检测到显著下降的/M;;cpa"W"的表达水平，同时在贮藏根阶段的茎和叶片中检测到明显降低的/6五x/^"Ww的表达水平(图7)。这些表达模式强有力地提示/6￡jc/^"W"与贮藏根发育的早期阶段中的根的伸长生长有关，而且它的活性不促进贮藏根的发育。
实施例4: 二元载体的构建
合成带有Kpnl限制位点的5'引物(SEQ ID NO.: 10)和带有BamHI限制位点的3'引物以构建敲除二元载体。利用所述引物进行PCR以获得全长的/M^am&(NCBI登录号DQ515800)cDNA。将PCR产物插入pGEM-T Easy载体，并以BamHI和Kpnl消化pGEM-T Easy载体以从中切下cDNA。将cDNA消化物在CaMV35S启动子和NOS终止子之间以反义方向插入到pMBPl载体中，以构建二元载体p/6五^^咖'"-anti(图9)。通过克隆性PCR和限制酶消化确认插入(图8)。
实施例5:在甘薯中引入胚性愈伤组织
连同腋芽一起切下甘薯(名为"Youlmi")的茎并在MS基础培养基(Murashige和Skoog， 1962)中以下述条件培养，所述条件是用于离体培养甘薯的1，000 lux(勒克斯)的冷白色荧光灯和16小时光周期的条件。在解剖显微镜下除去嫩叶后，从所培养的茎移取高约150 pm且直径约350 pm的顶端分生组织，并且使培养基接触该顶端分生组织的切割表面(Cantliffe等人，1987; Liu等人，1989)。为了诱导胚性愈伤组织，通过下述方法制备MS基础培养基向MS无机盐加入100 mg/L的肌醇(myoinositol)、0.4 mg/L的盐酸硫胺素(thiamine-HCl)、 30 g/L的蔗糖、和4 g/L的固化剂(Gelrite)，将pH调节到5.8，加入1 mg/L的2，4-D，并在陪替氏培养皿(PetriDish)中使用(所获得的培养基称为MSID)。
每间隔一个月在相同培养基上继代培养该愈伤组织(图10)。实施例6:使用基因枪对甘薯进行的转化和甘薯转化体的筛选将胚性愈伤组织切割成直径为1 mm 2 mm的细胞团。将约50 60个愈伤组织团放置在盛有MS1D培养基的陪替氏培养皿的中央部分，并在培养一天后进行轰击。以氦气在I，IOO PSi (Pounds per square inch,磅/平方英寸)的真空条件下进行颗粒轰击。轰击根据Sanford等人的方法进行，所述方法包括在离愈伤组织团6 cm的间距处，以包被有DNA的金颗粒轰击，其中使用l.OpgDNA禾卩1,100 PSi压力的氦气。在黑暗中在25°C的温度培养两天后，在相同条件下进行再一次轰击。在黑暗中在25°C的温度培养一周后，将愈伤组织团在含有100 mg/L卡那霉素的MS1D固体培养基(选择培养基)上于25'C的温度和约2,000 lux继代培养2个月。为了促进在选择培养基上被胁迫的愈伤组织的恢复和新芽(shoot)的分化，将所选的分生组织团转移到含有10 mg/L 2iP(异戊烯腺嘌呤)和100 mg/L卡那霉素的MS1D固体培养基。在转移到选择培养基一个月后，将浅绿色的愈伤组织优先转移到MS基础培养基以诱发嫩芽，并转移到含20mg/LNAA(萘乙酸)的培养基以诱导根部发育。约每两周进行一次继代培养。
开始发育出芽和根部的愈伤组织在MS基础培养基上再生成为植株。借助QIAquickTM植物DNA miniprep试剂盒(QIAGEN，德国)从转化植株的叶片中分离DNA。
使用所分离的 DNA ， 禾U用引物 NPTII5'(GAGGCTATTCGGCTATGACTG - SEQ ID NO.: 12)和引物NPTII3'(ATCGGGAGCGGCGATACCGTA-SEQIDNO.: 13)进行PCR，开始是在95。C预变性5分钟，然后进行30个以下循环在95'C变性30秒、在65°C退火30秒和在72'C延伸1分钟。如此制得的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离以检测700bp条带(图11)。
实施例7:转基因甘薯的表达分析
借助4.4 M胍盐-SDS裂解缓冲液(Chirgwin等人，1979)和5.7 M CsCI 梯度法(Glisin等人，1974)，从转化甘薯的叶片中分离RNA。将含有总 RNA(6吗)和dNTP Oligo dT引物(10 pM)的样品的总量调节到13 |il， 在68匸变性5分钟，然后立即转移到冰上。在向各样品中加入4^1的5><^1-缓冲液、1 W的核糖核酸酶(RNase)抑制剂(RNasin)、 1 |al的0.1 MDTT(二 硫苏糖醇)、和200U/nl的逆转录酶(SuperscriptlII)后，在50'C进行逆转 录80分钟，接着立即在7(TC变性15分钟。向各样品中加入30pl的蒸馏 水。用所获得的cDNA为模板进行RT-PCR。使用/Mx;^"^基因特异性 引物(5，TTCCAGATAAGGTGTGTG AAC3'， SEQIDNO.: 14; 5， ACT GTCTCCACACTC AGC3'， SEQ ID NO.: 15)进行PCR，开始是在95。C 预变性5分钟，然后进行30个以下循环在95'C变性30秒、在58'C退 火30秒、和在72'C延伸1分钟。为了构建内部相等载量对照(internal equal loading control),在与相同的条件下，使用引物tublin-l(5' CAA CTA CCA GCC ACC AAC TGT 3，； SEQ ID NO.: 16)和引物tublin-2(5' CAA GAT CCT CAC GAG CTT CAC 3， ； SEQ ID NO.: 17)进行PCR。如 此制得的PCR产物通过1%琼脂糖凝胶电泳分离。发现第1号和第4号 反义泳道是彻底的敲除,而第3号反义泳道是敲减(knock-down)，降低了 表达水平(图12)。
实施例8:转基因甘薯根部发育的分析
在相同的日期在MS基础培养基中进行/Z^;cp^w/"-反义第1号甘薯 和野生型的切割。在切割10天后，比较在转基因甘薯第1号和野生型之 间的根部发育模式(图13和图14)。可肉眼观察到须根。发现转基因甘 薯第1号的须根比野生型的须根(直径细且长度为5 cm 6 cm)的长度短 (2 cm 3 cm)且直径大2 3倍(图13)。
切割根部的成熟区，在4'C在含有2Q/。多聚甲醛和2.5n/。戊二醛的25mM 磷酸钾缓冲液(pH7.0)中固定10天，使用缓冲液洗两次，依次更换50%、 60%、 70%、 80%、 90%、 95%、和100%的乙醇以去除水分，接着放在容
12纳有己经在一天前进行固化的树脂的囊体(capsule)中，在依次替换树脂与 乙醇的比例为1:3、 1:1、 3:1和1:0的混合物后，再一次向囊体中的固化 树脂上添加未稀释的树脂，之后在58"固化。
树脂硬化后，分别以横向和纵向切割样品，在显微镜下观察根部细 胞的形状。发现与转化体相比，野生型的细胞细而长，相反，与野生型 相比，转化体的细胞短而粗(图14)。另外，在转化体的情况中，在初生 形成层中观察到细胞分化活跃地发生，所以细胞分化在次生形成层中开 始以使贮藏根发育。因此本发明的/6^p"m/w cDNA的反义DNA的表达 可使贮藏根发育的启动提前。
实施例9:转基因甘薯贮藏根发育的分析
在同一天进行转基因甘薯第1号、第4号和野生型甘薯的切割。在 切割5个月后，相互比较它们的地上部(aerial part)和贮藏根的发育模式及 产量(图15和图16)。对于地上部的生长，野生型有数量较少的分枝并且 它的第一分枝很长。另一方面，发现转基因甘薯具有较多的分枝但它的 分枝的长度基本相同，并且其第一分枝比野生型的第一分枝短很多。在 转基因甘薯和野生型甘薯之间的地上部总生物量未显示出差别。在转化 体和野生型之间，贮藏根的发育存在很大差别。在野生型中，它的初生 根中的一部分发育成贮藏根，但在转化体中，它的初生根中的大多数发 育成贮藏根，所以在总贮藏根数量上，转化体比野生型优越(多达2倍)， 并且在总生物量上，转化体也比野生型优越(多达1.5倍)。贮藏根形成 的位置存在差异，即，野生型的初生根生长到5 cm 10 cm的长度，然 后发育成贮藏根，但转化体的初生根在初生根发育的起始点即发育成贮 藏根。
因此，本发明的cDNA的反义DNA可用于生产高产性的 转基因甘薯以有效地增加贮藏根的产量。
虽然己结合了当前认为最实用和优选的实施方式来描述本发明，但 应该理解的是，本发明不限于所公开的实施方式和附图，相反，本发明 拟覆盖在所附权利要求书中的精神和范围之内的各种修改和变化。
权利要求
1.一种增加贮藏根产量的方法，所述方法包括抑制植物的细胞中的扩张蛋白基因的表达。
2. 如权利要求l所述的方法，所述方法还包括向所述植物中引入来 自甘薯扩张蛋白基因/6五x; ^^"的cDNA的反义DNA。
3. 如权利要求l所述的方法，所述方法还包括向二元载体插入所述 扩张蛋白基因的cDNA的反义DNA，并将所述二元载体引入所述植物。
4. 如权利要求2或3所述的方法，其中所述反义DNA包含SEQID NO.:9的核苷酸序列。
5. 如权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述植物是甘薯。
6. —种制备高产性的转基因甘薯的方法，所述方法包括向甘薯中 弓i入甘薯扩张蛋白的cDNA的反义DNA。
7. —条PCR引物，其适合于扩增包含SEQIDNO.:9的核苷酸序列 的DNA片段，所述引物以SEQIDNO,: IO或SEQIDNO.: 11所示的核 苷酸序列中的一条序列表示。
全文摘要
本发明公开了甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA、携带所述反义DNA的植物转化载体、和使用所述反义DNA增加贮藏根产量的方法。使用所述甘薯扩张蛋白cDNA的反义DNA制备的转基因甘薯的贮藏根产量增加到高达1.5倍。因此，所述基因在用于增加生物乙醇产量的高产性的转基因贮藏根的生产中是有用的。
文档编号C12N15/29GK101541966SQ200880000430
公开日2009年9月23日 申请日期2008年3月10日 优先权日2007年3月13日
发明者卢雪娥, 申正燮, 白敬喜, 裵贞明 申请人:高丽大学校产学协力团