专利名称：同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法
技术领域：
本发明涉及用于在能够引起感染的许多可能病原体中鉴别眼睛和中枢系统感染的致病的单种病原体或一种以上病原体的诊断方法。所有影响眼睛或中枢系统的个别区域的病原体一般引起相同的表现或症状。本发明涉及以单一的检验在这组可能的病原体中检测和鉴别该病原体，而不需要借助于一种病原体一种检测的成套检验。本发明致力于基于症状的诊断替代基于个别病原体检测的诊断。
背景技术：
眼睛的感染在临床上可以按照载有感染物及随后被感染影响的解剖学分区分类。有许多的生物体能够引起眼睛感染，它们在“Principles and Practice of Infectious Diseases，6th Edition，GeraldMandell et al(Eds)Elsevier Churchill Livingston，pp 1387-1418(2005)”中有详细描述，其公开内容通过引用并入本文。
眼感染可以基于临床初期诊断分为以下几类 1.外眼感染，如角膜炎和结膜炎 2.感染性眼内炎 3.葡萄膜炎 4.视网膜炎 许多外眼感染由几种细菌和真菌引起。事实上，由于暴露在环境中，结膜和角膜载有许多作为寄生者的非病原性细菌和真菌，这一事实不利于从结膜和角膜刮屑或拭子提取的特定病原体(细菌和真菌)的检测。在存在化脓或有脓液的溃疡的情况下，医生作出细菌感染的临时诊断(provisional dignosis)并用局部使用的广谱抗生素治疗病人。但是，难于诊断却特别可治愈的重要感染有 ●单纯性疱疹(引起角膜炎) ●腺病毒性结膜-角膜炎(有时造成流行性扩散) ●沙眼衣原体(引起导致沙眼的滤泡性结膜炎和成人包涵体性结膜炎) ●水痘结膜炎(也称为带状疱疹结膜炎) ●快速生长的分枝杆菌，如龟分支杆菌(M.chelonae)和偶发分枝杆菌(M.fortuitum)(引起用于减轻屈光异常的LASIK手术后的感染) 感染性眼内炎可能通常由以下病原体引起 ●革兰氏阳性细菌 ●革兰氏阴性细菌 ●厌气生物体，即痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes) ●真菌。
非常常见的是感染在手术后发生且蔓延非常快，导致失明。治疗需要的最重要的信息是，病原体是细菌还是真菌，而如果是细菌，它是需氧的还是厌氧的。由血源性传播引起的内源性感染是很少见的。
葡萄膜炎通常由以下病原体引起 ●结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis) ●龟分支杆菌(M.chelonae) ●偶发分枝杆菌(M.fortuitum) ●鼠弓形体(Toxoplasma gondii)。
视网膜炎一般在免疫抑制个体中见到，且由以下病原体引起 ●巨细胞病毒 ●单纯疱疹病毒 ●水痘带状疱疹病毒 严重的视力损失在所有这些病人中发生，因而早期和及时的对这些生物体的诊断对于防止整个眼球的失明很是重要的。这些感染的实际发生率在发展中国家可能相对较高。许多诊断技术是如在现有技术部分详细说明的用于眼睛感染的诊断。
中枢神经系统感染可以分为以下几类 急性化脓性脑膜炎一般在儿童中发现，且由以下所列的生物体引起 ●流感嗜血杆菌(Haemophilus influenza) ●脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitides)和 ●肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae) 脑脊液(CSF)的细菌培养或涂片镜检缺乏灵敏度。额外的复杂因素是，先前用抗生素对病人进行治疗可能导致CSF的革兰氏染色和培养两项的假阴性结果。由于这些原因，医生们不太愿意信任培养结果而倾向于完成一个静脉注射抗生素的10-14天完整疗程，这在大多数情况下是不必要的。一旦部分地进行了治疗，这些情况就不能与由下面的病原体引起的慢性脑膜炎区分开了 ●结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis) ●各种真菌 ●由一系列可通过治疗控制的病毒-如HSV、CMV和VZV-引起的病毒性脑炎。
脑炎通常由各种各样的病毒(地方性的和流行性的都有)引起。但是，单纯疱疹、巨细胞病毒和水痘带状疱疹是具有特定的抗病毒疗法的病毒。其它的可治疗脑炎病原体是鼠弓形体(Toxoplasma gondii)。现有技术 检测临床样本中的病原体(细菌、酵母和其它真菌、寄生虫和病毒)的经典方法包括培养该样本以扩大所存在病原体的数目，直到可观察的菌落生长，然后该菌落生长可以通过标准的实验室检验鉴定和计数。在需要的时候，所述培养也可以进行附加的检验以确定病原体对药物治疗的敏感性。为了准确地鉴定感染种类，医生必须依赖于可能需要从3天(如在大多数细菌的情况下，包括快速生长的分枝杆菌)到8周(如在结核杆菌的情况下)之间的任何长度的时间的培养结果。为了准确地鉴别细菌的种类，该培养随后进行可能需要另外数天甚至数周时间的大范围生物化学检验。大多数情况下，由于疾病的严重程度和即时的药物干预的必要性，使这一确定过程快速完成是重要的。这里所指的培养技术在细菌感染和真菌感染的诊断中多半是有用的，而它们一般不用于病毒感染情况下的诊断，特别是因为通过培养从临床样本中分离病毒的频率小于15％。
用于诊断感染(如眼睛感染和神经系统感染)的适当的样本是检测某症状(如角膜结膜炎、眼内炎、葡萄膜炎、脑膜炎和脑炎)的发病原因进行成功诊断的另一个关键问题。在这些情况下，感染是高度局部化的，而因此局限于眼睛或CNS。体液，如血液、血浆或血清，不包含感染物。外眼感染需要如角膜刮屑或结膜拭子的样本，而感染性眼内炎需要或者在眼科诊所进行玻璃体吸出或者更好是玻璃体切除的样本，在这样情况下，在手术室中取出20ml汉克平衡盐溶液的玻璃体洗液。简单的玻璃体吸出物经常不足以通过涂片检查和培养诊断真菌和细菌性眼内炎。在葡萄膜炎和视网膜炎两种情况下，较好的样本是收集在27号针中的0.2-0.3mL玻璃体液。用于诊断中枢神经系统感染的最好的生物液体是脑脊液。在本发明的一种实施方式中，在眼内炎的情况下房水或玻璃体液足以检测和鉴别感染物。这消除了在手术室中进行手术步骤(如玻璃体切除)的必要性。
基于DNA的鉴别病原体的方法提供了对费时和需要具有专门训练和技术的人员的经典方法的简单、稳定和可靠的替代方案。在进行经典方法时，有可能会产生错误，这些错误有时导致对病原体的不明确的鉴定，而因此导致错误的诊断/治疗。另一方面，基于DNA的病原体鉴别具有在早得多的阶段鉴定病原体的优势，有时比观察到临床症状还早(亚临床阶段)。一旦条件被标准化，病原体的鉴别是十分简单可靠的，且能够由半熟练人员完成。基于DNA的方法也可以用于评价医疗干预的结果(预后价值)。采用基于DNA的方法(如PCR)筛查人的病原体的临床样本提供了灵敏和确定的诊断和有效治疗的开始，甚至对于每个样本包含非常少(大约20-50)病原生物体的小量的临床样本(房水、玻璃体液、泪水、唾液、血液、脑脊液、粘膜或上皮刮屑，如角膜刮屑、结膜拭子、组织样本等)也是如此。
采用聚合酶链反应(PCR)技术的潜在利益是在相对短的时期内鉴定特定的细菌或病毒病原体。可行的基于PCR的检测具有在病人仍在急救室中时就帮助医生决定如何开始治疗的能力。由于基于PCR的检测方法不依赖于活的生物体的存在，而是依赖于遗传物质，基于PCR的技术可应用于所有患者的情况，甚至在提取收集临床样本前使用了抗生素的时候也是如此。但是，基于PCR的方法还有一些困难，如由于污染的核酸产生的假阳性结果和由于复杂试样导致的PCR反应的抑制。下面的PCR检测已被用于引起眼睛和CNS感染的生物体。
单纯疱疹1 & 2HSV的基于PCR的DNA检测已显示具有比病毒培养高4-5倍的灵敏度，并且对转运状态(transport condition)不敏感，如Waid A.，et al.“Polymerase chain reaction for detection of Herpessimplex virus(HSV)on mucosal surfaceComparison with HSV isolationin cell culture”.J.Inf.Dis.1881345-1351(2003)中所述。PCR已用于检测眼睛样本(如房水、角膜刮屑、晶状体吸出物、晶状体袋囊材料和玻璃体液)和其它临床样本(如CSF、生殖道拭子和子宫颈拭子)中的HSV(Madhavan HN et al.“Detection of herpes simplex virus(HSV)using polymerase chain reaction(PCR)in clinical samplesComparisonof PCR with standard laboratory methods for the detection of HSV”.J.Clin.Virol.14145-15(1999))。这里，PCR能够在一个临床样本中检测1-3个HSV颗粒。PCR也有效地用于鉴别疱疹病毒血清型，如发明人之一在公开的文章中所提到的，通过结合PCR和扩增子的限制性长度多态性(Madhavan HN et al.“Phenotypic and Genotypicmethods for the detection of herpes simplex virus serotypes”.J.Virol.Methods，10897-102(2003))，其公开内容通过引用并入本文。
水痘带状疱疹病毒PCR已用于检测水痘感染(Burke DG，et al.“Polymerase chain reaction detection and clinical significance ofvaricella zoster in cerebrospinal fluid in human immunodeficiency virusinfected patients”.J.Inf.Dis，1761080(1996))。中枢神经系统中HSV和VZV两者的检测也通过使用PCR实现(Sauerbrei A and Wutzler P.“Laboratory diagnosis of central nervous system infection caused byherpes viruses”.J.Clin.Virol，25s45-s51，(2002))，作者从中得出结论，PCR是检测VZV的黄金标准，其公开内容通过引用并入本文。
巨细胞病毒A可商购的称作COBAS Amplicor CMV Monitor ofRoche Molecular diagnostics(Pleasanton，CA，USA)的PCR检验试剂盒利用CMV的DNA聚合酶基因的365碱基对区域进行扩增检测。许多检测方法利用早期速发抗原和DNA聚合酶的基因以检测CMV在各种体液中的存在(Stanier P，et al.“Detection of humancytomegalovirus in peripheral mononuclear cells and urine samples usingPCR”.Mol.Cell Probes，651-58(1992)and Gerna G，et al.“Monitoringhuman cytomegalovirus infection and gancyclovir treatment in hearttransplant recipients by determination of viraemia，antigenemia andDNAemia”.J.Inf.Dis.，164，488-498(1991)，其公开内容通过引用并入本文)。患者的CMV感染也通过各种不同样本(如血液、羊水、鼻吸出物、支气管肺泡灌洗液、尿、胎盘材料和支气管吸出物)的巢式PCR(nested PCR)检测。
由所有三种疱疹病毒(HSV、VZV和CMV)引起的眼睛感染通过如发明人之一在公开的文章(Priya K et al.“Association of herpesviruses in aqueous humour of patients with serpigenous choroiditisapolymerase chain reaction based study”.Ocular Immunology andInflammation 91-9(2003)，其公开内容通过引用并入本文)中所描述的PCR方法检测。在该研究中，为了获得必要的灵敏度，进行巢式PCR以检测VZV。但是，由于第一轮扩增的产物必须被转移到包含第二组引物(用于扩增第一轮PCR扩增基因中更小区域)的第二PCR管中，巢式PCR具有在实验室中引入扩增子污染的伴生问题。
通过PCR检测结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)是两个FDA批准的检验的方案(参见The Amplified Mycobacterium tuberculosisDirect test Gen-Probe，San Deigo，USA and Amplicor M.tuberculosistest of Roche Diagnostic Systems，Basel，Switzerland)。现有技术中已知有许多其它的检验方法。但是，有人用PCR检测了眼结核(MadhavanHN et al.“Polymerase chain reaction for detection of Mycobacteriumtuberculosis in epiretinal membrane in Eales’”.Disease.Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.41822-825(2000))。
通过核酸扩增检测沙眼衣原体已经在临床检验中采用，并且该方法在Black CM，“Current methods of laboratory diagnosis of Chlamydiatrachomatis infection”.Clin.Microbiol.Rev.10160-184(1997)中有详细描述。衣原体性结膜炎采用PCR对结膜拭子进行检测，且少至30个生物体在临床样本中被检测出来，如Malathi.Jet al.“A hospitalbased study on prevalence of conjunctivitis due to Chlamydiatrachomatis”.Ind.J.Med.Res.，11771-75(2003)中所详细描述的。
腺病毒结膜炎如前所述通过结膜拭子的巢式PCR进行诊断(Dalapathy S et al.“Development and use of nested polymerase chainreaction(PCR)for the detection of Adenoviruses from conjunctivitisspecimen”.J.Clin.Virol.1177-84(1998))。
鼠弓形体在具有免疫缺陷的病人中引起严重的脑炎和葡萄膜炎。许多PCR检验方案已被用于研究各种体液和组织，且所有PCR检验依赖于B1基因的扩增(Danise A，et al.“Use of polymerase chainreaction assays of aqueous humor in diagnosis of in the differentialdiagnosis of retinitis in patients infected with human immunodeficiencyvirus”.Clin.Infect.Dis 241100-1106(1997)，Montoyo.et al.“Use ofpolymerase chain reaction in diagnosis of ocular toxoplasmosis.Ophthalmology”，1061554-1563(1999))。
如Anand AR et al.“Use of polymerase chain reaction(PCR)andDNA probe hybridization to determine the gram reaction of theinteracting bacterium in the intraocular fluids of patients withendophthalmitis”.J.Infection，41221-226(2000)中详细公开的，由眼睛的术后感染导致的感染性眼内炎采用真细菌基因的PCR反应和通过区分革兰氏阳性和革兰氏阴性的探针进行了研究。该研究能够检测临床样本中的低至6个的细菌。由厌氧生物(如痤疮丙酸杆菌)引起的眼睛感染如Therese KL et al.“Polymerase chain reaction in thediagnosis of bacterial endophthalmitis”，Brit.J.Opthal.821078-1082(1998)中详细描述的采用PCR快速检测。如Anand AR et al.“Polymerase chain reaction in the diagnosis of Asperigillusendophthalmitis”.Ind.J.Med.Res.114133-140(2001)and Anand ARet al.“Use of polymerase chain reaction in fungal endophthalmitis”.Ophthalmology 108326-330(2001)中详细描述的，真菌性眼内炎也可以采用PCR快速诊断。在这两项研究中，约0.4pgs的真菌DNA能被检测到。
这里描述的各种PCR检验采用了不同的反应热循环，因为在各个PCR中引物组和被检测的基因是不同的。另外，上述各PCR的试剂浓度经过了调整，为了达到对于这里描述的该组反应物的最高灵敏度而优化PCR。最佳的反应条件根据待扩增核苷酸链的序列、其大小和待检测的生物体或病原体的整个靶DNA的复杂性而变化。
但是，还需要一种能够在引起眼睛和中枢神经系统的细菌性、真菌性、寄生性和病毒性感染的病原体之间同时进行检测和鉴别的基于PCR的检验方法，它除了快速之外，不易于污染，且具有超过其它方法的增强的灵敏度和特异性。该方法易于在临床环境中使用，其中在24-48小时内进行感染物的鉴定对于挽救生命是重要的。准确诊断眼睛和脑感染的关键问题可以归纳为 ●眼睛和脑的感染是高度局部化的。在容易获得的生物液体-如血液、血清、血浆、唾液或者外部伤口或溃疡的脓液或脓性排出物-中没有病原体的痕迹。
●任何急性感染的公认的生物标志，如C反应蛋白，对于所有影响人体的感染是普遍的和共有的。因此是非特异的。
●为鉴定特定的病原体，需要来自眼睛或CSF的样本。所获得的样本对于角膜感染是角膜刮屑，对于结膜炎是结膜拭子，对于眼内炎是房水，对于葡萄膜炎和视网膜炎是玻璃体液。在脑感染的情况下，优选的样本始终是CSF。所有这些样本中，都存在着通过单次取样从病人获得的样本的量的限制。一般，你在角膜刮屑或拭子中取得数千个细胞及可能两到三毫克的样本。任何时候可能从病人的眼睛取得的房水大约为100μL，而玻璃体切除样本最多可达200μL。可以取得最多5ml的CSF样本，但PCR需要的CSF样本的体积小于0.5ml。
●样本体积的限制导致存在于样本中的细菌/病毒/寄生虫的数目受到限制。另外，感染物的量同样低于在许多其它体室(bodycompartment)如血液中观察到的量。
●存在于样本中的感染粒子的总数与检测的成功直接相关。低于临界质量，感染物细菌和真菌不能在培养基中生长，因此难于诊断。存在于眼样本中的病毒颗粒的数目通常低于荧光抗体检测实验及病毒培养的检测限，因此使检测灵敏度低于25％。现有没有用于寄生虫如鼠弓形体(Toxoplasma gondii)的方便的检测系统，且寄生虫的数目对于检测来说也太少。如对于HSV、CMV、VZV、腺病毒、衣原体和弓形体的IgM或IgG检测是非常非特异性的，因而没有诊断意义。
●诊断中的另一个主要困难是所有上面描述的眼睛疾患都是急性的，且需要即时和准确的诊断以指导适当的治疗。由病毒感染引起的感染性眼内炎和坏死性视网膜炎需要在首个症状出现的96小时内进行治疗，在这种情况下延迟超过48小时将导致失明。
多重PCR也已被用于既定情形下的某些病原体，且通过用质谱确定分子量来鉴定扩增产物。详细描述见Detection and identificationof pathogens by mass spectrometric determination of the basecomposition of PCR products.(Ecker，David J.Griffey Richard 11.Sampath，Rangarajan；Hofstandler，Steven A.Meneil，John；Crooke，Sstanley T.(USA).美国专利申请公开U.S.Pat.Appl.Publ.(2004)，168页，美国申请号323,233的部分继续申请。专利申请US 2003-66012220030911.优先权US 2001-79800720010302；US 2002-43131920021206；US 2002-323233 20021218；US 2002-326051 20021218；US2002-325526 20021218；US 2002-325527 20021218；US 2003-44344320030129；US 2003-443788 20030130；US 2003-447529 20030214)。
多重PCR之后进行鉴定产物的凝胶电泳被试图用于中枢神经系统的感染，如Read，SJ.and Kurtz，JB.“Laboratory diagnosis of commonviral infections of the central nervous system by using a single multiplexPCR screening assay”.J.Clin.Microbiol.371352-1355(1999)中所述。
多重PCR之后进行用于检测病原体的微阵列据报道用于引起呼吸道疾病的病原体的检测(Wang D et al.“Microarray based detectionand genotyping of viral pathogens”.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 9915687-15692(2002))。扩增子的检测也试图采用比色微滴定板分析系统，其中扩增子用洋地黄毒苷11-dUTP标记，且生物素化的探针被用于捕获滴定板上的扩增子。该产物采用酶标记的抗地高辛展现(Smalling TW et al.“Molecular approaches to detecting herpes simplexvirus and enteroviruses in the central nervous system”.J.Clin.Microbiol.402317-2322(2002))。
如Madhavan HN et al.，“Development and application of a novelmultiplex polymerase chain reaction for semiquantitation of humancytomegalovirus in clinical specimen”，J Virol Methods.141166-72(2007)中所详细描述的，对于同一生物体的三个不同基因，即巨细胞病毒的形态转化区II、UL83和糖蛋白O基因，成功地尝试了多重PCR分析，以定量临床样本中的病毒。
在扩增所有19个高危险基因型的L1区后，线性探针分析也被用于检测和鉴别乳头瘤病毒的基因型(Bauer HM et al.“Detection ofhuman papilloma viruses by polymerase chain reaction”US Patent No5639871)。
如质谱这样的方法即使在先进的三级医护中心也不是切实可行的，而基于昂贵的扫描仪的微阵列检测在临床环境下是不可能提供的。线性探针分析易发生扩增子污染。
I.定义 “核苷酸”意指DNA或RNA的结构单元，由一个碱基、一个磷酸分子和一个糖分子(DNA中为脱氧核糖，RNA中为核糖)组成。
“寡核苷酸”意指核苷酸的短链。寡核苷酸经常用作发现DNA或RNA的匹配序列的探针，且可用各种标记物进行标记，如放射性同位素及荧光和化学发光基团。
“引物”意指与DNA的特定靶序列互补的寡核苷酸短链，其用于起动DNA合成。
“单重(uniplex)”意指在扩增单个病原体特异的DNA序列的各反应中利用单组引物的基于PCR的分析。
“多重”意指在单反应中利用多个引物组的基于PCR的分析，其中每个引物可以扩增单个病原体特异的DNA序列。
术语“探针”指的是由靶DNA的PCR扩增产生的DNA产物(扩增子)。
术语“靶”指的是对于某个病原体特异性的DNA序列，其固定在惰性基质如尼龙上。
“杂交”指的是将两条互补的DNA链结合以形成双链分子的过程，在这里更具体地指“探针”和“靶”DNA序列之间的过程。
这里所用的术语“检测系统”指的是使PCR扩增的DNA产物可视化的方法。合适的检测系统的例子包括依赖于色彩、放射性、荧光或化学发光的系统。
“泛真菌的”意指在所有病原性真菌-如隐球菌、假丝酵母、毛霉菌、曲霉菌和根霉菌等-中发现的共有基因序列，且被用于鉴别任何/所有的真菌种类。
发明内容
本发明提供一系列化学标记的病原体特异性的正向和反向引物，其被独一地设计为在95℃的变性温度、58-65℃的退火温度和在72℃延伸的多重聚合酶链反应中特异地扩增来自病原体的靶序列。本发明还提供一系列源自病原体特异性基因的靶DNA序列，其被固定在惰性载体上并特异地与使用病原体特异性正向和反向PCR引物获得的PCR扩增产物杂交。
本发明提供同时检测引起眼睛和中枢神经系统感染的病原体的快速分析方法，对于这些病原体，免疫学的参数并不显示出活动的感染而仅表现为暴露于病原体，且对于这些病原体，经典的微生物学分析如细菌和真菌培养，既不足够灵敏以检测到病原体，也不足够快速以在48小时内鉴定出病原体。
本发明结合了PCR分析的高灵敏性和通过杂交到宏阵列上用色彩检测方法检测杂交的鉴别方法的高特异性，其最终结果可以通过肉眼监测。但是，如Quantum Dots、Cy3、Cy5和FITC的荧光标记也可使用，且产物可以通过荧光显微镜观察到。
本发明的特征是同时检测和鉴别引起眼睛和CNS感染的病原体的多重分析，包括 i)对来自怀疑患有眼睛或CNS感染的病人的临床样本(如角膜刮屑或结膜拭子或房水或玻璃体液或收集的玻璃体切除洗液或脑脊液吸出物或从脑脓肿材料收集的脓液或视网膜前膜)进行处理以通过标准方法分离DNA。
ii)使用已知引起CNS和眼睛感染的各病原体的标记的扩增引物通过单管PCR技术扩增各病原体特异性的基因的特定DNA区域。
iii)利用DNA杂交检测和鉴别病原体，其中各病原体特异性的固定化的靶序列与由PCR反应产生的扩增的DNA探针反应，并且通过利用特定的试剂组的显色监测杂交。
具体实施例方式 适用于眼睛感染患者临床样本病原体DNA多重PCR的独特PCR引物设计。
下面来自各种已知引起眼睛感染的病原体的基因是基于文献中的已知信息选择的。
1.单纯疱疹病毒1&2糖蛋白D 2.单纯疱疹病毒1&2UL 44基因 3.单纯疱疹病毒1&2DNA聚合酶基因 4.巨细胞病毒糖蛋白O基因 5.巨细胞病毒形态转化基因 6.巨细胞病毒UL 88基因 7.水痘带状疱疹ORF 29 8.水痘带状疱疹DNA聚合酶基因 9.腺病毒六邻体(Hexon)基因 10.真细菌16s核糖体RNA基因I 11.真细菌16s核糖体RNA基因区II 12.16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分 13.结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)MPB 64基因 14.偶发分枝杆菌(Mycobacterium fortuitum)16s-23s RNA基因 15.龟分枝杆菌(Mycobacterium chelonei)16s-23s RNA基因 16.鼠弓形体(Toxoplasma gondii)B1基因 17.沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)多态蛋白(polymorphicprotein)II 18.28s核糖体RNA基因的真菌特异性部分 19.16s-23s核糖体RNA基因的痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)特异性部分 20.gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分 21.革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因 22.革兰氏阴性核糖核酸酶1基因 为进一步提高检测某些生物体(如单纯疱疹1和2、巨细胞病毒、水痘带状疱疹和革兰氏阴性细菌)的可靠性，选择扩增各生物体的一种以上的基因。在单纯疱疹1和2和巨细胞病毒的情况中，选择各生物体的三种不同基因，而对于水痘带状疱疹，选择两种基因。
疱疹病毒的DNA聚合酶基因是一种赋予PCR灵敏性的基因，且被用于许多研究中。在第一个研究中，179bp产物使用95℃变性45秒、64℃退火45秒和72℃延伸45秒的热循环条件进行扩增(Madhavan HN et al，Detection of herpes simplex virus(HSV)usingpolymerase chain reaction(PCR)in clinical samples Comparison of PCRwith standard laboratory methods for the detection of HSV，J.Clin.Virol.14145-151(1999))。而在另一个研究中，相同基因的469和391bp区域使用不同的引物组和热循环条件(95℃变性45秒、60℃退火45秒和72℃延伸45秒)进行扩增(Madhavan HN et al，Phenotypic andGenotypic methods for the detection of herpes simplex virus serotypes.J.Virol.Methods，10897-102.(2003))。总之在检测不同病毒时，使用不同的热条件，如在用于鉴定眼睛感染的HSV、CMV和VZV的PCR的情况中(Priya K et al，Association of herpes viruses in aqueoushumour of patients with serpigenous choroiditisa polymerase chainreaction based study，Ocular Immunology and Inflammation 91-9(2003))。在这一研究中，反应条件和引物浓度对于不同病毒是不同的。因此很明显，难于设计出用于一系列已知病原体的引物和特异性靶序列以能够实现使快速检测和鉴别给定的临床样本中的一种或多种病原体的单管多重PCR反应。
因此，考虑有必要探索使用已知生物信息学方法设计合适的PCR引物和与PCR扩增产物互补的靶DNA序列的可能性。
为达到这一目的，本发明首先确定下面的优先用于进行HSV、CMV和VZV的检测的多重PCR反应的条件，即在95℃变性、随后在58℃-65℃退火，然后在72℃延伸。如此获得的PCR扩增产物与固定在固相基质上的各病原体特异性的靶DNA序列的最佳杂交温度确定在48℃到55℃。因此考虑有必要设计所研究的各病原体的靶DNA序列组，从而特异性的PCR扩增产物在统一温度下与其互补靶DNA序列杂交，而不产生DNA序列的非特异性的结合。
在设计多重PCR反应的引物中最困难的部分是设计成所有引物具有相同的解链温度，从而使所有基因在相同的热循环温度下扩增成为可能。
用于扩增的这些引物组从上面提到的基因序列中选择以使所有的引物具有58-65℃范围内的退火温度，从而所有23个基因可以在同一个管中利用PCR扩增，其总是代表所研究的特定病原体的所有种株或基因型。
不同大小的扩增子可能干扰PCR方法的多重扩增的效率。因此选择引物的第二个标准确定为扩增子在66-90核苷酸范围内的均匀大小。对上节中提到的所有基因选择包含66-90bp长度的区域(包括引物序列)。
为保持解链温度均一，引物长度在17-29碱基对之间变化。
另外，在多重反应中，由于存在互补区域导致引物中成环或交叉杂交可能干扰PCR扩增本身。为避免所有这种复杂情况，所有引物被仔细地设计以消除它们自身之间的成环或引物的交叉杂交。也注意避免引物组的任何非特异性的(交叉的)扩增，即一种生物体/基因的引物不应该与反应混合物中任何其它生物体/基因的基因反应。
所有引物被设计为它们一般匹配病原体基因的所有核苷酸碱基。但是，如果在某些株或物种中存在错配，如在设计扩增革兰氏阳性、革兰氏阴性细菌和真菌的引物的情况中，错配限制为引物中间的最多两个核苷酸。各引物的3’端确保在诊断的物种的所有株中总是具有完全的匹配。
所描述的标准之外，这里引用现有技术中用于选择引物序列的一般标准，在Molecular cloningA laboratory manual，Vol 2，Sambrook.J，Russell DW(Eds)Cold Spring Harbor Laboratory Press NY(2001)中对此有详细说明。这些标准是，3’端为G或C，避免串列的GC重复和一般任何引物不以T终止等。
设计后，利用所列的所有病原体的标准DNA序列(基因)，引物被个别地和以复合的形式使用以检验灵敏性和特异性。在识别一些生物体或病毒颗粒中，当灵敏性达不到现有技术中报道的水平的时候，采用相同的标准选择了不同的引物组，所述现有技术例如有Madhavan HN，et al，Detection of herpes simplex virus(HSV)usingpolymerase chain reaction(PCR)in clinical samples Comparison of PCRwith standard laboratory methods for the detection of HSV，J.Clin.Virol.14145-151(1999)；Malathi.Jet al.A hospital based study on prevalenceof conjunctivitis due to Chlamydia trachomatis Ind.J.Medical research，11771-75(2003)；Anand ARet al Use of polymerase chain reaction(PCR)and DNA probe hybridization to determine the gram reaction of theinteracting bacterium in the intraocular fluids of patients withendophthalmitis.Journal of Infection，41221-226(2000)；Anand AR et al.Use of polymerase Chain reaction in fungal endophthalmitisOphthalmology 108326-330(2001)。即使某些引物在58℃退火，也在实验上确保所有的引物在60℃产生良好的扩增。
在本实施方式中，经过仔细的评价，选择了下面这些独特引物并用于病原体的检测和鉴别。这些序列是独特的和现有技术中未知的。
1.通过包括SEQ ID No.1和2(FP5′cgcttggtttcggatgggag 3′(SEQID No.1)和RP5′gcccccagagacttgttgtagg 3′(SEQ ID No.2))的引物组1扩增单纯疱疹病毒1和2糖蛋白D基因 2.通过包括SEQ ID No.3和4(FP5′ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3′(SEQ ID No.3)和RP5′cgggggggtcttgcgttac 3′(SEQ ID No.4))的引物组2扩增单纯疱疹病毒1和2 UL 44基因 3.通过包括SEQ ID No.5和6(FP5′caagctgacggacatttacaagg3′(SEQ ID No.5)和RP5′gtcccacacgcgaaacacg 3′(SEQ ID No.6))的引物组3扩增单纯疱疹病毒1和2DNA聚合酶基因 4.通过包括SEQ ID No.7和8(FP5′ttccggctcatggcgttaacc 3′(SEQID No.7)和RP5′cgccctgcttttacgttacgc 3′(SEQ ID No.8))的引物组4扩增巨细胞病毒糖蛋白O基因 5.通过包括SEQ ID No.9和10(FP5′cggcgacgacgacgataaag3′(SEQ ID No.9)和RP5′caatctggtcgcgtaatcctctg 3′(SEQ ID No.10))的引物组5扩增巨细胞病毒形态转化基因 6.通过包括SEQ ID No.11和12(FP5′gggcacgtcctcgcagaag3′(SEQ ID No.11)和RP5′ccaagatgcaggtgataggtgac 3’(SEQ ID No.12))的引物组6扩增巨细胞病毒UL 88基因 7.通过包括SEQ ID No.13和14(FP5′ggtcttgccggagctggtattac3′(SEQ ID No.13)和RP5′tgcctccgtgaaagacaaagaca 3′(SEQ ID No.14))的引物组7扩增水痘带状疱疹ORF 29 8.通过包括SEQ ID No.15和16(FP5′tccatttaacgttgcatcattttgtg3′(SEQ ID No.15)和RP5′acgttccggtagcgagttatctg 3′(SEQ ID No.16))的引物组8扩增水痘带状疱疹DNA聚合酶基因 9.通过包括SEQ ID No.17和18(FP5′cgccgccaacatgctctacc3′(SEQ ID No.17)和RP5′gttgcgggaggggatggata 3′(SEQ ID No.18))的引物组9扩增腺病毒六邻体基因 10.通过包括SEQ ID No.19和20(FP5′tgggctacacacgtgctacaatgg3′(SEQ ID No.19)和RP5′cggactacgatcggttttgtgaga 3′(SEQ ID No.20))的引物组10扩增真细菌16s核糖体RNA基因区I 11.通过包括SEQ ID No.21和22(FP5′ggcctaacacatgcaagtcgagc3′(SEQ ID No.21)和RP5′ggcagattcctaggcattactcacc 3′(SEQ ID No.22))的引物组11扩增真细菌16s核糖体RNA基因区II 12.通过包括SEQ ID No.23和24(FP5′acgtcaaatcatcatgcccccttat3′(SEQ ID No.23)和RP5′tgcagccctttgtaccgtccat 3′(SEQ ID No.24))的引物组12扩增16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分 13.通过包括SEQ ID No.25和26(FP5′gcggaacgtgggaccaatac3′(SEQ ID No.25)和RP5′cgacggggtgattttcttcttc 3’(SEQ ID No.26))的引物组13扩增结核杆菌MPB 64基因 14.通过包括SEQ ID No.27和28(FP5′aacttttttgactgccagacacactattg 3′(SEQ ID No.27)和RP5’ggatgccaccccccaaaag 3′(SEQ ID No.28))的引物组14扩增偶发分枝杆菌16s-23s RNA基因 15.通过包括SEQ ID No.29和30(FP5′tggttactcgcttggtgaatatgt3′(SEQ ID No.29)和RP5′gacgttttgccgactacctatcc 3′(SEQ ID No.30))的引物组15扩增龟分枝杆菌16s-23s RNA基因 16.通过包括SEQ ID No.31和32(FP5′cccctctgctggcgaaaagtg 3′(SEQ ID No.31)和RP5′ggcgaccaatctgcgaatacac 3′(SEQ ID No.32))的引物组17扩增鼠弓形体B1基因 17.通过包括SEQ ID No.33和34(FP5′aatcgtatctcgggttaatgttgc3′(SEQ ID No.33)和RP5′tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3′(SEQ ID No.34))的引物组18扩增沙眼衣原体多态蛋白II 18.通过包括SEQ ID No.35和36(FP5′gctgggactgaggactgcgac3′(SEQ ID No.35)和RP5′ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36))的引物组19扩增28s核糖体RNA基因的真菌特异性部分 19.通过包括SEQ ID No.37和38(FP5′tggcgaacgggtgagtaaca 3′(SEQ ID No.37)和RP5′ccggtattagccccagtttcc 3′(SEQ ID No.38))的引物组20扩增16s-23s核糖体RNA基因的痤疮丙酸杆菌特异性部分 20.通过包括SEQ ID No.39和40(FP5′cggcggcaagttcgacgac 3′(SEQ ID No.39)和RP5′ccaccgagacgcccacacc 3′(SEQ ID No.40))的引物组21扩增gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分 21.通过包括SEQ ID No.41和42(FP5′ccaggtcggcggagaagc 3′(SEQ ID No.41)和RP5′ccaccggcccgatgacc 3′(SEQ ID No.42))的引物组22扩增革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因 22.通过包括SEQ ID No.43和44(FP5′gccgccctgaccaccttc 3′(SEQ ID No.43)和RP5′gcgggttgttcggcatcag 3′(SEQ ID No.44))的引物组23扩增革兰氏阴性核糖核酸酶1基因 在本发明的另一实施方式中，具有SEQ ID No.45-67的探针序列通过用于设计识别所述病原体独有的特定基因片段的引物的计算机程序获得。探针序列的长度在66-90核苷酸之间变化。探针自身内不形成发夹环。它们与任何其它扩增子不共有同源性。探针可以从病原体DNA两条链的任一条链扩增。
探针序列详述如下 1.单纯疱疹病毒1和2糖蛋白D基因的探针DNA序列“cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No.45)(通过包括FP5′cgcttggtttcggatgggag 3′(SEQ ID No.1)和RP5′gcccccagagacttgttgtagg3′(SEQ ID No.2)的引物组1扩增) 2.单纯疱疹病毒1和2UL 44基因的探针DNA序列“ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQ ID No.46)(通过包括FP5′ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3′(SEQID No.3)和RP5′cgggggggtcttgcgttac 3′(SEQ ID No.4)的引物组2扩增) 3.单纯疱疹病毒1和2DNA聚合酶基因的探针DNA序列“caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No.47)(通过包括FP5′caagctgacggacatttacaagg 3′(SEQ ID No.5)和RP5′gtcccacacgcgaaacacg3′(SEQ ID No.6)的引物组3扩增) 4.巨细胞病毒糖蛋白O基因的探针DNA序列“ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No.48)(通过包括FP5′ttccggctcatggcgttaacc 3′(SEQ IDNo.7)和RP5′cgccctgcttttacgttacgc 3′(SEQ ID No.8)的引物组4扩增) 5.巨细胞病毒形态转化区II基因的探针DNA序列“cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”(SEQ ID No.49)(通过包括FP5′cggcgacgacgacgataaag 3′(SEQ ID No.9)和RP5′caatctggtcgcgtaatcctctg 3′(SEQ ID No.10)的引物组5扩增) 6.巨细胞病毒UL 88基因的探针DNA序列“gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”(SEQ ID No.50)(通过包括FP5′gggcacgtcctcgcagaag 3′(SEQ IDNo.11)和RP5′ccaagatgcaggtgataggtgac 3’(SEQ ID No.12)的引物组6扩增) 7.水痘带状疱疹ORF 29的探针DNA序列“ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No.51)(通过包括FP5′ggtcttgccggagctggtattac3′(SEQ ID No.13)和RP5′tgcctccgtgaaagacaaagaca 3′(SEQ ID No.14)的引物组7扩增) 8.水痘带状疱疹DNA聚合酶基因的探针DNA序列“tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No.52)(通过包括FP5′tccatttaacgttgcatcattttgtg 3′(SEQ ID No.15)和RP5′acgttccggtagcgagttatctg 3′(SEQ ID No.16)的引物组8扩增) 9.腺病毒六邻体基因的探针DNA 序列“cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”(SEQ ID No.53)(通过包括FP5′cgccgccaacatgctctacc 3′(SEQ IDNo.17)和RP5′gttgcgggaggggatggata 3′(SEQ ID No.18)的引物组9扩增) 10.真细菌16s核糖体RNA基因区I的探针DNA序列“tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No.54)(通过包括FP5′tgggctacacacgtgctacaatgg 3′(SEQ ID No.19)和RP5′cggactacgatcggttttgtgaga 3′(SEQ ID No.20)的引物组10扩增) 11.真细菌16s核糖体RNA基因区II的探针DNA序列“ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SEQ ID No.55)(通过包括FP5′ggcctaacacatgcaagtcgagc 3′(SEQ ID No.21)和RP5′ggcagattcctaggcattactcacc 3′(SEQ ID No.22)的引物组11扩增) 12.16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分的探针DNA序列“acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”(SEQ ID No.56)(通过包括FP5′acgtcaaatcatcatgcccccttat 3′(SEQ ID No.23)和RP5′tgcagccctttgtaccgtccat 3′(SEQ ID No.24)的引物组12扩增) 13.结核杆菌MPB 64基因的探针DNA序列“gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No.57)(通过包括FP5′gcggaacgtgggaccaatac 3′(SEQ ID No.25)和RP5′cgacggggtgattttcttcttc3’(SEQ ID No.26)的引物组13扩增) 14.偶发分枝杆菌16s-23s RNA基因的探针DNA序列“aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No.58)(通过包括FP5′aacttttttgactgccagacacactattg3′(SEQ ID No.27)和RP5’ggatgccaccccccaaaag 3′(SEQ ID No.28)的引物组14扩增) 15.龟分枝杆菌16s-23s RNA基因的探针DNA序列“tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No.59)(通过包括FP5′tggttactcgcttggtgaatatgt 3′(SEQ IDNo.29)和RP5′gacgttttgccgactacctatcc 3′(SEQ ID No.30)的引物组15扩增) 16.鼠弓形体B1基因的探针DNA序列“cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”(SEQ ID No.60)(通过包括FP5′cccctctgctggcgaaaagtg 3′(SEQ IDNo.31)和RP5′ggcgaccaatctgcgaatacac 3′(SEQ ID No.32)的引物组16扩增) 17.沙眼衣原体多态蛋白II 的探针DNA序列“aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No.61)(通过包括FP5′aatcgtatctcgggttaatgttgc 3′(SEQID No.33)和RP5′tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3′(SEQ ID No.34)的引物组17扩增) 18.28s核糖体RNA基因的真菌特异性部分的探针DNA序列“gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”(SEQ ID No.62)(通过包括FP5′gctgggactgaggactgcgac 3′(SEQ IDNo.35)和RP5′ttcaagacgggcggcatataac 3(SEQ ID No.36)的引物组18扩增) 19.16s-23s核糖体RNA基因的痤疮丙酸杆菌特异性部分的探针DNA序列“tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No.63)(通过包括FP5′tggcgaacgggtgagtaaca 3′(SEQ ID No.37)和RP5′ccggtattagccccagtttcc 3′(SEQ ID No.38)的引物组19扩增) 20.Gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分的探针DNA序列“cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”(SEQ ID No.64)(通过包括FP5′cggcggcaagttcgacgac 3′(SEQID No.39)和RP5′ccaccgagacgcccacacc 3′(SEQ ID No.40)的引物组20扩增) 21.革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因的探针DNA序列“ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”(SEQ ID No.65)(通过包括FP5′ccaggtcggcggagaagc 3′(SEQ IDNo.41)和RP5′ccaccggcccgatgacc 3′(SEQ ID No.42)的引物组21扩增) 22.革兰氏阴性核糖核酸酶1基因的探针DNA序列“gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc(SEQ ID No.66)(通过包括FP5′gccgccctgaccaccttc 3′(SEQ ID No.43)和RP5′gcgggttgttcggcatcag 3′(SEQ ID No.44)的引物组22扩增) 似乎重复一遍。
在本发明的另一实施方式中，具有SEQ ID No.67-88的靶序列使用计算机程序从探针序列产生。这些靶用于固定在惰性材料上，如尼龙，并用UV辐射交联或化学固定。靶按照下面的标准选择 1.所有靶序列是病原体特异性的且不与其它病原体的任何其它序列重叠。
2.所有靶序列在23-28碱基长度的范围内。
3.所有靶具有在58.9℃-88℃范围内的均匀的解链温度。
4.靶序列落在扩增子区域且不包含正向或反向引物序列，从而标记的探针(具有SEQ ID No.67-91)不与这些靶非特异性地结合。
5.所有靶以它们一般匹配所有核苷酸碱基的方式设计。但如果在某些探针中存在错配，错配限制为探针中部最多两个核苷酸。
靶序列详细描述如下 1.5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’(SEQ ID No.67)，通过引物组1扩增的HSV糖蛋白D的靶 2.5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’(SEQ ID No.68)，通过引物组2扩增的HSV UL 44的靶 3.5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’(SEQ ID No.69)，通过引物组3扩增的HSV聚合酶的靶 4.5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No.70)，通过引物组4扩增的CMV糖蛋白O的靶 5.5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No.71)，通过引物组5扩增的巨细胞病毒形态转化基因II的靶 6.5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No.72)，通过引物组6扩增的巨细胞病毒UL 88基因的靶 7.5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No.73)，通过引物组7扩增的水痘带状疱疹病毒ORF 29基因的靶 8.5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No.74)，通过引物组8扩增的水痘带状疱疹病毒DNA聚合酶基因的靶 9.5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No.75)，通过引物组9扩增的腺病毒六邻体基因的靶 10.5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No.76)，通过引物组10扩增的真细菌16s核糖体RNA基因区I的靶 11.5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No.77)，通过引物组11扩增的真细菌16s核糖体RNA基因区II的靶 12.5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No.78)，通过引物组12扩增的革兰氏阳性生物体的16s核糖体RNA基因的靶 13.5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No.79)，通过引物组13扩增的结核杆菌MPB 64基因的靶 14.5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No.80)，通过引物组14扩增的偶发分枝杆菌16s-23s RNA基因的靶 15.5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No.81)，通过引物组15扩增的龟分枝杆菌16s-23s RNA基因的靶 16.5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No.82)，通过引物组16扩增的鼠弓形体B1基因的靶 17.5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No.83)，通过引物组17扩增的沙眼衣原体多态蛋白II的靶 18.5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No.84)，通过引物组18扩增的所有真菌的28s核糖体RNA基因的靶 19.5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No.85)，通过引物组19扩增的痤疮丙酸杆菌的16s核糖体RNA基因的靶 20.5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No.86)，通过引物组20扩增的革兰氏阴性生物体的促旋酶基因的靶 21.5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No.87)，通过引物组21扩增的革兰氏阴性生物体的乌头酸水合酶基因的靶 22.5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SE Q ID No.88)，通过引物组2，2扩增的革兰氏阴性生物体的核糖核酸酶基因的靶 上面报告的用于固定在惰性基质上的这些寡核苷酸，使用由标准DNA产生的产物以及临床样本(通过序列分析)进行确认。这些序列是独特的且是未知的或没有被提到过用于多重或单重PCR。
在本发明的再另一实施方式中，提供了使用所有或一些上述引物组的多重PCR分析方法，其中所有引物可以利用统一的热循环条件在单个管中一起使用，包括94℃5分钟的变性步骤，随后是40次循环的60℃-64℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃延伸反应10分钟。
在进一步的实施方式中，在5’端用生物素标记的引物组使得可以检测有色产物。
在再另一实施方式中，所述引物用荧光标记(如异硫氰酸荧光素FITC的有机荧光标记或如Quantum DotsTM或Cy3或Cy5的无机荧光纳米颗粒)进行标记以便可以通过任何荧光扫描装置或显微镜进行检测。
在另一个实施方式中，本发明提供所述引物和探针集合的用途，其中检验分析是用于检测病原体的实时PCR。
在再另一实施方式中，本发明提供所述引物和探针集合的用途，其中检验分析是用于定量测定临床样本中病原体的实时PCR，以监测疾病的预后或治疗。
在再另一实施方式中，本发明提供所述引物集合的用途，其中扩增产物的检测可以是宏阵列或狭缝杂交或线性探针分析的形式。
在进一步的实施方式中，本发明提供由固定在含硝基纤维素、尼龙、带电尼龙、玻璃或聚苯乙烯的固体相上的所述探针组成的宏阵列。
在另一个实施方式中，本发明提供用于检测和鉴别引起如感染性眼内炎或角膜炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜炎的病症的病原体的方法，其中被检测的病原体为单纯疱疹病毒1和2、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒、真细菌、革兰氏阳性生物体、革兰氏阴性细菌、真菌、结核杆菌、龟分支杆菌、偶发分枝杆菌、鼠弓形体、沙眼衣原体。
在再另一实施方式中，本发明提供用于在一组引起具有相似症状的眼睛或中枢系统疾病的可能病原体中检测出个别的病原体的方法。
在再另一实施方式中，本发明提供使用选定的一些或所有前述引物的任何多重PCR分析，其中由一些或所有所述生物体引起的任何临床症状被研究，用于检测存在于临床样本中的任何一种个别病原体或病原体组。
在进一步的实施方式中，本发明提供用于同时检测引起外眼感染、眼内炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜脑炎的所有病原体的方法，包括如下步骤 a)从患有所述感染的患者取得临床样本， b)从步骤a)中取得的样本的一部分或全部提取DNA， c)采用生物素或荧光示踪剂标记的如权利要求1中所述的引物集合和标准的PCR试剂对步骤b)中获得的DNA进行多重PCR， d)使步骤c)中获得的PCR产物变性， e)使步骤d)中获得的PCR产物与固定在固体基质上的靶杂交， f)通过酶或荧光方法检测在步骤e)中获得的固体基质上的DNA杂交体。
在另一实施方式中，本发明提供用于同时检测引起外眼感染、眼内炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜脑炎的所有病原体的试剂盒，包括 a)如前所述的正向和反向引物的集合， b)固定在合适的固体载体上的如前所述的DNA靶基质， c)通过聚合酶链反应扩增DNA所需的标准试剂， d)将PCR扩增产物杂交到DNA探针的固定基质所需的标准试剂， e)检测用于检测和鉴别特定病因病原体的最终杂交产物所需的标准试剂。
在进一步的实施方式中，本发明提供用于同时检测引起外眼感染、眼内炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜脑炎的所有病原体的方法，包括 a)从患有所述感染的患者取得临床样本， b)从步骤a)中取得的样本的一部分或全部提取DNA， c)采用生物素或荧光示踪剂标记的如前所述的引物集合和标准的PCR试剂对步骤b)中获得的DNA进行多重PCR， d)使步骤c)中获得的PCR产物变性， e)使步骤d)中获得的PCR产物与固定在固体基质上的如前所述的靶杂交， f)通过酶或荧光方法检测在步骤e)中获得的固体基质上的DNA杂交体。
实施例 下面的实施例以对本发明举例说明的方式给出，因此不应构成对本发明的范围的限制。
实施例1 使用能够分别扩增腺病毒六邻体基因和沙眼衣原体多态蛋白II基因的引物组9和18进行多重PCR。PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，50℃进行2分钟，94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃进行10分钟的延伸反应。产物通过6％琼脂糖凝胶进行分析。如
图1中所见，两个基因都得到扩增。1pg腺病毒和10fg衣原体DNA的标准DNA用于扩增。
图1显示腺病毒六邻体基因和沙眼衣原体基因组的单重和多重PCR扩增产物的6％琼脂糖凝胶电泳图
道 NC-阴性对照 1-阳性对照-腺病毒 2-阳性对照-沙眼衣原体 3-阳性对照-多重PCR(腺病毒和沙眼衣原体) MW-100bp DNA梯状条带 实施例2 使用能够分别扩增糖蛋白D、UL 44和DNA聚合酶基因的引物组1、2和3进行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mMTris-HCl(pH 7.5)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，50℃进行2分钟，94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃进行10分钟的延伸反应。产物通过6％琼脂糖凝胶进行分析。如图2中所见，所有三个基因都得到扩增。
图2显示单纯疱疹病毒(HSV)糖蛋白D、DNA聚合酶、UL-44区域的扩增产物的4％琼脂糖凝胶电泳图
道 NC-阴性对照 1-阳性对照糖蛋白D区域 2-阳性对照DNA聚合酶区域 3-阳性对照UL-44区域 MW-100bp梯状条带 实施例3 使用能够分别扩增HSV糖蛋白D基因、UL 44基因和DNA聚合酶基因、腺病毒六邻体基因和沙眼衣原体多态蛋白II基因的引物组1、2、3、9和17进行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mMTris-HCl(pH 9.0)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，50℃进行2分钟，94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃进行10分钟的延伸反应。5管如上所述的PCR混合物与下面的DNA制剂一起孵育，其中管NC没有添加任何DNA，管1包含1pg的HSV DNA，管2包含4fg的沙眼衣原体，管3包含10pg的腺病毒DNA，而管4包含上述量的所有三种DNA。产物通过6％琼脂糖凝胶进行分析。如图3中所见，所有基因都得到扩增。
图3显示外眼感染的多重PCR扩增产物的6％琼脂糖凝胶电泳图
道 NC-阴性对照 1-阳性对照(HSV) 2-阳性对照(沙眼衣原体) 3-阳性对照(腺病毒) 4-阳性对照(所有三种基因组) MW-
174DNA的HinfI消化物 尼龙膜各点有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.67、68、69、75和83的靶(图4)。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封闭1小时。扩增子加热到95℃10分钟，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃杂交2小时。杂交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分钟，清洗5次。膜与链霉抗生物素-过氧化物酶偶联物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分钟后，膜各以相同的缓冲液清洗3分钟，清洗5次。为显色，膜在37℃与每毫升磷酸盐缓冲盐水0.5mg的盐酸二氨基联苯胺一起孵育10分钟。棕色色斑的出现表明特定病原体的存在。
图4与多重PCR扩增子杂交的尼龙膜上的宏阵列照片，用于特异性识别HSV、沙眼衣原体、腺病毒的基因组的外眼感染的鉴定
DNA阵列(左至右)显示尼龙膜上DNA探针点样的模板。HSV-单纯疱疹病毒，显示点样处标记为HGD＝HSV糖蛋白D，HDP＝HSV DNA聚合酶，HUL＝UL 44基因；1stComp.＝HGD的互补链探针，CT-沙眼衣原体，AV-腺病毒。NC-阴性对照，HSV-用管1的扩增子杂交的膜，CT-用管2的扩增子杂交的膜，AV-用管3的扩增子杂交的膜。
实施例4 使用能够分别扩增结核杆菌的MPB 64基因、偶发分枝杆菌的16s-23s RNA基因、龟分枝杆菌的16s-23s RNA基因和鼠弓形体的B1基因的引物组13、14、15和16进行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，50℃进行2分钟，94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃进行10分钟的延伸反应。5管如上所述的PCR混合物与下面的DNA制剂一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含1fg的结核杆菌DNA，管2包含100fg的偶发分枝杆菌DNA，管3包含100fg的龟分枝杆菌DNA，而管4包含1fg的鼠弓形体DNA。图5显示了五片尼龙膜，各点有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.79、80、81和82的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封闭1小时。扩增子加热到95℃10分钟，并在含有0.1％SDS的1ml 2X SSPE中混合和在52℃杂交2小时。杂交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分钟，清洗5次。膜与链霉抗生物素-过氧化物酶偶联物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分钟后，膜各以相同的缓冲液清洗3分钟，清洗5次。为显色，膜在37℃与每毫升磷酸盐缓冲盐水0.5mg的盐酸二氨基联苯胺一起孵育10分钟。棕色色斑的出现表明特定病原体的存在。
图5与多重PCR扩增子杂交的尼龙膜上的宏阵列照片，用于特异性识别鼠弓形体、结核杆菌、偶发分枝杆菌和龟分枝杆菌的基因组的葡萄膜炎及其它可疑分枝杆菌感染的检测
从左至右，第一是显示靶如何点在膜上的模板。MBT-结核杆菌，MBF-偶发分枝杆菌，MBC-龟分枝杆菌，TG-鼠弓形体。
第二是与标记为NC的阴性对照管杂交的NC，与从管1、2、3和4获得的扩增子杂交的尼龙膜分别标记为MBT、MBF、MBC和TG。
实施例5 使用能够分别扩增HSV的糖蛋白D基因、UL 44基因和DNA聚合酶基因、CMV的糖蛋白O基因、形态转化和UL 88基因及VZV的ORF29基因和DNA聚合酶基因的引物组1、2、3、4、5、6、7和8进行多重PCR。PCR混合物包含10pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，50℃进行2分钟，和94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃进行10分钟的延伸反应。
4管如上所述的PCR混合物与下面的DNA制剂一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含1pg的HSV DNA，管2包含10pg的CMV DNA，管3包含1pg的VZV DNA。图6显示了四片尼龙膜，各点有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.67、68、69、70、71、72、73和74的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封闭1小时。扩增子加热到95℃10分钟，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃杂交2小时。杂交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分钟，清洗5次。膜与链霉抗生物素-过氧化物酶偶联物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分钟后，膜各以相同的缓冲液清洗3分钟，清洗5次。为显色，膜在37℃与每毫升磷酸盐缓冲盐水0.5mg的盐酸二氨基联苯胺一起孵育10分钟。棕色色斑的出现表明特定病原体的存在。
图6.与多重PCR的扩增子杂交的尼龙膜上的宏阵列照片，用于特异性识别HSV、CMV和VZV的基因组的病毒性视网膜炎的鉴定
从左至右，显示探针如何点在各尼龙膜上的模板。HSV-单纯疱疹病毒，显示为HGD＝HSV糖蛋白D，HDP＝HSV DNA聚合酶，HUL＝UL 44基因，1st Comp.＝HGD的互补链探针；CMV-巨细胞病毒，显示为CMT＝形态转化基因II，CGO＝巨细胞病毒糖蛋白O，CUL＝UL 83基因，5th Comp.＝CMT的互补链探针；VZV-水痘带状疱疹病毒，显示为VO＝水痘带状疱疹ORF29基因，VDP＝水痘带状疱疹DNA聚合酶；NC与标记为NC的管的内容杂交的膜；HSV-与从1号管获得的扩增子杂交的尼龙膜；CMV-与从2号管获得的扩增子杂交的尼龙膜和VZV-与3号管的内容杂交的尼龙膜。
实施例6 使用能够分别扩增真细菌基因组的16s核糖体RNA基因I和II组、革兰氏阳性细菌的16s核糖体RNA基因、所有真菌的28sRNA基因、痤疮丙酸杆菌的16s核糖体RNA基因、革兰氏阴性细菌的gyrB基因、乌头酸水合酶基因和核糖核酸酶基因的引物组10、11、12、18、19、20、21和22进行多重PCR。PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、50mM Tris-HCl(pH 7.5)中的2单位的Taq聚合酶、5mM MgCl2、5mMKCl、0.01％牛血清白蛋白、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及在72℃进行10分钟的延伸反应。5管如上所述的PCR混合物与下面的DNA制剂一起孵育，其中管NC不包含任何DNA，管1包含5fg的大肠杆菌(E.coli)DNA，管2包含10fg的金黄色酿脓葡萄球菌(S.aureus)DNA，管3包含10fg的痤疮丙酸杆菌(P.acnes)DNA，和管4包含10fg的白色念珠菌(C.albicans)DNA。图7显示了五片尼龙膜，各点有0.26N NaOH中的100pmol的具有SEQ ID No.76、77、78、84、85、86、87和88的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封闭1小时。扩增子加热到95℃10分钟，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃杂交2小时。杂交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分钟，清洗5次。膜与链霉抗生物素-过氧化物酶偶联物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分钟后，膜各以相同的缓冲液清洗3分钟，清洗5次。为显色，膜在37℃与每毫升磷酸盐缓冲盐水0.5mg的盐酸二氨基联苯胺一起孵育10分钟。棕色色斑的出现表明特定病原体的存在。
图7.与多重PCR的扩增子杂交的尼龙膜上的宏阵列的照片，用于感染性眼内炎特别是真细菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、痤疮丙酸杆菌和真菌的基因组鉴定
NC＝阴性对照，GN显示ERR＝真细菌组I的16s核糖体RNA基因，ERW＝真细菌组II的16s核糖体RNA基因，GN31＝革兰氏阴性细菌的gyr B基因，GN67＝革兰氏阴性细菌的乌头酸水合酶基因，GN87＝革兰氏阴性细菌的核糖核酸酶基因，GP＝革兰氏阳性细菌的16s核糖体RNA基因，PA＝痤疮丙酸杆菌16s核糖体RNA基因，PF＝真菌28s核糖体RNA基因。顶端左角为探针点样的模板。NC为与阴性对照管杂交的尼龙膜。GN、GP、PA和PF为分别与管1、2、3和4的扩增子杂交的尼龙膜。
实施例7 由11名死前出现葡萄膜炎/视网膜炎的AIDS患者的尸检中收集玻璃体液，样本在多重PCR上测试，随后在宏阵列上鉴定扩增子。使用QIAGEN DNA纯化试剂盒从100μl的各玻璃体样本提取DNA。DNA在50μl的洗脱缓冲液中重配。多重PCR使用可以扩增所有23个基因的引物组1-23进行，所述基因有单纯疱疹病毒1&2糖蛋白D、单纯疱疹病毒1&2UL 44基因、单纯疱疹病毒1&2DNA聚合酶基因、巨细胞病毒糖蛋白O基因、巨细胞病毒形态转化基因、巨细胞病毒UL 88基因、水痘带状疱疹ORF 29、水痘带状疱疹DNA聚合酶基因、腺病毒六邻体基因、真细菌16s核糖体RNA基因I、真细菌16s核糖体RNA基因区域II、16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分、结核杆菌MPB 64基因、偶发分枝杆菌16s-23s RNA基因、龟分枝杆菌16s-23s RNA基因、鼠弓形体B1基因、沙眼衣原体多态蛋白II、28s核糖体RNA基因的真菌特异性部分、16s-23s核糖体RNA基因的痤疮丙酸杆菌特异性部分、gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分、革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因、革兰氏阴性细菌核糖核酸酶I基因。
PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)以及10μl从样本中提取的DNA。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，在50℃处理2分钟，和94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及随后在72℃进行10分钟的延伸反应。
如上所述，PCR使用浓度为10-20pmol/50μl反应混合物的包括SEQ ID NO.1-46的23组引物进行。所有样本的PCR产物在用SEQ IDNo.47-71的探针点样的尼龙膜上进行杂交。尼龙膜各点有0.26NNaOH中的100pmol具有SEQ ID No.67-88的靶。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封闭1小时。扩增子加热到95℃10分钟，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃杂交2小时。杂交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分钟，清洗5次。膜与链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶连接体在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1M Tris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分钟后，膜各以相同的缓冲液清洗3分钟，清洗5次。为显色，膜在37℃与每毫升磷酸盐缓冲盐水0.5mg的盐酸二氨基联苯胺一起孵育10分钟。棕色色斑的出现表明特定病原体的存在 所获得的结果概括于表1中。所有11个样本被鉴定为HSV视网膜炎和结核杆菌的葡萄膜炎，同时其中10个样本玻璃体中另外有鼠弓形体。多重PCR和DNA宏阵列准确地鉴定了所有样本。
表1使用多重PCR和宏阵列上的杂交对11份从AIDS病人得到的尸检玻璃体液样本进行病原体同时检测和鉴别的结果 实施例8 六份从AIDS病人尸检得到的CSF样本在多重PCR上测试，随后进行宏阵列分析。死亡的原因被确定为中枢神经系统感染。使用可商购的QIAGEN DNA提取试剂盒从200μl样本中提取DNA。DNA在50μl的洗脱缓冲液中重配。多重PCR使用可以扩增所有23个基因的引物组1-23进行，所述基因为单纯疱疹病毒1&2糖蛋白D、单纯疱疹病毒1&2UL 44基因、单纯疱疹病毒1&2DNA聚合酶基因、巨细胞病毒糖蛋白O基因、巨细胞病毒形态转化基因、巨细胞病毒UL 88基因、水痘带状疱疹ORF 29、水痘带状疱疹DNA聚合酶基因、腺病毒六邻体基因、真细菌16s核糖体RNA基因I、真细菌16s核糖体RNA基因区域II、16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分、结核杆菌MPB 64基因、偶发分枝杆菌16s-23s RNA基因、龟分枝杆菌16s-23s RNA基因、鼠弓形体B 1基因、沙眼衣原体多态蛋白II、28s核糖体RNA基因的真菌特异性部分、16s-23s核糖体RNA基因的痤疮丙酸杆菌特异性部分、gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分、革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因、革兰氏阴性细菌核糖核酸酶I基因。
PCR混合物包含10-20pmol的各正向和反向引物、200μM的各d-ATP、d-UTP、d-CTP和d-GTP、10mM Tris-HCl(pH 9.0)中的2单位的Taq聚合酶、1.5mM MgCl2、5mM KCl、0.01％明胶、1mM EDTA和1单位的UDP糖基化酶(以防止扩增子污染)以及10μl从样本中提取的DNA。循环条件是在37℃孵育30分钟以完全消化任何扩增子污染物，在50℃处理2分钟，和94℃进行5分钟的变性步骤，接着40个循环的60℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及随后在72℃10分钟的延伸反应。如上所述，PCR使用浓度为10-20pmol/50μl反应混合物的包括SEQ ID NO.1-46的23组引物进行。所有样本的PCR产物在用100pmol的0.26N NaOH中的具有SEQ ID No.67-88的靶点样的尼龙膜进行杂交。然后膜使用含有0.1％SDS和1％BSA的2X SSPE在37℃封闭1小时。扩增子加热到95℃10分钟，并在含有0.1％SDS的2X SSPE中混合和在52℃杂交2小时。杂交后，膜各在含有0.1％SDS的1X SSPE中清洗3分钟，清洗5次。膜与链霉抗生物素-过氧化物酶偶联物在含有1％BSA、150mM NaCl和0.3％tween-20的0.1MTris-HCl(pH 7.4)中孵育。在37℃30分钟后，膜各以相同的缓冲液清洗3分钟，清洗5次。为显色，膜在37℃与每毫升磷酸盐缓冲盐水0.5mg的盐酸二氨基联苯胺一起孵育10分钟。棕色色斑的出现表明特定病原体的存在 表2使用多重PCR和宏阵列上的杂交对6份从AIDS病人得到的尸检CSF样本进行病原体同时检测和鉴别的结果 实施例9 从各种临床诊断病例获得一系列(19)眼部样本(房水或者玻璃体液)。使用可商购的DNA提取试剂盒从大约50-100μl样本中提取DNA，且DNA在50μl水中重配。10μl用于包含10-20pmol各引物组1-23(包括SEQ ID No.1-46)的多重PCR。PCR试剂组成和热循环条件与上面实施例6和7中所述的相同。如在上面的实施例中描述的，扩增子与具有SEQ ID No.67-88的靶杂交。结果概括如下，其表明了引物组和探针的临床效用。
表3使用多重PCR和宏阵列上的杂交对从病人得到的房水和玻璃体液样本进行病原体的同时检测和鉴别的结果 优点 1.高效和节省时间的试剂盒。
2.在感染的早期鉴定特定的病原体将有助于医生选择合适的针对疾病蔓延和医治的治疗方案。
3.从同一样本鉴定多种感染也将有利于使用药物组合的高效疗法的治疗。
序列表
<110>科学与工业研究委员会
<120>同时检测和鉴别眼睛和中枢神经系统的细菌、真菌、寄生虫和病毒感染的新方法
<130>LLS073(210NF2006)
<160>88
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>20
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>1
cgcttggttt cggatgggag20
<210>2
<211>22
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>2
gcccccagag acttgttgta gg 22
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>3
ggcaatcgtg tacgtcgtcc g 21
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>4
cgggggggtc ttgcgttac 19
<210>5
<211>23
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>5
caagctgacg gacatttaca agg23
<210>6
<211>19
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>6
引cccacacg cgaaacacg 19
<210>7
<211>21
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>7
ttccggctca tggcgttaac c 21
<210>8
<211>21
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>8
cgccctgctt ttacgttacg c21
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>巨细胞病毒形态转化基因
<400>9
cggcgacgac gacgataaag 20
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<211>23
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>10
caatctggtc gcgtaatcct ctg 23
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<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>11
gggcacgtcc tcgcagaag 19
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<211>23
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>12
ccaagatgca ggtgataggt gac 23
<210>13
<211>23
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹ORF 29
<400>13
ggtcttgccg gagctggtat tac 23
<210>14
<211>23
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹ORF 29
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tgcctccgtg aaagacaaag aca 23
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<212>DNA
<213>水痘带状疱疹
<400>15
tccatttaac gttgcatcat tttgtg 26
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹
<400>16
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<212>DNA
<213>腺病毒
<400>17
cgccgccaac atgctctacc20
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<211>20
<212>DNA
<213>腺病毒六邻体基因
<400>18
gttgcgggag gggatggata20
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<211>24
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因I
<400>19
tgggctacac acgtgctaca atgg 24
<210>20
<211>24
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因I
<400>20
cggactacga tcggttttgt gaga 24
<210>21
<211>23
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因II
<400>21
ggcctaacac atgcaagtcg agc23
<210>22
<211>25
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因II
<400>22
ggcagattcc taggcattac tcacc 25
<210>23
<211>25
<212>DNA
<213>16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分
<400>23
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<210>24
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<212>DNA
<213>16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分
<400>24
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<210>25
<211>20
<212>DNA
<213>结核杆菌
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gcggaacgtg ggaccaatac20
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<211>22
<212>DNA
<213>结核杆菌
<400>26
cgacggggtg attttcttct tc 22
<210>27
<211>29
<212>DNA
<213>偶发分枝杆菌
<400>27
aacttttttg actgccagac acactattg 29
<210>28
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<212>DNA
<213>偶发分枝杆菌
<400>28
ggatgccacc ccccaaaag 19
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<211>24
<212>DNA
<213>龟分枝杆菌
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<212>DNA
<213>龟分枝杆菌
<400>30
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<210>31
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<212>DNA
<213>鼠弓形体
<400>31
cccctctgct ggcgaaaagt g 21
<210>32
<211>22
<212>DNA
<213>鼠弓形体
<400>32
ggcgaccaat ctgcgaatac ac 22
<210>33
<211>24
<212>DNA
<213>沙眼衣原体
<400>33
aatcgtatct cgggttaatg ttgc24
<210>34
<211>23
<212>DNA
<213>沙眼衣原体
<400>34
tcgaggaaaa ccgtatgaga aac 23
<210>35
<211>21
<212>DNA
<213>28s核糖体RNA基因
<400>35
gctgggactg aggactgcga c 21
<210>36
<211>22
<212>DNA
<213>28s核糖体RNA基因
<400>36
ttcaagacgg gcggcatata ac 22
<210>37
<211>20
<212>DNA
<213>痤疮丙酸杆菌
<400>37
tggcgaacgg gtgagtaaca 20
<210>38
<211>21
<212>DNA
<213>痤疮丙酸杆菌
<400>38
ccggtattag ccccagtttc c 21
<210>39
<211>19
<212>DNA
<213>gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分
<400>39
cggcggcaag ttcgacgac 19
<210>40
<211>19
<212>DNA
<213>gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分
<400>40
ccaccgagac gcccacacc 19
<210>41
<211>18
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因
<400>41
ccaggtcggc ggagaagc 18
<210>42
<211>17
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因
<400>42
ccaccggccc gatgacc 17
<210>43
<211>18
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌核糖核酸酶1基因
<400>43
gccgccctga ccaccttc 18
<210>44
<211>19
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌核糖核酸酶1基因
<400>44
gcgggttgtt cggcatcag 19
<210>45
<211>87
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>45
cgcttggttt cggatgggag gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga60
atgctcctac aacaagtctc tgggggc87
<210>46
<211>70
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>46
ggcaatcgtg tacgtcgtcc gcacatcaca gtcgcggcag cgtcatcggc ggtaacgcaa60
gacccccccg 70
<210>47
<211>79
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>47
caagctgacg gacatttaca aggtccccct ggacgggtac ggccgcatga acggccgggg60
cgtgtttcgc gtgtgggac 79
<210>48
<211>72
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>48
ttccggctca tggcgttaac caggtagaaa ctgtgtgtac agttgcgttg tgcgtaacgt60
aaaagcaggg cg72
<210>49
<211>65
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>49
cggcgacgac gacgataaag aatacaaagc cgcagtgtcg tccagaggat tacgcgacca60
gattg65
<210>50
<211>68
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>50
gggcacgtcc tcgcagaagg actccaggta caccttgacg tactggtcac ctatcacctg60
catcttgg 68
<210>51
<211>79
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹
<400>51
ggtcttgccg gagctggtat taccttaaaa ctcactacca gtcatttcta tccatctgtc60
tttgtctttc acggaggca 79
<210>52
<211>85
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹
<400>52
tccatttaac gttgcatcat tttgtgttat catagaactg cgtaaacact cggcaagtaa60
tacagataac tcgctaccgg aacgt 85
<210>53
<211>70
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>53
cgccgccaac atgctctacc ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca tatccatccc60
ctcccgcaac 70
<210>54
<211>86
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因区域I
<400>54
tgggctacac acgtgctaca atggtcggta cagagggtcg ccaaaccgcg aggtggagct60
aatctcacaa aaccgatcgt agtccg 86
<210>55
<211>86
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因区域II
<400>55
ggcctaacac atgcaagtcg agcggatgaa aggagcttgc tcctggattc agcggcggac60
gggtgagtaa tgcctaggaa tctgcc 86
<210>56
<211>71
<213>16s核糖体RNA基因的革兰氏阳性细菌特异性部分
<400>56
acgtcaaatc atcatgcccc cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacggtac60
aaagggctgc a 71
<210>57
<211>84
<212>DNA
<213>结核杆菌
<400>57
gcggaacgtg ggaccaatac ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg60
ttgaagaaga aaatcacccc gtcg 84
<210>58
<211>74
<212>DNA
<213>偶发分枝杆菌
<400>58
aacttttttg actgccagac acactattgg gctttgagac aacaggcccg tgcccctttt60
ggggggtggc atcc 74
<210>59
<211>70
<212>DNA
<213>龟分枝杆菌
<400>59
tggttactcg cttggtgaat atgttttata aatcctgtcc accccgtgga taggtagtcg60
gcaaaacgtc 70
<210>60
<211>70
<212>DNA
<213>鼠弓形体
<400>60
cccctctgct ggcgaaaagt gaaattcatg agtatctgtg caactttggt gtattcgcag60
attggtcgcc 70
<210>61
<211>79
<212>DNA
<213>沙眼衣原体
<400>61
aatcgtatct cgggttaatg ttgcatgatg ctttatcaaa tgacaagctt agatccgttt60
ctcatacggt tttcctcga 79
<210>62
<211>68
<212>DNA
<213>28s核糖体RNA基因的真菌特异性部分
<400>62
gctgggactg aggactgcga cgtaagtcaa ggatgctggc ataatggtta tatgccgccc60
gtcttgaa 68
<210>63
<211>77
<212>DNA
<213>痤疮丙酸杆菌
<400>63
tggcgaacgg gtgagtaaca cgtgagtaac ctgcccttga ctttgggata acttcaggaa60
actggggcta ataccgg 77
<210>64
<211>68
<212>DNA
<213>gyr B基因的革兰氏阴性细菌特异性部分
<400>64
cggcggcaag ttcgacgaca acacctacaa ggtgtccggc ggcttgcacg gtgtgggcgt60
ctcggtgg 68
<210>65
<211>66
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌乌头酸水合酶基因
<400>65
ccaggtcggc ggagaagccg aggcaggcga ggtccttcag ttcgtcgcgg gtcatcgggc60
cggtgg 66
<210>66
<211>64
<212>DNA
<213>革兰氏阴性细菌核糖核酸酶1
<400>66
gccgccctga ccaccttcat cagcctggcc ggccgttacc tggtgctgat gccgaacaac60
ccgc 64
<210>67
<211>45
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>67
gcaactgtgc tatccccatc acggtcatgg agtacaccga atgct45
<210>68
<211>30
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>68
cacatcacag tcgcggcagc gtcatcggcg 30
<210>69
<211>37
<212>DNA
<213>单纯疱疹病毒
<400>69
tccccctgga cgggtacggc cgcatgaacg gccgggg 37
<210>70
<211>31
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>70
aggtagaaac tgtgtgtaca gttgcgttgt g 31
<210>71
<211>22
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>71
aatacaaagc cgcagtgtcg tc22
<210>72
<211>26
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>72
gactccaggt acaccttgac gtactg26
<210>73
<211>33
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹
<400>73
cttaaaactc actaccagtc atttctatcc atc33
<210>74
<211>36
<212>DNA
<213>水痘带状疱疹
<400>74
ttatcataga actgcgtaaa cactcggcaa gtaata 36
<210>75
<211>30
<212>DNA
<213>腺病毒
<400>75
ctatacccgc caacgctacc aacgtgccca30
<210>76
<211>38
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因区域I
<400>76
tcggtacaga gggtcgccaa accgcgaggt ggagctaa 38
<210>77
<211>38
<212>DNA
<213>真细菌16s核糖体RNA基因区域II
<400>77
ggatgaaagg agcttgctcc tggattcagc ggcggacg 38
<210>78
<211>24
<212>DNA
<213>革兰氏阳性生物体的16s核糖体基因
<400>78
gacctgggct acacacgtgc taca 24
<210>79
<211>42
<212>DNA
<213>结核杆菌
<400>79
ctgggttggg ccggctgctt cgggcagcaa ctcccccggg tt 42
<210>80
<211>26
<212>DNA
<213>偶发分枝杆菌
<400>80
ggctttgaga caacaggccc gtgccc 26
<210>81
<211>23
<212>DNA
<213>龟分枝杆菌
<400>81
tttataaatc ctgtccaccc cgt 23
<210>82
<211>27
<212>DNA
<213>鼠弓形体
<400>82
aaattcatga gtatctgtgc aactttg 27
<210>83
<211>32
<212>DNA
<213>沙眼衣原体
<400>83
atgatgcttt atcaaatgac aagcttagat cc32
<210>84
<211>25
<212>DNA
<213>真菌的28s核糖体RNA基因
<400>84
gtaagtcaag gatgctggca taatg25
<210>85
<211>26
<212>DNA
<213>痤疮丙酸杆菌
<400>85
gcttcagcgc cgtcagcgag gataac 26
<210>86
<211>30
<212>DNA
<213>革兰氏阴性生物体的促旋酶基因
<400>86
aacacctaca aggtgtccgg cggcttgcac 30
<210>87
<211>31
<212>DNA
<213>革兰氏阴性生物体的乌头酸水合酶基因
<400>87
cgaggcaggc gaggtccttc agttcgtcgc g31
<210>88
<211>27
<212>DNA
<213>革兰氏阴性生物体的核糖核酸酶基因
<400>88
atcagcctgg ccggccgtta cctggtg2权利要求
1.用于检测和鉴别引起病症的病原体的引物组
组1为 FP5′cgcttggtttcggatgggag 3′(SEQ ID No.1)
RP5′gcccccagagacttgttgtagg 3′(SEQ ID No.2)
组2为 FP5′ggcaatcgtgtacgtcgtccg 3′(SEQ ID No.3)
RP5′cgggggggtcttgcgttac 3′(SEQ ID No.4)
组3为 FP5′caagctgacggacatttacaagg 3′(SEQ ID No.5)
RP5′gtcccacacgcgaaacacg 3′(SEQ ID No.6)
组4为 FP5′ttccggctcatggcgttaacc 3′(SEQ ID No.7)
RP5′cgccctgcttttacgttacgc 3′(SEQ ID No.8)
组5为 FP5′cggcgacgacgacgataaag 3′(SEQ ID No.9)
RP5′caatctggtcgcgtaatcctctg 3′(SEQ ID No.10)
组6为 FP5′gggcacgtcctcgcagaag 3′(SEQ ID No.11)
RP5′ccaagatgcaggtgataggtgac 3′(SEQ ID No.12)
组7为 FP5′ggtcttgccggagctggtattac 3′(SEQ ID No.13)
RP5′tgcctccgtgaaagacaaagaca 3′(SEQ ID No.14)
组8为 FP5′tccatttaacgttgcatcattttgtg 3′(SEQ ID No.15)
RP5′acgttccggtagcgagttatctg 3′(SEQ ID No.16)
组9为 FP5′cgccgccaacatgctctacc 3′(SEQ ID No.17)
RP5′gttgcgggaggggatggata 3′(SEQ ID No.18)
组10为 FP5′tgggctacacacgtgctacaatgg 3′(SEQ ID No.19)
RP5′cggactacgatcggttttgtgaga 3′(SEQ ID No.20)
组11为 FP5′ggcctaacacatgcaagtcgagc 3′(SEQ ID No.21)
RP5′ggcagattcctaggcattactcacc 3′(SEQ ID No.22)
组12为 FP5′acgtcaaatcatcatgcccccttat 3′(SEQ ID No.23)
RP5′tgcagccctttgtaccgtccat 3′(SEQ ID No.24)
组13为 FP5′gcggaacgtgggaccaatac 3′(SEQ ID No.25)
RP5′cgacggggtgattttcttcttc 3′(SEQ ID No.26)
组14为 FP5′aacttttttgactgccagacacactattg 3′(SEQ ID No.27)
RP5’ggatgccaccccccaaaag 3′(SEQ ID No.28)
组15为 FP5′tggttactcgcttggtgaatatgt 3′(SEQ ID No.29)
RP5′gacgttttgccgactacctatcc 3′(SEQ ID No.30)
组16为 FP5′cccctctgctggcgaaaagtg 3′(SEQ ID No.31)
RP5′ggcgaccaatctgcgaatacac 3′(SEQ ID No.32)
组17为 FP5’aatcgtatctcgggttaatgttgc 3′(SEQ ID No.33)
RP5’tcgaggaaaaccgtatgagaaac 3′(SEQ ID No.34)
组18为 FP5′gctgggactgaggactgcgac 3′(SEQ ID No.35)
RP5′ttcaagacgggcggcatataac 3′(SEQ ID No.36)
组19为 FP5′tggcgaacgggtgagtaaca 3′(SEQ ID No.37)
RP5′ccggtattagccccagtttcc 3′(SEQ ID No.38)
组20为 FP5′cggcggcaagttcgacgac 3′(SEQ ID No.39)
RP5′ccaccgagacgcccacacc 3′(SEQ ID No.40)
组21为 FP5′ccaggtcggcggagaagc 3′(SEQ ID No.41)
RP5′ccaccggcccgatgacc 3′(SEQ ID No.42)
组22为 FP5′gccgccctgaccaccttc 3′(SEQ ID No.43)
RP5′gcgggttgttcggcatcag 3′(SEQ ID No.44)
其中所述引物单独或组合使用。
2.如权利要求1所述的引物组，可用于通过对临床样本进行多重聚合酶链反应扩增病原体的目标基因来检测和鉴别引起感染性眼内炎或角膜炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜炎的病症的病原体。
3.如权利要求1所述的引物组，其特征在于具有58℃-65℃范围内的均匀的退火温度，长度在17-29个碱基的范围内。
4.一组如下所列的病原体特异性DNA探针序列，其通过单重或多重PCR反应利用权利要求1中所述的引物从标准或临床样本扩增
1)探针DNA序列
“cgcttggtttcggatgggaggcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgctcctacaacaagtctctgggggc”(SEQ ID No.45)
2)探针DNA序列
“ggcaatcgtgtacgtcgtccgcacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcggtaacgcaagacccccccg”(SEQ ID No.46)
3)探针DNA序列
“caagctgacggacatttacaaggtccccctggacgggtacggccgcatgaacggccggggcgtgtttcgcgtgtgggac”(SEQ ID No.47)
4)探针DNA序列
“ttccggctcatggcgttaaccaggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtgcgtaacgtaaaagcagggcg”(SEQ ID No.48)
5)探针DNA序列
“cggcgacgacgacgataaagaatacaaagccgcagtgtcgtccagaggattacgcgaccagattg”(SEQ ID No.49)
6)探针DNA序列
“gggcacgtcctcgcagaaggactccaggtacaccttgacgtactggtcacctatcacctgcatcttgg”(SEQ ID No.50)
7)探针DNA序列
“ggtcttgccggagctggtattaccttaaaactcactaccagtcatttctatccatctgtctttgtctttcacggaggca”(SEQ ID No.51)
8)探针DNA序列
“tccatttaacgttgcatcattttgtgttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaatacagataactcgctaccggaacgt”(SEQ ID No.52)
9)探针DNA序列
“cgccgccaacatgctctaccctatacccgccaacgctaccaacgtgcccatatccatcccctcccgcaac”(SEQ ID No.53)
10)探针DNA序列
“tgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaatctcacaaaaccgatcgtagtccg”(SEQ ID No.54)
11)探针DNA序列
“ggcctaacacatgcaagtcgagcggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcc”(SE Q ID No.55)
12)探针DNA序列
“acgtcaaatcatcatgcccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacggtacaaagggctgca”(SEQ ID No.56)
13)探针DNA序列
“gcggaacgtgggaccaatacctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggttgaagaagaaaatcaccccgtcg”(SEQ ID No.57)
14)探针DNA序列
“aacttttttgactgccagacacactattgggctttgagacaacaggcccgtgccccttttggggggtggcatcc”(SEQ ID No.58)
15)探针DNA序列
“tggttactcgcttggtgaatatgttttataaatcctgtccaccccgtggataggtagtcggcaaaacgtc”(SEQ ID No.59)
16)探针DNA序列
“cccctctgctggcgaaaagtgaaattcatgagtatctgtgcaactttggtgtattcgcagattggtcgcc”(SEQ ID No.60)
17)探针DNA序列
“aatcgtatctcgggttaatgttgcatgatgctttatcaaatgacaagcttagatccgtttctcatacggttttcctcga”(SEQ ID No.61)
18)探针DNA序列
“gctgggactgaggactgcgacgtaagtcaaggatgctggcataatggttatatgccgcccgtcttgaa”(SEQ ID No.62)
19)探针DNA序列
“tggcgaacgggtgagtaacacgtgagtaacctgcccttgactttgggataacttcaggaaactggggctaataccgg”(SEQ ID No.63)
20)探针DNA序列
“cggcggcaagttcgacgacaacacctacaaggtgtccggcggcttgcacggtgtgggcgtctcggtgg”(SEQ ID No.64)
21)探针DNA序列
“ccaggtcggcggagaagccgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcgggtcatcgggccggtgg”(SEQ ID No.65)
22)探针DNA序列
“gccgccctgaccaccttcatcagcctggccggccgttacctggtgctgatgccgaacaacccgc”(SEQ ID No.66)。
5.一组如下所列的DNA靶序列，具有58.9℃-83℃范围内的均匀的解链温度，杂交过程中在固定在固相基质上后与使用的扩增序列互补以进一步检测和鉴别所研究的特定病原体，该序列为
1)5’gcaactgtgctatccccatcacggtcatggagtacaccgaatgct3’(SEQ ID No.67)
2)5’cacatcacagtcgcggcagcgtcatcggcg 3’(SEQ ID No.68)
3)5’tccccctggacgggtacggccgcatgaacggccgggg 3’(SEQ ID No.69)
4)5’aggtagaaactgtgtgtacagttgcgttgtg 3’(SEQ ID No.70)
5)5’aatacaaagccgcagtgtcgtc 3’(SEQ ID No.71)
6)5’gactccaggtacaccttgacgtactg 3’(SEQ ID No.72)
7)5’cttaaaactcactaccagtcatttctatccatc 3’(SEQ ID No.73)
8)5’ttatcatagaactgcgtaaacactcggcaagtaata 3’(SEQ ID No.74)
9)5’ctatacccgccaacgctaccaacgtgccca 3’(SEQ ID No.75)
10)5’tcggtacagagggtcgccaaaccgcgaggtggagctaa 3’(SEQ ID No.76)
11)5’ggatgaaaggagcttgctcctggattcagcggcggacg 3’(SEQ ID No.77)
12)5’gacctgggctacacacgtgctaca 3’(SEQ ID No.78)
13)5’ctgggttgggccggctgcttcgggcagcaactcccccgggtt 3’(SEQ ID No.79)
14)5’ggctttgagacaacaggcccgtgccc 3’(SEQ ID No.80)
15)5’tttataaatcctgtccaccccgt 3’(SEQ ID No.81)
16)5’aaattcatgagtatctgtgcaactttg 3’(SEQ ID No.82)
17)5’atgatgctttatcaaatgacaagcttagatcc 3’(SEQ ID No.83)
18)5’gtaagtcaaggatgctggcataatg 3’(SEQ ID No.84)
19)5’gcttcagcgccgtcagcgaggataac 3’(SEQ ID No.85)
20)5’aacacctacaaggtgtccggcggcttgcac 3’(SEQ ID No.86)
21)5’cgaggcaggcgaggtccttcagttcgtcgcg 3’(SEQ ID No.87)
22)5’atcagcctggccggccgttacctggtg 3’(SEQ ID No.88)。
6.用于检测和鉴别引起如感染性眼内炎或角膜炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜炎的病症的病原体的方法，其中通过使用如权利要求1所述的正向和反向引物组的独特集合对临床样本进行多重PCR(聚合酶链反应)扩增该病原体的特定基因，且在进一步的步骤中，扩增的产物(探针)通过已知的方法与以多重形式固定在固相基质上的互补DNA序列(靶)杂交，并且杂交产物通过已知方法检测以进一步检测和鉴别引起所研究病症的特定病原体。
7.使用权利要求1中所述的所有或一些引物组的多重PCR分析，其中所有引物可以采用统一的热循环条件在单个管中一起使用，所述热循环条件特征在于，具有94℃5分钟的变性步骤，随后40个循环的60℃-64℃45秒、72℃45秒和94℃45秒及72℃10分钟的延伸反应。
8.如权利要求6中所述的方法，其中所述引物采用生物素基团在5’端标记，导致通过形成有色产物进行检测。
9.如权利要求6中所述的方法，其中所述引物通过荧光标记，例如，如异硫氰酸荧光素的有机荧光标记或如Quantum DotsTM或Cy3或Cy5的无机荧光纳米颗粒，使得能够通过任何荧光扫描设备或显微镜检方法检测。
10.如权利要求1中所述的引物集合、如权利要求4中所述的探针、如权利要求5中所述的靶的用途，其中所述分析是用于检测病原体的实时PCR。
11.如权利要求1中所述的引物集合、如权利要求4中所述的探针、如权利要求5中所述的靶的用途，其中所述分析是定量测定临床样本中病原体的实时PCR，用于监测疾病的预后或治疗。
12.采用如权利要求4中所述的特定探针对如权利要求6中所述的扩增产物的检测，其采取宏阵列或狭缝杂交或线性探针分析的形式。
13.如权利要求12中所述的宏阵列，其由固定在含硝基纤维素、尼龙、带电尼龙、玻璃或聚苯乙烯的固体相上的如权利要求5中所述的靶组成。
14.如权利要求12中所述的检测方法，其中待检测的病原体为单纯疱疹病毒1和2、巨细胞病毒、水痘带状疱疹病毒、腺病毒、真细菌、革兰氏阳性生物、革兰氏阴性细菌、真菌、结核杆菌、龟分支杆菌、偶发分枝杆菌、鼠弓形体、沙眼衣原体。
15.如权利要求6中所述的检测方法，其使得能够从引起具有相似表现的眼睛或神经系统疾病的权利要求14中所述的一组可能病原体中检测出个别的病原体。
16.采用如权利要求1中所述的一些选定的或所有的引物的多重PCR分析，其中由如权利要求14中所述的生物体中的一些或所有引起的任何临床症状被研究，以检测临床样本中存在的任何一种个别病原体或病原体组。
17.用于同时检测引起外眼感染、眼内炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜脑炎的所有病原体的方法，包括如下步骤
a)从患有感染的患者取得临床样本，
b)从步骤a)中取得的临床样本的一部分或全部提取DNA，
c)采用用生物素或荧光示踪剂标记的如权利要求1中所述的引物集合和标准的PCR试剂对步骤b)中获得的模板DNA进行多重PCR，
d)使步骤c)中获得的PCR产物变性，
e)使所述PCR产物与固定在固体基质上的如权利要求5中所述的靶杂交，
f)通过酶法或荧光方法检测固体基质上的在步骤e)中获得的DNA杂交体。
18.用于同时检测引起外眼感染、眼内炎或葡萄膜炎或视网膜炎或脑膜脑炎的所有病原体的试剂盒，包括
a)如权利要求1中所述的正向和反向引物的集合，
b)固定在合适的固体相上的如权利要求5中所述的DNA序列的基质，
c)通过聚合酶链反应扩增DNA所需的标准试剂，
d)将PCR扩增产物杂交到固定在合适固体相上的DNA序列基质所需的标准试剂，
e)检测和鉴别最终的杂交产物所需的标准试剂。
全文摘要
本发明涉及用于在能够引起感染的许多可能病原体中鉴别眼睛和中枢系统感染的单种病原体或一种以上病原体的诊断方法。所有感染眼睛或中枢系统的个别区域的病原体一般引起相同的表现或症状，本发明涉及以单一的检验在这组可能的病原体中检测或鉴别到该病原体，而不需要借助于各针对每一种病原体的检测的成套检验。本发明致力于用基于症状的诊断替代基于个别病原体检测的诊断。
文档编号C12Q1/68GK101541979SQ200880000035
公开日2009年9月23日 申请日期2008年5月27日 优先权日2007年6月1日
发明者C·M·拉奥, K·S·拉奥, P·V·拉姆钱德, H·N·玛德哈范, S·沙玛, G·萨特帕泰, V·B·拉维库玛 申请人:科学与工业研究委员会