一种抑制人类免疫缺陷病毒的真菌提取物的制备方法
【专利摘要】一种抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)的真菌提取物的制备方法，所依赖的菌株是炭团菌属真菌Q-s-4(Hypoxylon?sp.)。真菌Q-s-4经液体发酵培养，制备发酵产物的提取物。该方法可用于真菌Q-s-4的大规模工业化培养，并以发酵产物为原料，工业化生产发酵产物的提取物。利用该方法制备的提取物，具有显著抑制HIV-1整合酶的活性，并有抗菌活性，在治疗艾滋病和细菌感染的新药研发方面具有重要价值。
【专利说明】一种抑制人类免疫缺陷病毒的真菌提取物的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物工程【技术领域】，具体地说涉及一种能够抑制人类免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶表达的内生真菌提取物的制备技术。
技术背景
[0002]获得性免疫缺陷综合症(Acquiredimmunodeficiency syndrome, AIDs)由感染人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)导致。自1981年由美国疾病控制中心首次报道以来，现已经成为世界主要致死病之一。到2007年为止，世界范围内约有3340万人感染HIV病毒，其中2240万居住在非洲撒哈拉以南地区，约三分之二的人口感染HIV病毒。截至2010年底，全球中低收入国家中约有660万人接受了抗逆转录病毒药物治疗，比2001年增长了近22倍。目前临床上应用的近30种抗HIV-1药物，辅以高效抗逆转录病毒疗法(Highly Active Antiretroviral Therapy, HAART)可以在一定程度上延长HIV感染者的生存期和改善感染者的生活质量。但是，由于HIV疫苗研究进展的缓慢以及越来越多变异HIV的挑战，研究开发新型抗HIV化学药物及治疗方法仍然具有重要意义。HIV进入人体后，主要通过与宿主细胞膜直接融合进入细胞，HIV的复制周期主要包括吸附及穿入、逆转录与环化、整合、转录、翻译、病毒颗粒装配、病毒体成熟、出芽等阶段。抗HIV物质针对不同的作用位点发挥抗病毒作用现阶段，主要抗HIV药物主要分为五大类:(I)HIV-1逆转录酶制剂；(2) HIV-1进入抑制剂；(3) HIV-1蛋白酶抑制剂；(4) HIV-1整合酶抑制剂；(5)其它。
[0003]因此，基于HIV-1病毒的不稳定性，变异迅速，新细菌株和病毒株不断出现导致原有药物治疗谱窄，耐药性严重等新特性，科研工作者针对HIV-1复制周期的各个阶段广泛的寻找和研究用于不同靶点的有效药物，旨在抑制HIV-1的复制。
[0004]近年来，我国药用植物内生真菌及活性成分的研究成为药物开发的一个非常重要的领域，大自然为很多疾病提供了治疗药物的来源，许多药用植物已经被报道具有抗HIV-1的特性，这也应该是我国新药研究的优势所在，一旦发现活性，往往以该结构为先导化合物，合成活性更强、可溶性好及毒性低的药物。但大量开采植物会导致植物资源枯竭，环境污染破坏。内生真菌是存在于植物正常部位而不引起宿主植物明显症状的一类真菌。植物与其内生真菌的关系是互惠共生的。近年来一些研究表明，与药用植物共生的内生真菌能够产生与宿主相同或相似的生理活性成分。利用发酵法生产与植物相同或相似的次生代谢产物，具有可大规
[0005]模工业化生产和易于进行质量控制等优点，并不会对自然资源造成破坏。所以从真菌发酵产物中寻找新型抗HIV和抗菌药物或先导化合物的研究，是当今国内药物研发的重要方向和活跃领域，也为我国新药研究的优势所在。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供真菌液体发酵培养的方法和真菌发酵产物提取物制备的方法，该方法制备成本低，工艺简单、生产周期短，且污染小，可用于真菌的大规模工业化培养，并以真菌发酵物为原料工业化生产发酵产物的提取物。
[0007]本发明的另一目的是提供上述发酵产物的提取物用于抗人类免疫缺陷病毒的研发和应用。
[0008]为实现上述目的，本发明采用的技术是:液体发酵培养真菌Q-s-4，发酵产物分离为菌丝体和发酵液两个部分，用有机溶剂分别对菌丝体和发酵液部分进行提取，得到发酵产物的提取物。本发明所利用的真菌Q-s-4是从菊科蒿属植物黄花蒿(Artemisia annuaL.)的莖中分离得到的，经鉴定为炭团菌(Hypoxylon sp.)。该菌种于2012年4月23日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.6039。保藏和存活证明见附件。
[0009]具体地说，本发明所述的技术步骤如下:
[0010]1.真菌的发酵培养
[0011]将真菌Q-s-4自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于25°C恒温培养5-12天，分别在菌落边缘打孔成菌片，将菌片打碎，接入麦麸液体培养基进行发酵培养。麦麸液体培养基组成按重量百分含量计算为:麦麸1-5% (煮20-30分钟，取汁)，葡萄糖1-4%, KH2PO40.1-0.4%, MgSO40.1-0.3%，其余成分为水，培养基pH自然。三角瓶或其他容器装液 体培养基，装量为容器体积的30-60%。培养基灭菌后接入真菌Q-s-4，22-26°C振荡暗培养12-30天，振荡转速90-130转/分钟。
[0012]2.真菌发酵产物的获得
[0013]真菌Q-s-4经发酵培养后，用80-120目尼龙网过滤，分为菌丝体和发酵液两个部分；菌丝体部分用水冲洗干净，挤压除去大部分水分；发酵液部分40-60°C真空减压浓缩至原发酵液体积的10-20%。
[0014]3.真菌发酵产物提取物的制备
[0015]①菌丝体用甲醇或95 %乙醇超声提取2-3次，每次40-60分钟，每次提取溶剂用量(V)为菌丝体重量(W)的8-12倍；或菌丝体用甲醇、95%乙醇或丙酮渗漉提取，提取溶剂用量(V)为菌丝体重量(W)的12-15倍，所得提取液于40-60°C减压浓缩后干燥，得到菌丝体总提取物；
[0016]②发酵液浓缩物加入95%乙醇或无水乙醇进行醇沉，溶剂用量(V)为发酵液浓缩物体积(V)的3-5.5倍，静置2处分层，收集上清液，于40-601:减压浓缩后干燥，得到发酵液总提取物。
[0017]③分别将菌丝体总提取物和发酵液总提取物均匀分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，至有机溶剂层无色；分别合并各溶剂萃取液，于40-60°C减压浓缩后干燥，得到菌丝体和发酵液的石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取部位。
【具体实施方式】
[0018]实施例:
[0019]1.真菌的发酵培养
[0020]将炭团菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.)自低温保藏的斜面试管菌种活化后,转接于含PDA培养基的平皿中，于25°C恒温培养5天，分别在菌落边缘打孔成直径均匀的菌片，并以小碎块接入麦麸液体培养基。
[0021]麦麸液体培养基组成为:麦麸20克/升(煮30分钟，取汁)，葡萄糖30克/升，KH2P042克/升，MgSO4I克/升。250mL三角瓶装培养基lOOmL，122°C灭菌22分钟，按上述方法接入炭团菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.),于25°C振荡暗培养14天,摇床转速120转/分钟。
[0022]2.真菌发酵产物的获得
[0023]真菌Q-s-4经过发酵培养后，用100目尼龙网过滤，分为菌丝体和发酵液两部分；菌丝体部分用蒸馏水冲洗干净，挤压除去水分；发酵液部分常压加热浓缩至原发酵液体积的 20%。
[0024]3.真菌发酵产物提取物的制备
[0025]①菌丝体用甲醇超声提取2次，每次60分钟，第一次和第二次提取的溶剂用量(V)分别为菌丝体重量(W)的12倍和10倍；合并两次提取液，60°C减压浓缩后干燥，得菌丝体总提取物；
[0026]②发酵液浓缩物加入95%乙醇醇沉，95%乙醇的用量(V)为发酵液浓缩物体积(V)的4倍，于8°C静置24h分层，收集上清液，于60°C减压浓缩，得到发酵液总提取物。
[0027]③分别将菌丝体总提取物和发酵液总提取物均匀分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至各有机溶剂层无色；合并各萃取液，于60°C减压浓缩后冷冻干燥，得到菌丝体和发酵液的石油醚提取部分、乙酸乙酯提取部分和正丁醇提取部位。
[0028]比较例:
[0029]1.真菌发酵产物提取物对人类免疫缺陷病毒(HIV-1)整合酶的抑制作用
[0030]真菌Q-s-4接种到PDA培养基的平皿中，25 °C恒温培养7天，接入麦麸液体培养基中。培养基组成为:麦麸30克/升(煮20分钟，取汁)，葡萄糖20克/升，KH2P043克/升，MgSO4L 5克/升。250mL三角瓶装培养基125mL，121°C灭菌25分钟。灭菌培养基接入真菌Q-s-4，于25°C振荡暗培养21天，摇床转速100转/分钟。
[0031]结束培养后，用100目尼龙网过滤，分离菌丝体和发酵液。菌丝体用水冲洗干净，挤压除去水分，用95%乙醇超声提取3次，提取时间分别为60分钟、40分钟和40分钟，提取溶剂用量(V)分别为菌丝体湿重(W)的10倍、8倍和8倍。合并三次提取液，50°C减压浓缩，干燥，得到菌丝体的总提取物。发酵液浓缩至原体积的10%，加入3.5倍体积95%乙醇进行醇沉，室温放置24h分层。收集上清液，50°C减压浓缩后干燥，得到发酵液总提取物。
[0032]分别将菌丝体总提取物和发酵液总提取物均匀分散于水中，依次以石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取至有机溶剂层无色；合并各萃取液，于50°C减压浓缩后干燥，得到菌丝体和发酵液的石油醚提取部位、乙酸乙酯提取部位和正丁醇提取部位。
[0033]将各部分提取物倍比稀释，利用HIV-1整合酶链转移反应测定提取物对HIV-1整合酶的抑制率，实验数据见表I。实验结果显示:菌丝体石油醚和乙酸乙酯提取部位在所测试浓度对HIV-1整合酶的抑制作用随浓度增加而增加，超过一定浓度，抑制作用达到平衡。菌丝体和发酵液的石油醚和乙酸乙酯的提取部位对HIV-1整合酶均有显著的抑制作用；正丁醇部位没有显示明显的活性。菌丝体的石油醚和乙酸乙酯提取部位对HIV-1整合酶的半数抑制浓度(IC5tl)分别为11.983ii g/mL和7.436y g/mL。发酵液的石油醚和乙酸乙酯提取部位对HIV-1整合酶的半数抑制浓度(IC5tl)分别为46.314 u g/mL和10.926 u g/mL。[0034]表I真菌Q-s-4发酵产物提取物对HIV-1整合酶的抑制作用
[0035]
I
【权利要求】
1.一种制备保藏编号为CGMCC N0.6039的炭团菌属真菌Q_s_4 (Hypoxylon sp.)的发酵产物提取物的方法，包括步骤: (1)真菌的发酵培养 将真菌Q-s-4自低温保藏的斜面试管菌种活化后，转接于含PDA培养基的平皿中，于25°C恒温培养5-12天，分别在菌落边缘打孔成菌片，并以小碎块接入液体培养基中进行发酵培养； 液体培养基组成按重量百分含量计算为:麦麸1-5 %，煮20-30分钟，取汁，葡萄糖1-4%, KH2PO40.1-0.4%, MgSO40.1-0.3%，pH自然；三角瓶或其他容器装液体培养基，装量为容器体积的30-60% ;灭菌后接入真菌Q-s-4，22-26°C振荡暗培养12-30天，振荡转速90-130转/分钟； (2)真菌发酵产物的获得 真菌Q-s-4经发酵培养后，用80-100目尼龙网过滤，分离菌丝体和发酵液；菌丝体用水冲洗干净，挤压除去大部分水分；发酵液40-60°C减压浓缩至原发酵液体积的10-20% ； (3)真菌发酵产物提取物的制备 ①菌丝体用甲醇或95%乙醇超声提取2-3次，每次40-60分钟，每次提取用的溶剂体积为菌丝体重量的8-12倍；或菌丝体用甲醇、95 %乙醇或丙酮渗漉提取，提取用的溶剂体积为菌丝体重量的12-15倍；所得提取液于40-60°C减压浓缩后干燥，得到菌丝体总提取物； ②发酵液浓缩物加入95%乙醇或无水乙醇进行醇沉，所用溶剂体积为发酵液浓缩物体积的3-5.5倍，放置24h分层 ，收集上清液，于40-60°C减压浓缩后干燥，得到发酵液总提取物； ③上述两种总提取物，分别分散于水中，依次以石油醚和乙酸乙酯萃取至溶剂层无色；合并各萃取液，于40-60°C减压浓缩后冷冻干燥，得到各总提取物的石油醚部位和乙酸乙酯部位。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:按上述方法制备的保藏编号为CGMCCN0.6039的炭团菌属真菌Q-s-4 (Hypoxylon sp.)的提取物，能够抑制人类免疫缺陷病毒整合酶的活性，能够用于抗人类免疫缺陷病毒药物的研究和应用。
【文档编号】A61K36/062GK103451234SQ201210172132
【公开日】2013年12月18日 申请日期:2012年5月30日 优先权日:2012年5月30日
【发明者】郭顺星, 梁寒峭, 陈晓梅, 张大为, 王春兰, 邢咏梅, 李春艳, 李兵 申请人:中国医学科学院药用植物研究所