专利名称：一株赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株及其构建方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一株赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株及其构建方法。
背景技术：
炭疽杆菌是一种杆状、能形成芽胞的革兰氏阳性杆菌，能够引起人畜的炭疽病，如 果不及时治疗，死亡率极高。炭疽是五大人畜共患病之一，危害性极强，对世界各地的人类健康及畜牧业都构成了严重威胁。炭疽杆菌的芽孢接触到皮肤伤口、消化道或呼吸道上皮后，将感染并会导致皮肤炭疽、肺炭疽、肠道炭疽等疾病。肺炭疽最为严重，将很快导致疾病和死亡。炭疽杆菌还被用作生物战剂和制造生物恐怖，对社会稳定构成威胁。故炭疽杆菌相关研究一直广受关注。定量蛋白质组学是把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂的混合体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定的一门学科。这一概念的提出标志着蛋白质组技术的不断改进和完善。蛋白质组学研究已从对蛋白质简单的定性向精确的定量方向发展。蛋白质组定量的概念是试图准确地测定蛋白质组间相对含量的差别，而不在于测定其绝对的浓度。2002年，丹麦Mann实验室建立了 SILAC技术，并首次将其应用于定量蛋白质组研究，为全面、系统地定性和定量分析细胞复杂蛋白质组提供了有效的方案。SILAC基本原理是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代培养基中相应氨基酸，赖氨酸合成缺陷的菌株只能利用培养基中添加的赖氨酸，因而经5-6个生长周期后，稳定同位素标记的氨基酸将会完全掺入到新合成的蛋白质中替代原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按等比例混合，经分离纯化后即可进行定量质谱鉴定。SILAC具有无可比拟的巨大优势它是一种体内标记技术，稳定同位素标记的氨基酸与天然氨基酸化学性质基本相同，对细胞无毒性，因而所标记的细胞和未标记细胞在生物学行为上几乎没有差异，所得实验结果也自然更加接近样品真实状态，并且其标记效率可高达100%。因此，可以说，SILAC技术是定量蛋白质组学研究的不二选择。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种制备重组菌A的方法。本发明提供的方法，为将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，即得到重组菌A。上述方法中，所述将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因通过同源重组实现。上述方法中，所述同源重组包括如下步骤I)将含有抗性筛选标记物基因的片段导入所述炭疽杆菌中，通过同源重组将所述抗性筛选标记物基因替换掉所述炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，得到同源重组后重组菌B ;所述含有抗性筛选标记物基因的片段具体通过重组载体导入炭疽杆菌中；所述含有抗性筛选标记物基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列I ;2)将所述重组菌B在37°C -40°c培养，以去除所述重组载体，得到重组菌C。
上述方法中，步骤I)中，所述含有抗性筛选标记物基因的片段通过重组载体导入炭疽杆菌中；所述重组载体为将序列表中的序列I所示DNA片段通过同源重组插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为PKSV7 ；上述方法中，在所述步骤I)前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤。上述将所述重组载体去甲基化的方法包括如下步骤I)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌D ；2)、从所述重组菌D中提取质粒，得到去甲基化的重组载体。上述方法中，在所述步骤I)和步骤2)之间还包括将所述重组菌B经过传代培养的步骤。在所述步骤2)后，还包括将所述重组菌C分别在仅含有所述抗性筛选标记物培养基和仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物I的培养基中培养，选取在仅含有所述抗性筛选标记物培养基生长且在仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物I的培养基上不生长的菌，得到重组菌A。上述方法中，所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCSllO ；所述抗性筛选标记物为壮观霉素，其核苷酸序列为序列I自5’末端第934-2215位核苷酸；所述重组载体的抗性筛选标记物I为氯霉素。上述炭疽杆菌为炭疽杆菌A16。由上述的方法制备的重组菌A也是本发明保护的范围。本发明的另一个目的是提供一种DNA分子。本发明提供的DNA分子，为如下⑴或⑵或(3):(I)序列表中序列I所示的DNA分子；(2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子；(3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。 本发明的第三个目的是一种重组载体。本发明提供的重组载体，为将上述的DNA分子插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为PKSV7。本发明的实验证明，本发明提供的方法构建了炭疽杆菌野生株A16的赖氨酸基因缺失株，其不能自身合成赖氨酸，只能从外源获取。该缺失株的成功构建为进一步做定量蛋白质组学研究奠定了基础。
图I为序列I各序列组成的结构2为同源重组原理进行各片段连接示意3为重组质粒转化DH5 a PCR鉴定4为重组质粒转化DH5 a质粒酶切5为重组质粒转化SCSllO菌落PCR图6为重组质粒转化SCSI 10PCR鉴定7为重组质粒转化SCSllO质粒酶切8为重组质粒电转A16鉴定图9为目的菌株外部及内部引物PCR鉴定图10为突变株表型鉴定
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例I、赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株A16/ ALysA: : spc的获得一、A16/去甲基化pKLysAUSD的获得I、重组质粒pKLysAUSD的构建I)温敏型质粒线性化骨架质粒温度敏感型穿梭质粒pKSV7 :Smith K, Youngman P. Use of a newintegrational vector to investigate compartment-specific expression of theBacillus subtilis spoIIM gene [J] Biochimie，1992，74 :705-711.公众可从中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所获得，含氯霉素抗性基因cat。将温度敏感型穿梭质粒pKSV7(6. 9Kb)用限制性内切酶HindIII和EcoRI酶切线性化，得到线性化PKSV7。从凝胶上切下目标条带，用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化载体片段，操作步骤按照说明书进行。2)目标基因(LysA)上下游同源臂的获取
使用Primer premier 5. 0软件,根据炭疽杆菌Ames株染色体上赖氨酸合成基因LysA基因(NC003997的第1361225-1362541位)上下游序列，设计LysA基因上下游同源臂序列的引物(LysU_HindF和LysU_R扩增up片段,LysD_F和LysD_EcoR扩增down片段,如表I所示)。表I研究中使用的引物
权利要求
1.一种制备重组菌A的方法，包括如下步骤将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，即得到重组菌A。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因通过同源重组实现。
3.根据权利要求I或2所述的方法，其特征在于 所述同源重组包括如下步骤 1)将含有抗性筛选标记物基因的片段导入所述炭疽杆菌中，通过同源重组将所述抗性筛选标记物基因替换掉所述炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因，得到同源重组后重组菌B ;所述含有抗性筛选标记物基因的片段具体通过重组载体导入炭疽杆菌中； 所述含有抗性筛选标记物基因的片段的核苷酸序列为序列表中的序列I ; 2)将所述重组菌B在37°C-40°C培养，以去除所述重组载体，得到重组菌C。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于 所述重组载体为将序列表中的序列I所示DNA片段插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为PKSV7。
5.根据权利要求1-4中任一所述的方法,其特征在于 在所述步骤I)前，还包括将所述重组载体去甲基化的步骤。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法,其特征在于 所述将所述重组载体去甲基化的方法包括如下步骤 1)、将所述重组载体转入甲基化酶缺陷的大肠杆菌中，得到重组菌D； 2)、从所述重组菌D中提取质粒，得到去甲基化的重组载体。
7.根据权利要求1-6中任一所述的方法,其特征在于 在所述步骤I)和步骤2)之间还包括将所述重组菌B经过传代培养的步骤。
在所述步骤2)后，还包括将所述重组菌C分别在仅含有所述抗性筛选标记物培养基和仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物I的培养基中培养，选取在仅含有所述抗性筛选标记物培养基生长且在仅含有所述重组载体的抗性筛选标记物I的培养基上不生长的菌，得到重组菌A。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于 所述甲基化酶缺陷的大肠杆菌为大肠杆菌SCSllO ； 所述抗性筛选标记物为壮观霉素； 所述重组载体的抗性筛选标记物I为氯霉素。
9.由权利要求1-8中任一所述的方法制备的重组菌A。
10.一种DNA分子，为加下(I)或⑵或(3): (1)序列表中序列I所不的DNA分子； (2)在严格条件下与(I)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能蛋白的DNA分子； (3)与(I)限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码具有相同功能蛋白的DNA分子。
或一种重组载体，为将所述的DNA分子插入温度敏感型穿梭质粒中得到的载体；所述温度敏感型穿梭质粒具体为PKSV7。
全文摘要
本发明公开了一株赖氨酸合成缺陷的炭疽杆菌株及其构建方法。本发明提供方法，为将抗性筛选标记物基因替换掉炭疽杆菌基因组中的赖氨酸合成基因得到的重组菌。上述方法中，所述抗性筛选标记物基因为壮观霉素抗性基因；所述壮观霉素抗性基因的核苷酸序列具体为序列表中序列1自5’末端第1018-2147位核苷酸。本发明的实验证明，本发明提供的方法构建了炭疽杆菌野生株A16的赖氨酸基因缺失株，其不能自身合成赖氨酸，只能从外源获取。该缺失株的成功构建为进一步做定量蛋白质组学研究奠定了基础。
文档编号C12N15/80GK102628019SQ201210099920
公开日2012年8月8日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者冯尔玲, 刘先凯, 朱力, 王恒樑, 王雪芳, 高飞 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所