专利名称：筛选乳腺炎抗性奶牛的hstn基因snp位点、方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属于家畜分子生物学技术领域，涉及筛选乳腺炎抗性奶牛的HSTN基因SNP 位点、应用方法及试剂盒。
背景技术：
奶牛乳腺炎(Mastitis)是指奶牛乳腺受到物理、化学刺激，尤其是微生物的侵袭而发生的一种炎性变化，它不仅影响乳汁品质，而且降低产奶量，给奶业发展造成了严重的危害。据报道，乳腺炎在我国牛群中的阳性率可高达40%-80%，奶牛乳腺炎已成为目前困扰我国奶牛养殖业的头号难题，因此控制其发病率，降低治疗乳腺炎的费用，对于提高奶牛生产者的经济效益非常重要。奶牛乳腺炎分为临床型乳腺炎(Clinical mastitis)和隐性乳腺炎(Hidden mastitis)(也称亚临床型乳腺炎，Subclinical mastitis)两种类型。临床型乳腺炎可产生明显的临床症状，比较容易作出诊断，而对于隐性乳腺炎要作出准确的诊断，须借助一些实验室的诊断方法。体细胞数(SCS)和乳腺炎之间的遗传相关从O. 30到O. 98，平均值为
O.70, SCS与乳腺炎之间的高遗传相关使得SCS成为乳腺炎一个可行的遗传标记。如加拿大将SCS包括在总经济价值指数(TEV)中，而瑞典利用SCS制定了乳腺炎抗性指数。通过直接显微镜细胞记数法测定乳中SCS来评价奶牛各乳区和奶牛健康状况是目前比较公认的作法。人们通过功能基因多态性与SCS进行关联分析就可得到显著影响奶牛乳腺炎抗性的分子标记。Histatherin(HSTN)由牛富组蛋白(Histatin,HTN)基因和富酪蛋白(Statherin， STATH)基因重组形成的HSTN基因编码，是富组蛋白和富酪蛋白的组合体，是最近发现的一种抗菌肽。Molenaar等(2008)人工合成了 HSTN并进行了体外抗菌实验,发现在磷酸盐缓冲液中，3. I μ g/mL浓度的HSTN能杀死大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，6. 25μ g/mL浓度时能杀死念珠菌，表明HSTN的抗菌杀菌活性非常显著。据此推测HSTN在牛体内与免疫应答有关，具体的作用及其调控机制尚不清楚。HSTN基因是影响牛乳腺炎性状的一个重要基因， 其单核苷酸多态性(SNP)是导致不同牛个体间抗乳腺炎性状差异的遗传学基础，但利用其 SNP及单倍型组合与奶牛抗乳腺炎的关系检测奶牛抗性性状的试剂盒未见报道。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的提出一种用于HSTN基因单倍型组合筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，并通过此单倍型组合与乳腺炎抗性性状的关系，进而提供一种新的筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，为奶牛的标记辅助选择提供新的分子标记，可进行奶牛的早期筛选。为实现这一目的，本发明提出的一个新的奶牛HSTN基因的单倍型组合 H2H2 (AATTGG)，是检测奶牛自 GenBank Accession No NC_007304. 5 (88288094-88302412) 中第635位脱氧核糖核苷酸是A还是T，第1607位脱氧核糖核苷酸是T还是C，第12624位脱氧核糖核苷酸是T还是G，确定所述奶牛在这三个位点的单倍型组合，然后通过单倍型组合确定乳腺炎抗性性状。为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案一种筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点，所述SNP位点为奶牛HSTN基因第635位、 第1607位和第12624位碱基，奶牛HSTN基因第635位为A/T、第1607位为T/C和第12624 位为T/G。所述筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点可以应用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛试剂盒。一种筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，为提取奶牛基因组DNA，测定奶牛HSTN基因第 635位、1607位和12624位碱基多态性，根据奶牛第635位、1607位和12624位的单倍型组合预测奶牛的乳腺炎抗性当奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位基因单倍型组合为H2H2 (ATG/ATG)基因型时，奶牛乳腺炎抗性最强；当奶牛HSTN基因第635位、1607位和 12624位基因单倍型组合为H3H7 (TTCCTG)时，奶牛的乳腺炎抗性最差。所述单倍型组合按照如下方法确定如果自GenBank Accession No. NC_007304. 5 (88288094-88302412)中第635位脱氧核糖核苷酸是A，其纯合体的基因型为AA ;如果第 635位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT ;它们的杂合体基因型为AT。如第1607 位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT ;如第1607位脱氧核糖核苷酸是C，其纯合体的基因型为CC ;它们的杂合体基因型为TC。如第12624位脱氧核糖核苷酸是T，其纯合体的基因型为TT ;如第12624位脱氧核糖核苷酸是G，其纯合体的基因型为GG ;它们的杂合体基因型为TG。三位点组合后其单倍型组合有27种情况，即H5H5 (AACCGG)、H5H6 (AACCTG)、 H6H6 (AACCTT)、H2H5 (AATCGG)、H4H5 (AATCTG)、H4H6 (AATCTT)、H2H2 (AATTGG)、 H2H4 (AATTTG)、H4H4 (AATTTT)、H5H7 (ATCCGG)、H3H5 (ATCCTG)、H3H6 (ATCCTT)、 H2H7 (ATTCGG)、H4H7 (ATTCTG)、H3H4 (ATTCTT)、H2H8 (ATTTGG)、H4H8 (ATTTTG)、 H1H4 (ATTTTT)、H7H7 (TTCCGG)、H3H7 (TTCCTG)、H3H3 (TTCCTT)、H7H8 (TTTCGG)、 H1H7(TTTCTG)、H1H3(TTTCTT)、H8H8(TTTTGG)、H1H8(TTTTTG)、HlHl(TTTTTT)。一种筛选乳腺炎抗性奶牛的引物，具有序列表SEQ ID NO. 4,SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6,SEQ ID NO. 7,SEQ ID NO. 8和SEQ ID NO. 9所示的碱基序列；所述引物可以特异性扩增出含HSTN基因的SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示序列。一种筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，所述试剂盒为100头牛检测剂量，试剂盒的保存温度为_20°C，试剂盒的组成如下lOOymol/L 的上游引物 20μ L ;ΙΟΟμπιοΙ/L 的下游引物 20μ L ;2 X Taq PCR MasterMix ImL ；ddH20 I. 2mL ；所述上游引物和下游引物具有序列表SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、 SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 9 所示的碱基序列。所述试剂盒中还包括识别HSTN基因中第635位、1607位和12624位突变的限制性内切酶。所述的突变选择以下单核苷酸多态性
635 位 A — T ；1607 位 T — C ；12624 位 T — G ;其中，核苷酸位置编号基于NC_007304. 5 (88288094-88302412)。本发明提出了 HSTN基因第635位、1607位和12624位SNP碱基位点用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒的新应用，在实际应用中，本发明确定的乳腺炎抗性性状可作为奶牛育种的辅助选择标记。H2H2 (AATTGG)单倍型组合个体的乳腺炎抗性高于其他单倍型组合个体。本发明还提供了一种奶牛乳腺炎抗性基因HSTN单倍型组合筛选方法，包括如下步骤(I)采集奶牛颈静脉血液，ACD抗凝，利用常规的苯酚/氯仿抽提法提取基因组 DNA，DNA样品被稀释成50ng/ μ L备用。(2)检测扩增产物中是否存在以下单核苷酸多态性635 位 A — T ；1607 位 T — C ；12624 位 T — G ;其中，核苷酸位置编号基于GenBank索引号NC_007304. 5 (448053-453004)。(3)针对635位点EcoRI单核苷酸多态位点A/T，设计奶牛HSTN基因特异性引物， 进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID NO :1所示)的扩增产物I ;所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO :4和序列表SEQ ID NO :5所示的序列，所述的扩增产物 I长度为933bp。(4)针对1607位点Hind III单核苷酸多态位点T/C，设计奶牛HSTN基因特异性引物，进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID NO 2所示)的扩增产物2 ;所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO 6和序列表SEQ ID NO 7所示的序列，所述的扩增产物2长度为278bp。(5)针对12624位点TaqI单核苷酸多态位点T/G，设计奶牛HSTN基因特异性引物， 进行PCR反应，得到特定片段(如序列表SEQ ID N0:3所示)的扩增产物I ;所述的基因特异性引物具有如序列表SEQ ID NO :8和序列表SEQ ID NO :9所示的序列，所述的扩增产物 I长度为849bp。(6)检测扩增产物I的EcoRI单核苷酸多态位点A/T、扩增产物2的Hind III单核苷酸多态位点τ/c的多态性和扩增产物3的TaqI单核苷酸多态位点T/G的多态性限制性内切核酸酶EcoRI酶切所述扩增产物，若得到933bp片段，其基因型为AA纯合体；若得到 933bp、532bp和401bp三个酶切片段时，其基因型为AT杂合体；若得到532bp和401bp片段，其基因型为TT纯合体。限制性内切核酸酶Hind III酶切所述扩增产物，若得到278bp片段时，其基因型为TT纯合体；若得到278bp、261bp和17bp片段，其基因型为TC杂合体；若得到261bp、和17bp片段时，其基因型为CC纯合体。限制性内切核酸酶TaqI酶切所述扩增产物，若得到849bp片段时，其基因型为TT纯合体；若得到849bp、541bp和308bp片段，其基因型为TG杂合体；若得到541bp和308bp片段时，其基因型为GG纯合体。(7)构建单倍型，针对扩增产物的多态性用统计分析的方法共分离鉴定出27种单倍型组合H5H5 (AACCGG)、H5H6 (AACCTG)、H6H6 (AACCTT)、H2H5 (AATCGG)、H4H5 (AATCTG)、 H4H6 (AATCTT)、H2H2(AATTGG)、H2H4(AATTTG)、H4H4(AATTTT)、H5H7(ATCCGG)、 H3H5(ATCCTG)、H3H6(ATCCTT)、H2H7(ATTCGG)、H4H7 (ATTCTG)、H3H4 (ATTCTT)、 H2H8(ATTTGG)、 H4H8(ATTTTG)、 H1H4(ATTTTT)、 H7H7(TTCCGG)、 H3H7(TTCCTG)、H3H3(TTCCTT)、 H7H8(TTTCGG)、 H1H7(TTTCTG)、 H1H3(TTTCTT)、 H8H8(TTTTGG)、 H1H8 (TTTTTG) ,HlHl (TTTTTT)。对于本领域普通技术人员来说，单倍型的构建方法可以根据需要而改变，只要适合检测本发明的单倍型即可。本发明的积极效果为(I)在奶牛HSTN基因635位、1607位和12624位鉴定出3个突变位点，并分离鉴定出一个单倍型组合H2H2，经国际基因组数据库和文献专利检索，证明为新的SNP和单倍型组合。(2)经将上述的单倍型组合与奶牛群736头中国荷斯坦牛个体的乳腺炎抗性性状进行相关性分析，新分离鉴定出的一个单倍型组合H2H2 (ATG/ATG)与奶牛乳腺炎抗性性状显著相关，可以用于奶牛的早期筛选，从而减低饲养成本，增加产品的附加值。(3)所发明的试剂盒可用于早期检测以提高检测效率，降低检测成本。
图I :奶牛HSTN基因635位突变扩增产物经EcoRI酶切结果。图2 :奶牛HSTN基因1607位突变扩增产物经Hind III酶切结果。图3 :奶牛HSTN基因12624位突变扩增产物经TaqI酶切结果。
具体实施例方式本发明针对中国荷斯坦牛HSTN基因进行了深入的研究，发现3个新的SNPs位点， 针对这3个SNPs位点组成的单倍型进行分析，其中统计分析结果显示，奶牛HSTN基因的单倍型组合H2H2(ATG/ATG)与奶牛乳腺炎抗性性状显著相关。因此这个单倍型组合可作为检测奶牛乳腺炎抗性性状的特异性单倍型组合，用于奶牛的标记辅助选种和选配。在此基础上完成了本发明。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如 Sambrook 等人，分子克隆实验手册(New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例I单倍型组合及突变位点的确定本发明采用PCR测序和PCR-RFLP技术对奶牛HSTN基因突变进行筛查，通过酶切电泳条带及测序结果比对，确定了 635位、1607位和12624位3个突变位点。利用Shesis 软件构建单倍型。I. I采集奶牛颈静脉血液(本发明所使用的荷斯坦牛颈静脉血液取自山东省规模化牛场，包括济南佳宝、青岛一牧等，即本发明所用血样的直接来源和原始来源)，ACD抗凝，利用常规的苯酚/氯仿抽提法提取基因组DNA，DNA样品被稀释成50ng/ μ L备用。实验牛共500头，来自山东省内的规模化奶牛场。1.2引物设计根据Genbank 登陆号为 NC_007304. 5 (88288094-88302412)的 HSTN 的基因序列 (14319bp),用Primer Premier5. O软件设计引物,所设计引物的序列、扩增产物的片段长度见表I。5/8页 表I PCR扩增所用的引物
引物编号序列(5' -3')起止位置长度
权利要求
1.一种筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点，其特征在于所述SNP位点为奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位碱基，所述奶牛HSTN基因第635位为A/T，第1607位为T/C， 第12624位为T/G。
2.权利要求I所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛试剂盒的应用。
3.一种筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，其特征在于提取奶牛基因组DNA，测定奶牛HSTN 基因第635位、1607位和12624位碱基多态性，根据奶牛第635位、1607位和12624位的单倍型组合预测奶牛的乳腺炎抗性。
4.根据权利要求3所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，其特征在于所述奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位基因单倍型组合为H2H2 (AATTGG)时，奶牛的乳腺炎抗性最强。
5.根据权利要求3所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的方法，其特征在于所述奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位基因单倍型组合为H3H7 (TTCCTG)时，奶牛的乳腺炎抗性最差。
6.一种筛选乳腺炎抗性奶牛的引物，其特征在于所述引物具有序列表SEQ ID NO. 4、 SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 9 所示的碱基序列。
7.根据权利要求6所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的引物，其特征在于所述引物可以特异性扩增出含HSTN基因的SEQ ID NO. I、SEQ ID NO. 2和SEQ ID NO. 3所示序列。
8.权利要求6或7所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的引物用于制备筛选乳腺炎抗性奶牛试剂盒的应用。
9.一种筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，其特征在于所述试剂盒为100头牛检测剂量， 试剂盒的保存温度为_20°C，试剂盒包括100 μ mol/L的上游引物20 μ L ;100ymol/L的下游引物20 μ L ；2XTaq PCR MasterMix ImL ；ddH20 I. 2mL ；所述上游引物和下游引物具有序列表SEQ ID NO. 4、SEQ ID NO. 5、SEQ ID NO. 6、SEQ ID NO. 7、SEQ ID NO. 8 和 SEQ ID NO. 9 所示的碱基序列。
10.根据权利要求9所述的筛选乳腺炎抗性奶牛的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括识别HSTN基因中第635位、1607位和12624位突变的限制性内切酶。
全文摘要
本发明公开了一种筛选乳腺炎抗性奶牛的SNP位点及检测方法，所述SNP位点为奶牛HSTN基因第635位、1607位和12624位碱基。通过提取奶牛的基因组DNA，测定奶牛HSTN基因单倍型组合，预测奶牛的乳腺炎抗性HSTN基因单倍型组合为H2H2(AATTGG)时，奶牛的乳腺炎抗性最强；HSTN基因单倍型组合为H3H7(TTCCTG)时，奶牛的乳腺炎抗性最差。本发明的优点是首次阐明了HSTN基因3个多态性位点组合与奶牛乳腺炎抗性的相关性，提供了一种预测奶牛乳腺炎抗性的方法，还提供了用于该方法的试剂盒，为奶牛的标记辅助选种和选配提供了新的分子标记方法。
文档编号C12N15/11GK102604944SQ20121009976
公开日2012年7月25日 申请日期2012年4月6日 优先权日2012年4月6日
发明者仲跻峰, 侯明海, 张燕, 李建斌, 李秋玲, 王长法, 鞠志花, 黄金明, 齐超 申请人:山东省农业科学院奶牛研究中心