人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术检测领域，具体涉及一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测 试剂盒及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 炭疽杆菌(Bacillus anthraci)属于芽孢杆菌属，是人畜共患急性传染病炭疽的 病原体。人和动物通过直接或间接接触炭疽杆菌引起皮肤、肺或肠道感染，常并发败血症。 牛羊的发病率最高，人常因屠宰、食用或与病死畜接触而感染。炭疽杆菌具有很强的致病 性、传染性和生存能力，是高致病性病原微生物，而且能够以芽孢形式长期保持生命力，一 度是制造最具有杀伤力的生物武器的病原体，对社会公共卫生和经济发展的危害巨大。
[0003] 炭疽杆菌的传统检测方法通常包括染色镜检、分离培养、免疫学诊断、生理生化试 验等。其中广泛使用的是免疫学诊断方法，但抗原和抗体的非特异性结合会导致免疫学检 测结果的假阳性率较高而检测灵敏度较低。分离培养鉴定的结果准确性好，但实验过程繁 琐，检测周期较长，不能适应现代公共卫生机构快速反应体系的需要。随着分子生物学技术 的发展，基于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)原理的检测技术，针对炭 疽杆菌特异基因进行扩增和检测，数小时内即可获得检测结果，而且在检测的特异性和灵 敏度上均有较大提高，因而受到许多研究者的青睐。普通的PCR法检测方法每次只能检测一 个基因，效率较低；用凝胶电泳对扩增产物进行分析时，容易造成污染。多重荧光PCR方法可 在一次反应中检测多个基因，节约了时间和成本;用仪器来识别荧光信号，提高了检测灵敏 度，减少了人工误差;在扩增反应过程中对荧光信号进行实时检测，全程封闭进行，大大降 低了样本间交叉污染的风险。
[0004] 线粒体DNA是一种共价闭合环状DNA分子。在高等哺乳动物的单个细胞中，线粒体 DNA分子的数量在数百乃至上万个。线粒体基因遗传稳定，进化速度快，不同物种间差异显 著，常用作分子进化和系统发生学的遗传标记。根据人特异性的线粒体DNA保守区域设计引 物进行PCR扩增，可以检测人源细胞的存在。由于线粒体基因的高拷贝特性，此方法具有很 高的灵敏度，可以在复杂样本中检测出含量极少的人源细胞。
【发明内容】
[0005] 针对传统检测手段中所存在的问题，本发明的目的在于提供一种人源基因、炭疽 杆菌快速联检检测试剂盒及其制备和应用。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明的第一方面，提供一种人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒，所述试剂 盒中包括炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，所述炭疽杆菌基 因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID N0.2 所示的下游引物，炭疽杆菌基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示;所述人线粒体 基因检测引物包括核苷酸序列如SEQ ID N0.4所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示的下游引物，所述人线粒体基因检测探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示;所述 炭痕杆囷基因检测探针和人线粒体基因检测探针上标记有9?光报告基团和9?光泮灭基团。
[0008] 优选地，所述炭疽杆菌基因检测探针和人线粒体基因检测探针的5'端标记有荧光 报告基团，3'端标记有焚光淬灭基团。
[0009] 进一步优选地，所述炭疽杆菌基因检测探针5'端标记的荧光报告基团为FAM荧光 基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-1。
[0010] 进一步优选地，所述人线粒体基因检测探针5'端标记的荧光报告基团为CY5荧光 基团，3'端标记的荧光淬灭基团为BHQ-3。
[0011] 本发明的试剂盒采用多重荧光PCR技术在单管中同时进行炭疽杆菌基因、人线粒 体基因检测，根据扩增及检测情况可分析判断炭疽杆菌感染情况。因此，引物及探针的设计 是本发明试剂盒的关键。
[0012] 基于本发明所述试剂盒是采用多重荧光PCR技术来进行检测的，所以试剂盒中还 可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：dNTP、MgCl 2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿 嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH20)等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用 试剂均可经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可 以根据客户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。
[0013] 所述PCR反应体系中，引物、探针、dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧 啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH20)均为常见组分，其含量亦为常规。
[0014] 所述PCR反应体系可自行配置，也可直接以市售的不含引物及探针的通用PCR反应 液加入引物及探针获得。例如，所述试剂盒中还可以含有dNTP、MgCl 2、PCR缓冲液、Taq DNA 聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH20)。加入本发明的引物及探针、待检样本即可获 得PCR反应体系。
[0015] 所述试剂盒中还可含有阳性对照。所述阳性对照为含有炭疽杆菌特异性扩增片段 的质粒或含有人线粒体基因特异性扩增片段的质粒。
[0016] 优选地，炭疽杆菌特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所示。
[0017] 优选地，人线粒体基因特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0018] 所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为PCR反应缓冲液、无菌水(ddH20)、 生理盐水等。
[0019] 本发明的第二方面，提供了前述人源基因、炭疽杆菌快速联检检测试剂盒的使用 方法，包括如下步骤：
[0020] (1)提取样品基因组DNA;
[0021] (2)加样：将样品基因组DNA、阳性对照或阴性对照分别加入装有PCR反应体系的 PCR管中，获得对应的样品反应管、阳性反应管或阴性反应管，所述PCR反应体系中含有前述 炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针；
[0022] (3 )PCR反应:反应管置于PCR仪上，设置循环参数，进行PCR反应；
[0023] (4)PCR反应结束后，分析结果。
[0024]步骤(1)中，提取样品基因组DNA为现有技术。
[0025]优选地，步骤(3)中，PCR反应的条件设置为：（a)94°C 2min;(b)94°C 2min;(c)93 °C 5sec;(d)60°C 30sec;步骤(c)-(d)循环40次。
[0026] 本发明的第三方面，提供了前述试剂盒在制备炭疽杆菌检测产品中的用途。
[0027] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0028] 本发明采用多重荧光PCR法，设计了炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因 检测引物及探针，可以在单个PCR反应管中同时检测2个基因，能够准确地检测炭疽杆菌的 存在以及毒力强弱，缩短了实验周期，提高了检测效率，为及时检测并诊断炭疽杆菌感染情 况提供了有力工具。
[0029] 本发明所采用的荧光PCR检测方法灵敏度高，最低检出限为lX103c〇py/ml，所用 引物和探针均基于GenBank公共数据库中序列设计，特异性好;操作简便，无需对PCR产物进 行额外处理。PCR扩增和荧光检测在同一反应管中进行，全程处于封闭状态，大大降低了样 本间交叉污染和环境污染的风险。可直接对各种样本进行检测，无需富集培养。
【附图说明】
[0030] 图1:不同浓度的待检阳性对照样品PA-1~PA-5 (1~5)在荧光检测过程中均为阳 性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到1 X l〇3copy/ml。
[0031] 图2:不同浓度的待检阳性对照样品MT-1~MT-5 (6~10)在荧光检测过程中均为阳 性，阴性对照组11的检测结果为阴性，表明试剂盒检测目标基因的灵敏度最高能达到IX 10 3copy/ml〇
[0032] 图3:各样本的扩增曲线。
【具体实施方式】
[0033] 在进一步描述本发明【具体实施方式】之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下 述特定的具体实施方案;还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体 实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0034] 当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端 点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和 科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、 材料外，根据本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本 发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实 现本发明。
[0035]实施例1试剂盒的制备
[0036] 分别合成炭疽杆菌基因检测引物及探针、人线粒体基因检测引物及探针，其核苷 酸序列如下表1所示：
[0037] 表 1
[0038]
[0039] 上述各组引物对及探针可单独包装，也可以组合配成多重荧光PCR检测混合液。所 述多重荧光PCR检测混合液中，上述各引物及探针的量采用本领域技术人员所知悉的常规 用量即可。
[0040] 也就是说，本发明的试剂盒，可以是含有上述独立包装的各组引物对及探针，也可 以是含有配置好的含有各组引物对及探针的多重荧光PCR检测混合液。
[0041 ] 进一步地，所述试剂盒还可以含有dNTP、MgCl2、PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、尿嘧 啶-N-糖基化酶、无菌水(ddH20)、样品基因组DNA提取试剂等试剂。
[0042] 采用本发明试剂盒进行检测时，质量控制标准如下：
[0043]
[0044]检测结果分析参照如下：
[0045]
[0046]
[0047] 实施例2试剂盒的灵敏度评价
[0048] 实验目的：确定本发明（实施例1)多重荧光PCR试剂盒的检出限(最低检测浓度）
[0049] 实验方法：
[0050] 1.阳性对照品的准备：
[0051 ]构建含有炭疽杆菌特异性扩增片段的炭疽杆菌pagA质粒作为阳性对照品。炭疽杆 菌pagA质粒的构建方法包括步骤：
[0052] 采用PCR法对炭疽杆菌样本的DNA进行扩增，引物序列如SEQ ID N0.1-2所示，获得 目的区域的核酸片段;将扩增获得的片段纯化后，以TA克隆的方法连接至pGEM-T载体上;经 测序鉴定，连接成功的重组T载体转化DH5_a细胞，扩增，获得炭疽杆菌pagA质粒。
[0053]其中，炭疽杆菌特异性扩增片段的核苷酸序列如SEQ ID N0.7所述，具体为：
[0054] GCAACTAACATATATACTGTATTAGATAAAATCAAATTAAATGCAAAAATGAATATTTTAATAAGAGATAAACGTTT TCATTATGATAGAAATAACATAGCAGTTGGGGCGGATGAGTCAGTAGTTAAGGAGGCTCATAGAGAAGTAATTAATT CGTC〇
[0055] 构建含有人线粒体基因特异性扩增片段的人线粒体基因质粒作为阳性对照品。人 线粒体基因质粒的构建方法包括步骤：
[0056] 采用PCR法对人DNA样本进行扩增，引物序列如SEQ ID N0.4-5所示，获得目的区域 的核酸片段;将扩增获得的片段纯化后，以TA克隆的方法连接至pGEM-T载体上;经测序鉴 定，连接成功的重组T载体转化DH5-a细胞，扩增，获得人线粒体基因质粒。
[0057]其中，人线粒体基因特异性扩增片段