一种检测猪伪狂犬野毒的方法、引物及试剂盒的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种检测猪伪狂犬野毒的方法，具体地，涉及一种用巢式PCR检测猪 伪狂犬野毒的方法、引物以及试剂盒。
【背景技术】
[0002] 伪狂犬病（Pseudorabies，PR)又名奇痒症、奥叶基氏病，病原为疱疹病毒科的伪 狂犬病病毒（Pseudorabies Virus，PRV)。临床上多以发热和神经症状为特征。该病已成 为危害全球养猪业最严重的疫病之一。妊娠母猪发生流产、产死胎和木乃伊胎；伪狂犬病病 毒先天感染或早期感染引起哺乳仔猪的神经症状和高死亡率；对于保育猪和育肥猪，伪狂 犬病毒是呼吸系统疫病综合征（PRDC)的重要病原，引起其呼吸系统症状和生长迟缓。
[0003] PRV具有疱疹病毒科病毒的共同特性，即动物一旦被其感染，病毒可在动物体内 呈长期潜伏感染状态，可在体内存活数年甚至终生，且难以清除。有时，在受到体内或外 界因素的刺激后，病毒还可被重新激活而排毒传播。PRV的主要感染部位(包括潜伏感染） 为脑等神经组织，动物发病时亦可呈现多组织分布，如肺脏、淋巴结、脾脏、肾脏等。
[0004] 免疫接种是防治伪狂犬病的主要策略。目前市场上使用的猪伪狂犬（PR)疫苗绝 大多数缺失gE基因，如gE基因缺失的Bartha-K61株弱毒疫苗。而野生毒株含有gE基因， 因此通过对样品中PR gE基因的检测，可以用以判定是否存在猪伪狂犬野毒感染。
[0005] 目前对猪伪狂犬病毒的检测多基于gD、gB等基因的通用检测，如国家标准（GB/ T18641-2002)，该方法无法区分野毒和疫苗毒；或基于gE基因的野毒鉴别检测。这两种方 法目前均采用一对引物进行单轮扩增。实际应用中，因为目前采用基于PRV gE基因的单轮 PCR扩增，仅为一次基因扩增，发现普通PCR方法存在敏感性较低，而且在临床发病猪或潜 伏感染猪在缺少脑组织样品的情况下，PRV的检出率较低，容易造成检测结果的假阴性，从 而对临床诊断造成误导，延误疫病防控时机。
【发明内容】
[0006] 为解决上述问题，本发明采用巢氏PCR的方法，设计2对引物进行两轮扩增，本发 明的方法大大提高检测的灵敏性和准确性，解决了现有猪伪狂犬野毒PCR检测方法敏感性 较低、对扁桃体、肺脏、肾脏等非神经组织样品检出率低等问题，能对疾病做出及时和正确 诊断，有利于疫病的有效防控。
[0007] 本发明的主要目的在于提供一种检测猪伪狂犬野毒的方法，所述方法包 括：（1)提取待测样品DNA; (2)使用外引物组与内引物组对所述分离的DNA进行 巢式PCR，所述外引物组的上游引物序列为：5' -AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3'，所 述外引物组的下游引物序列为：5 ' -TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3 '，所述内引物组的上 游引物序列为：5 ' -GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3 '，所述内引物组的下游引物序列为： 5 ' -GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3 ' ；（ 3 )对所述步骤（2 )的所述巢式PCR后的产物进行电泳分 析，所述扩增片段为240bp的对应的所述组织样品为阳性，即感染有猪伪狂犬野毒。
[0008] 优选地，所述步骤（1)中所述样本包括猪脑组织、扁桃体、淋巴结、肾脏和肺脏，或 流产胎儿，病猪血样，组织细胞培养物。
[0009] 优选地，所述步骤（1)中DNA浓度彡3. 31 X KT7Iig/ μ 1。
[0010] 优选地，所述步骤（2)中使用外引物组的PCR条件为：95°C预变性3min ;95°C 30s， 58°C退火 50s，72°C 延伸 50s，35 个循环；72°C 延伸 5min。
[0011] 优选地，所述步骤（2)中使用内引物组的PCR条件为：95°C预变性3min ;95°C 30s， 60°C退火 40s，72°C 延伸 40s，35 个循环；72°C 延伸 5min。
[0012] 本发明的另一目的在于提供一种检测猪伪狂犬野毒的DNA引物，所述DNA引物包 括外引物组和内引物组，所述外引物组的上游引物序列为 ：
[0013] 5 ' -AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3 '，
[0014] 所述外引物组的下游引物序列为：
[0015] 5, -TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3,，
[0016] 所述内引物组的上游引物序列为：
[0017] 5, -GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3,，
[0018] 所述内引物组的下游引物序列为：
[0019] 5，-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3，。
[0020] 本发明的再一目的在于提供一种检测猪伪狂犬野毒的试剂盒，所述试剂盒包括所 述的外引物组和内引物组。
[0021] 本发明另一方面提供了一种PRV野毒巢氏PCR检测试剂盒，包括上述引物组。外 引物组与内引物组的设计是本发明试剂盒的关键。基于试剂盒采用的是巢式PCR技术来进 行检测的，所以试剂盒中还可以包括其他一些PCR所需要的常规试剂，如：Taq酶、PCR反应 缓冲液、MgCl 2、dNTPs等常用PCR反应试剂中的一种或多种。由于此类PCR常用试剂均可 经市场途径单独购得或者自行配置，因此具体需要将哪些试剂装配入试剂盒，可以根据客 户实际需要配置，为方便起见，也可全部装配入试剂盒。所述试剂盒中还含有阳性对照。阳 性对照含有PRV的gE基因序列，可为含有PRV的gE基因序列的质粒，也可根据现有技术自 行构建。
[0022] 所述试剂盒中还可含有阴性对照。阴性对照可为各种不含有PRV gE基因序列的 溶液，如PCR缓冲液、无菌水、生理盐水等。
[0023] 优选地，所述试剂盒进一步包括Taq酶、PCR反应缓冲液、MgCl2、dNTPs，以及含有 PRV的gE基因序列的阳性对照，和不含有PRV gE基因序列的阴性对照。
[0024] 本发明中试剂盒的使用方法为常规方法，包括下列步骤：
[0025] 1.样本DNA的提取；2.分别以步骤1提取的DNA为模板，外引物组为引物进行第 一轮PCR扩增；再分别以第一轮PCR的扩增产物为模板，内引物组为引物进行第二轮PCR扩 增；3.将第二轮PCR扩增产物上电泳，根据电泳扩增条带情况判断是否为PRV野毒。
[0026] 本发明的又一目的在于提供所述方法在检测猪伪狂犬野毒方面的应用。
[0027] 本发明的还一目的在于提供所述的引物、所述的试剂盒在检测猪伪狂犬野毒方面 的应用。
[0028] 本发明的有益效果：
[0029] 1)本发明提供了一种PRV野毒检测的PCR方法，该方法具有很高的灵敏度和检测 准确性，有效降低实验室检测的假阴性，提高疫病诊断的准确性。
[0030] 2)本法在实践中用于疑似PRV发病猪的诊断时，不采集脑等神经组织，以扁桃体、 肺脏、淋巴结和肾脏混合样品可用来检测确诊。
【附图说明】
[0031] 图1为使用本发明外引物组选择PCR最佳退火温度的实验电泳结果，其中，泳道M 为Marker(DL2000,购自天根生化科技(北京)有限公司），泳道1~4分别为退火温度56°C、 58°C、60°C、62°C时的扩增结果；
[0032] 图2为使用本发明内引物组选择PCR最佳退火温度的实验电泳结果，其中，泳道M 为Marker (DL2000)，泳道1~4分别为退火温度56°C、58°C、60°C、62°C时的扩增结果；
[0033] 图3为本发明巢氏PCR的敏感性试验的实验电泳结果，其中，泳道M为Marker (DL2000)，泳道 1-10 分别是 PRV DNA 模板浓度分别为 3. 31 X l〇-1Qng/ μ 1、3· 31 X l(T9ng/ μ 1、3· 31 X l(T8ng/ μ 1、3· 31 X l(T7ng/ μ 1、3· 31 X l(T6ng/ μ 1、3· 31 X l(T5ng/ μ 1、 3· 31X10_4ng/y 1、3· 31X10_3ng/y 1、3· 31X10_2ng/y 1、3· SlXlO-bg/y 1 时的PCR 电泳结 果。
[0034] 图4为巢氏PCR的特异性试验的实验电泳结果，其中，泳道M为Marker(DL2000)， 泳道 1-7 分别为 CSFV 的 cDNA、PRRSV 的 cDNA、JEV 的 cDNA、PPV 的 DNA、PCV2 的 DNA、灭菌水 对照、猪伪狂犬野毒的DNA为模板时的PCR电泳结果。
【具体实施方式】
[0035] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述更 为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人 员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进 行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0036] 实施例1巢氏PCR体系的建立及条件的优化
[0037] 1、引物设计与合成
[0038] 以GenBank公布的猪伪狂犬病毒gE基因为参照序列（Genbank登录号AY170318)， 用Primer Premier5. 0软件设计出2对引物，预计第1轮扩增片段为826bp，第2轮扩增片 段为240bp。引物的序列如下：
[0039] 外引物组的上游引物 Pl :5' -AACTTTACTGCCACGCTGGACTG-3'
[0040] 外引物组的下游引物 P2 :5' -TCGTCGCTGCTGAACTCGTC-3'
[0041] 内引物组的上游引物 P3 :5' -GCCGAGTACGTCACGGTCATC-3，
[0042] 内引物组的下游引物 P4 :5，-GCACAGCACGCAGAGCCAGA-3，
[0043] 引物由Introvigen生物技术公司合成。
[0044] 2、病毒核酸提取
[0045] 按QIAGEN公司试剂盒说明书操作进行
[0046] 1)取20 μ L蛋白酶K(proteinase K)加入I. 5mL灭菌离心管中；
[0047] 2)加入猪伪狂犬野毒，混匀，若体积小于200 μ L，用PBS补足；若需无 RNA的DNA， 再加入 4yL Rnase A(100mg/mL);
[0048] 3)分别加入200 μ L BufferAL，充分振荡混匀15s ;
[0049] 4)分别放入56°C水浴lOmin，使样品充分消化，然后瞬时离心；
[0050] 5)分别加入200 μ L无水乙醇（96% -100% )，充分振荡混匀15s，瞬时离心；
[0051] 6)将混合物（包括沉淀）分别小心转移至带有2mL回收管的粉色QIAamp Mini Spin columns (以下简称 column)，8000rmp 离心 lmin，弃液；
[0052] 7)分别向column中加入500 μ L Buffer