生物产品的制作方法

生物产品的制作方法
【专利说明】生物产品
[00011 本申请是2009年9月25日提交的同名发明专利申请200980137520.4的分案申请。
[0002] 本发明涉及新的双特异性抗体融合蛋白质。所述抗体包含针对目的抗原的第一特 异性，和针对第二目的抗原(例如用于延长它们的体内血清半衰期的血清载体蛋白）的第二 特异性。还提供用于产生所述分子的方法和包含它们的药物组合物。
[0003] 抗体的高特异性和亲合性使得它们成为理想的诊断和治疗试剂，特别是用于调节 蛋白：蛋白相互作用。重组抗体技术领域的发展已导致抗体片段例如Fv、Fab、FablPF (ab'）2片段及其他抗体片段的产生。这些较小的分子保留了完整抗体的抗原结合活性并且 还可以呈现与完整免疫球蛋白分子相比改善的组织穿透和药物动力学性质。甚至，从最近 成功的产品（例如ReoPro?并且Lucentis?)来看，抗体片段经证明是多用途的治疗剂。 虽然此类片段显现出许多优于完整免疫球蛋白的优点，但它们也受累于增加的血清清除 率，因为它们缺乏赋予其体内长存在期的Fc结构域(Medasan等人，1997，J. Immunol. 158: 2211-2217)。
[0004]之前已经描述了具有双特异性的抗体，即其与两个不同的抗原结合(关于综述，参 见 Segal 等人，1999, Curr.Opin. Immunol · 11 : 558-562;Pliickthun&Pack，1997， Immunotechno1ogy，3:83-105;Fischer和Leger，2007，Pathobiology，74，3-14)。？002/ 02773、1^2007065440、1^2006257406、1]52006106203和1]52006280734中也描述了双特异性 抗体。之前的制备异-双特异性基于抗体的分子的方法通常使用化学交联或者蛋白质工程 技术。化学交联受累于异-和同二聚体形成的低产量以及它们随后的色谱分离的要求。蛋白 工程方法已经进行了非常详细的描述（例如knobs-into-holes engineering;Ridgway等 人，1996，Protein Eng.9(7) :617-621)或已经用于具有不适当的稳定性特征的分子(例如 双抗体(diabody)，scFv)。在一些情况下，双特异性抗体还可受累于空间位阻问题，其使得 两个抗原不能同时结合到各个抗体臂。
[0005] 单可变结构域抗体又名单域抗体或dAb，相当于抗体的重链(VH)或轻链(VL)的可 变区。Ward等人，1989，Nature，341，544-546已经描述了鼠单域抗体。也已经描述了人和〃骆 马它化（camelised)〃人单域抗体(Holt等人，2003，Trends in Biotechnology，21，484_490) 〇 也已经从骆驼(骆驼和美洲驼)和软骨鱼(斑纹须鲨和铰口鲨）中获得了单域抗体。这些生物 已经进化出高亲和力单V样结构域(骆驼中称为VhH，鲨鱼中称为V-NAR)，所述结构域装配到 Fc-等价恒定结构域构架作为它们的免疫系统的完整和重要的元件（关于综述，参见 Holliger&Hudson；2005,Nature Biotechnology,23(9):1126-1136)〇
[0006] EP0368684中已经描述了单域抗体-酶融合物，W02004/058820中也已经描述了单 域效应子群融合物，其包含单可变结构域。W02007/024715中已经描述了双可变结构域免疫 球蛋白。EP1517921中已经描述了包含具有不同特异性的两个单域抗体的双特异性配体。 [000 7]已知用于改进抗体片段例如Fv、Fab、Fab'、F(ab'）2及其他抗体片段的半衰期的方 法。一种方法将所述片段与聚合物分子缀合。因此，通过与聚乙二醇(PEG;参见，例如W098/ 25791、W099/64460和W098/37200)缀合改善动物中？&13'、？(313'）2片段的短的循环半衰期。 另一种方法通过与和FcRn受体相互作用的试剂缀合来修饰抗体片段（参见例如W097/ 34631)。另一个用于延长半衰期的方法使用结合血清白蛋白的多肽(参见例如Smith等人， 2001,Bioconjugate Chem.12:750-756；EP0486525；US6267964；W004/001064；W002/ 076489;和W001/45746)。然而，仍然需要产生具有长的体内半衰期的抗原结合免疫球蛋白， 作为具有长的半衰期的免疫球蛋白的替代物，因为它们与FcRn受体相互作用，不必通过与 PEG缀合或与人血清白蛋白缀合进行化学修饰。
[0008] 多种蛋白质存在于血浆中并且包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α?酸糖 蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白，或其任何片段。体内的血清载体蛋白循环具有以天 计的半衰期，例如对于甲状腺素结合蛋白，5天或对于转甲状腺素蛋白，2天(Bartalena& Robbins，1993，Clinics in Lab .Med. 13:583-598)，或碘化α?酸糖蛋白的周转的第二阶段， 65小时（Bree等人，1986, Clin. Pharma co kin · 11:336-342)。来自 Gitlin 等人（1964， J.Clin. Invest. 10:1938-1951)的数据表明孕妇中，α?酸糖蛋白的半衰期是3.8天，转铁蛋 白12天和纤维蛋白原2.5天。血清白蛋白是血管和血管外区室中丰富的蛋白，其在人体中具 有大约 19天的半衰期(Peters，1985，Adv Protein Chem. 37 :161-245)。这与IgGl的半衰期 (大约21天）相似（Waldeman&Strober，1969，Progr. Allergy，13:1-110) 〇
[0009] 本发明提供改进的双特异性抗体融合蛋白，其可以重组产生并且能够同时结合两 个抗原，特别是两个不同/相异抗原。
[0010] 因此，本发明提供双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对目的抗原的第一特异性 的免疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段），并且进一步包含具有对第二目的抗原的特异性 的单域抗体(dAb)，特别地其中第一抗原和第二抗原是不同的实体。
[0011] 如本文使用的，多价是指具有两个或多个结合位点例如两个或三个结合位点（例 如两个结合位点）的实体。各结合位点可以结合相同抗原上的相同表位或不同表位，或可以 结合不同（相异)抗原。
[0012] 本发明还提供双特异性抗体融合蛋白，其包含具有对目的抗原的第一特异性的免 疫球蛋白部分(例如Fab或Fab'片段），并且进一步包含至少一个具有对第二目的抗原的特 异性的单域抗体。
[0013] 本发明的双特异性抗体融合物将能够选择性地结合两个目的抗原。
[0014] 在一个实施方案中，第一和第二抗原是相同抗原。
[0015]在一个实施方案中，Fab或Fab'片段所结合的目的抗原可以是细胞相关蛋白，例如 细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿瘤细胞)上的细胞表面蛋白，或其可以 是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何医学上相关的蛋白，例如在疾病或感染期间上调的 那些蛋白，例如受体和/或它们相应的配体。细胞表面蛋白的具体实例包括粘着分子例如整 联蛋白例如β?整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P-选择蛋白或L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、 CD5、CD7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、 CD69、CD134(0X40)、IC0S、BCMP7、CD137、CD27L、CDCPl、DPCRl、DPCRl、dudulin2、FU20584、 FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、KIAA1455、LTBP2、LTK、MAL2、MRP2、连接素 样2、NKCC1、PTK7、RAIG1、TCAM1、SC6、BCMP101、BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原（CEA)、人乳脂 肪球蛋白（HMFG1和2)、MHC I类和MHC II类抗原、和VEGF，和当适当时，其受体。
[0016] 可溶性抗原包括白细胞介素（例如11^1、几-2、11^3、几-4、11^-5、几-6、11^-8、几- 12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原），免疫球蛋白（例如 IgE)，干扰素(例如干扰素 α、干扰素 β或干扰素 γ)，肿瘤坏死因子_α，肿瘤坏死因子_β，集落 刺激因子（例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生长因子(例如PDGF-α和PDGF-β)和当适当 时，其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原、细菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV、HepA、B 和C)、生物恐怖试剂、放射性核素和重金属、及蛇和蜘蛛毒和毒素。
[0017] 在一个实施方案中，本发明的抗体融合蛋白质可以用于功能性地改变目的抗原的 活性。例如，抗体融合蛋白质可以直接或间接地中和、诘抗或激动(agoni se)所述抗原的活 性。
[0018] 在一个实施方案中，被本发明的双特异性抗体融合蛋白中的单域抗体结合的第二 目的抗原可以是细胞相关蛋白，例如细胞(例如细菌细胞、酵母细胞、T细胞、内皮细胞或肿 瘤细胞)上的细胞表面蛋白，或其可以是可溶性蛋白。目的抗原还可以是任何医学上相关的 蛋白，例如在疾病或感染期间上调的那些蛋白，例如受体和/或它们相应的配体。细胞表面 蛋白的特别的实例包括粘着分子例如整联蛋白例如β?整联蛋白例如VLA-4、E-选择蛋白、P-选择蛋白或 L-选择蛋白、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CDlla、CDllb、CD18、CD19、CD20、CD23、 CD25、CD33、CD38、CD40、CD45、CDW52、CD69、CD134(0X40)、IC0S、BCMP7、CD137、CD27L、CDCP1、 DPCRl、DPCRl、dudulin2、FLJ20584、FLJ40787、HEK2、KIAA0634、KIAA0659、KIAA1246、 1(1八厶1455、1^8卩2、1^1(、]\^1^2、]\?^2、连接素样2、疆0：1、？1'1(7、1^161、1^厶11、5〇6、8〇10 3101、 BCMP84、BCMP11、DTD、癌胚抗原(CEA)、人乳脂肪球蛋白（HMFG1和2)、MHCI类和MHCII类抗 原、和VEGF，和当适当时，其受体。
[0019] 可溶性抗原包括白细胞介素（例如11^1、几-2、11^3、几-4、11^-5、几-6、11^-8、几-12、IL-16或IL-17)，病毒抗原(例如呼吸道合胞病毒或巨细胞病毒抗原），免疫球蛋白（例如 IgE)，干扰素(例如干扰素 α、干扰素 β或干扰素 γ)，肿瘤坏死因子_α，肿瘤坏死因子_β，集落 刺激因子（例如G-CSF或GM-CSF)和血小板源性生长因子(例如PDGF-α和PDGF-β)和当适当 时，其受体。其他抗原包括细菌细胞表面抗原、细菌毒素、病毒(例如流感病毒、EBV、HepA、B 和C)、生物恐怖试剂、放射性核素和重金属、及蛇和蜘蛛毒和毒素。
[0020] 可以被单域抗体结合的其他抗原包括血清载体蛋白，允许细胞介导的效应子功能 招募的多肽，和核素螯合蛋白。
[0021] 因此，在一个实例中本发明提供了双特异性抗体融合蛋白，所述蛋白包含具有针 对目的抗原的第一特异性的免疫球蛋白部分，并且进一步包含具有针对第二蛋白的特异性 的单域抗体，后者提供招募效应子功能的能力，例如补体途径激活和/或效应子细胞招募。 此外，本发明的融合蛋白可以用于通过与核素螯合蛋白结合的单域抗体螯合放射性核素。 此类融合蛋白用于成像或用于治疗的放射性核素靶向方法。
[0022] 因此，在一个实例中，提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含具有针对目的 抗原的特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与至少一个dAb融合，所述dAb具有针对招募 多肽的特异性，所述dAb通过与所述招募多肽结合，直接或间接地提供招募细胞介导的效应 子功能的能力。
[0023]可以直接招募效应子功能（effector function)，因为效应子功能与细胞相关，所 述细胞在它的表面上具有招募分子。当dAb与招募分子的结合引起例如可以直接或间接地 招募效应子功能或可以经由信号传导途径活化的因子的释放时，可发生间接招募。实例包 括丁陬€(、11^、11^、11^、11^7、正^、组胺、(^、调理素及经典的和可选择的补体活化级联的 其他成员，例如C2、C4、C3-转化酶，和C5至C9。
[0024] 如本文使用的，〃招募多肽〃包括Fc γ R(例如Fc γ RI、Fc γ RII和Fc γ RIII)、补体途 径蛋白（例如但不限于Clq和C3)、CD标志物蛋白（分化标志物群）（例如但不限于CD68、 0)115、0)16、0)80、〇083、0)86、0)56、0)64、0)3、0)4、0)8、0)28、〇045、0)19、0)20和0)22)。其 为CD标志物蛋白的其他招募多肽包括CDl，CDld，CD2，CD5，CD8，CD9，CD10，CDll，CDlla, CDllb，CDllc，CD13，CD14，CD15，CD16，CD18，CD19，CD20，CD21，CD22，CD23，CD24，CD25，CD26, CD27,CD28,CD29,CD30,CD31,CD32,CD33,CD34,CD35,CD36,CD37,CD38,CD40,CD43,CD44, CD45,CD46,CD49,CD49a,CD49b,CD49c,CD49d,CD52,CD53,CD54,CD55,CD56,CD58,CD59, CD61，CD62，D62E，CD62L，CD62P，CD63，CD64，CD66e，CD68，CD70，CD71，CD72，CD79，CD80， CD81，CD82，CD83，CD84，CD85，CD86，CD88，CD89，CD90，CD94，CD95，CD98，CD106，CD114， CD116,CD117,CD118,CD120,CD122,CD130,CD131,CD132,CD133,CD134,CD135,CD137, CD138,CD141,CD142,CD143,CD146,CD147,CD151,CD152,CD153,CD154,CD155,CD162, CD164, CD169, CD184, CD206, CD209, CD257, CD278, CD281, CD282, CD283 和 CD304，或保留直接 或间接地招募细胞介导的效应子功能的能力的任何其片段。招募多肽还包括具有效应子功 能的免疫球蛋白分子，例如IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgE和IgA。
[0025] 在一个实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是补体途径蛋白，特别优选的 是 Clq〇
[0026] 在优选实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是CD标志物蛋白，特别优选的 是CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、CD8、CD45、CD16 和CD35。
[0027]因此，还提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的 抗体片段，所述片段与至少一个dAb融合，所述dAb对选自CD68、CD80、CD86、CD64、CD3、CD4、 ⑶8、⑶45、⑶16和⑶35的⑶分子具有特异性。
[0028] 在一个实施方案中，单域抗体为具有第一特异性的免疫球蛋白部分提供延长的半 衰期。
[0029] 因此，在一个实施方案中，提供双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有 特异性的抗体Fab或Fab '片段，所述片段与至少一个单域抗体融合，所述单域抗体对血清载 体蛋白、循环免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特异性，所述单域抗体通过与所述血清载体 蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合，为对所述目的抗原具有特异性的抗体片段提 供延长的半衰期。
[0030] 在一个实施方案中，提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具 有特异性的抗体Fab或Fab '片段，所述片段与至少一个单域抗体融合，所述单域抗体对血清 载体蛋白、循环免疫球蛋白分子、或CD35/CR1具有特异性，所述单域抗体通过与所述血清载 体蛋白、循环免疫球蛋白分子或CD35/CR1结合，为对所述目的抗原具有特异性的抗体片段 提供延长的半衰期。
[0031] 如本文使用的，"血清载体蛋白"包括甲状腺素结合蛋白、转甲状腺素蛋白、α?酸糖 蛋白、转铁蛋白、纤维蛋白原和白蛋白、或任何其片段。
[0032]如本文使用的，〃循环免疫球蛋白分子〃包括IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、sIgA、Igi^P IgD、或任何其片段。
[0033] CD35/CR1是在红细胞上存在的蛋白，其半衰期为36天（正常范围为28至47天； Lanaro等人，1971，Cancer，28(3): 658-661) 〇
[0034] 在优选实施方案中，dAb对其具有特异性的第二蛋白是血清载体蛋白，特别优选的 是人血清载体蛋白。在非常优选的实施方案中，血清载体蛋白是人血清白蛋白。
[0035] 因此，提供了双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的抗原具有特异性的抗体Fab 或Fab '片段，所述片段与对人血清白蛋白具有特异性的至少一个单域抗体融合。
[0036] 在一个实施方案中，本发明提供分离的双特异性抗体融合蛋白质，其包含对目的 抗原具有特异性的抗体Fab或Fab'片段，所述片段与对人血清白蛋白具有特异性的至少一 个单域抗体融合。
[0037]在一个实施方案中，对目的抗原具有特异性的抗体片段是Fab片段。在另一个实施 方案中，对目的抗原具有特异性的抗体片段是Fab'片段。
[0038] 因此，在一个优选的实施方案中，本发明的抗体融合蛋白是翻译融合蛋白，即基因 融合物，其各个序列通过表达载体编码。可选地，已经使用化学方法（即通过化学缀合或化 学交联)来将抗体融合蛋白的组分融合。所述化学方法是本领域已知的。
[0039] 在一个实例中，抗体片段是具有天然或经修饰的绞链区的Fab'片段。当用于制备 本发明的双特异性抗体融合蛋白质的抗体片段是Fab'片段时，通常在重链的C末端将所述 片段延伸一个或多个氨基酸。因此，本发明的抗体融合物可以包括直接或经由连接体与dAb 翻译融合(或化学融合）的Fab'片段。此外，适当的抗体Fab'片段的实例包括W02005003170 和W02005003171中描述的那些。
[0040] 在另一个实例中，抗体片段是Fab片段。因此，本发明的抗体融合物可以包括与连 接体序列翻译融合(或化学融合）的Fab片段，所述连接体序列又与dAb翻译融合(或化学融 合）。优选地，Fab片段是以链间半胱氨酸终止的Fab片段，如W02005/003169中描述的。
[0041] 本发明中使用的抗体Fab或Fab'片段可以来自任何物种，优选来源于单克隆抗体、 人抗体，或是人源化片段。本发明所用的抗体片段可以来源于免疫球蛋白分子的任何种类 (例如IgG、IgE、IgM、IgD或IgA)或亚类并且可以从任何物种(包括例如小鼠、大鼠、鲨鱼、兔 子、猪、仓鼠、骆驼、美洲驼、山羊或人)获得。
[0042] 在一个实施方案中，抗体Fab或Fab'片段是单克隆、完全人、人源化或嵌合抗体片 段。在一个实施方案中，抗体Fab或Fab '片段是完全人的或人源化的。
[0043] 可以通过本领域已知的任何方法制备单克隆抗体，例如杂交瘤技术（Kohler& Milstein，Nature，1975，256，495_497)，三体杂交瘤技术，人B细胞杂交瘤技术(Kozbor等 人，Immuno 1 ogy Today，1983，4,72)和EBV-杂交瘤技术（Cole 等人，〃 Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy"，pp·77-96，Alan R.Liss，Inc·，1985)〇
[0044] 还可以使用单淋巴细胞抗体法，通过克隆和表达免疫球蛋白可变区cDNA产生本发 明使用的抗体，所述cDNA从选择用于产生特异性抗体的单淋巴细胞产生，通过例如 Babcook，J.等人，Proc.Natl .Acad. Sci .USA，1996,93(15)，7843-7848，W0 92/02551， W02004/051268 和 W02004/106377 描述的方法。
[0045] 人源化抗体是具有来自非人物种的一个或多个互补决定区（CDR)和来自人免疫球 蛋白分子的构架区的来自非人物种的抗体分子(参见例如US 5，585，089)。
[0046]还可以使用本领域已知的各种噬菌体展示方法产生本发明使用的抗体，并且此类 方法包括Brinkman 等人，J · Immunol .Methods，1995，182，41-50 ;Ames 等人， J. Immunol .Methods 1995,184,177-186;Kettleborough等人Eur · J· Immunol. , 1994, 24952-958;Persic等人，Gene，1997187，9-18;和Burton等人，Advances in Immunology， 1994,57a91-280；W0 90/02809；W0 91/10737；W0 92/01047；W0 92/18619；W0 93/11236； TO 95/15982和TO 95/20401;和US 5,698,426;5,223,409;5,403,484;5,580,717;5,427， 908；5,750,753；5,821,047；5,571,698；5,427,908；5,516,637；5,780,225；5,658,727；5, 733，743;和5，969，108中公开的方法。并且，转基因小鼠或其他生物(包括其他哺乳动物)可 以用来产生人源化抗体。
[0047] 完全人抗体是其中重链和轻链的可变区和恒定区（当存在时)全部为人来源，或与 人来源的序列（不必来自相同抗体)基本上同一的那些抗体。完全人抗体的实例可以包括例 如通过上述噬菌体展示方法产生的抗体和由其中鼠免疫球蛋白可变和/或恒定区基因已经 被它们的人对应物取代的小鼠生产的抗体(例如，EP0546073B1、US 5，545，806、US 5，569， 825、US 5,625，126、US 5,633,425、US 5,661，016、US5,770,429、EP 043847