一种嵌合Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种新型重组融合蛋白及其制备方法和应用，特别涉及一种嵌合了 Fc 受体的重组融合蛋白及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡 中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率 高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程 度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提 尚。
[0003] 大量研究表明，肿瘤在形成过程中，可通过多重机制，逃避免疫系统的监视，我们 将这一过程称之为肿瘤组织的免疫逃逸或免疫编辑。T细胞在肿瘤免疫的过程中处于核心 地位，如果能调动体内的杀伤武器，将是非常有效且安全的治疗策略。T细胞的活化启动和 效应发挥的过程中至少需要两种信号存在，第一种信号是抗原特异性的，由主要组织相容 性复合体（Major histocompatibility complex，MHC)以及与其结合的抗原肽被T细胞受 体（T cell reCeptor，TCR)识别并结合后，由TCR复合物向T细胞内传导激活信号；第二种 激活信号是抗原非特异性的，是由抗原递呈细胞（antigen presenting cell，APC)和T细 胞上多种辅助分子之间的配对和相互作用而提供的，能够提供第二种激活信号的一类T细 胞膜蛋白又被称为共刺激分子，在T细胞活化中发挥重要作用。
[0004] 随着肿瘤免疫学理论和技术的发展，免疫治疗在肿瘤治疗中的作用日益受到重 视。T淋巴细胞在肿瘤免疫应答中起主要作用，包括CIK(cytokine_induced killer)细 胞治疗在内的T细胞过继性细胞免疫治疗虽然在部分肿瘤中取得了一定的效果，但在大多 数肿瘤中疗效尚不能令人满意。近年来发展的利用基因改造技术表达肿瘤特异性嵌合抗 原受体（chimeric antigen receptor，CAR)的T细胞显示出持久的革巴向杀伤活性，为过继 性细胞免疫治疗注入了新的解决方案。CAR是将识别肿瘤相关抗原的ScFv(single-chain variable fragment，ScFv)单链抗体、跨膜区和能诱导T细胞活化的信号转导结构域在体 外进行基因重组，形成重组质粒，在体外通过慢病毒转染技术转染经纯化和大规模扩增后 的Τ细胞，稳定表达CAR的Τ细胞称之为CAR-T细胞。这种基因改造也可帮助Τ细胞直接 识别肿瘤而不必要求通过TCR来识别MHC-抗原肽的限制性。临床前和临床研究均显示 (Cancer Res 2010;70:9053-9061 ;Sci Transl Med 3,95ra73)，CAR-Τ 在体外及体内均有 对特定肿瘤抗原的高度亲和性及对抗原负荷细胞的高效杀伤性。
[0005] CAR-Τ细胞较其他基于T细胞的治疗方式存在以下优势：①使用患者自体细胞，降 低排异反应风险；②鉴于很多肿瘤细胞表达相同的肿瘤抗原，针对某一种肿瘤抗原的CAR 基因构建一旦完成，便可以被广泛利用；③CAR既可以利用肿瘤蛋白质抗原，又可利用糖 脂类非蛋白质抗原，扩大了肿瘤抗原靶点范围；④CAR-Τ细胞作用过程不受MHC的限制； ⑤CAR-Τ细胞具有免疫记忆功能，可以长期在体内存活。
[0006] 通常情况下，CAR包含一个用来识别肿瘤细胞表面抗原的胞外结构域，一个保证 抗原识别域具有一定自由度铰链区，一个跨膜结构域，以及一个或几个串联的胞内结构域/ 模体（motif)用以触发能导致T细胞活化的下游信号（Leukemia (2004) 18, 676 - 684)。大多 数CAR的抗原识别域是一种ScFv单链抗体，整合了单克隆抗体重链和轻链的可变区。许多 CAR的识别域来自抗体可变区，这可能被宿主的免疫系统识别并导致抗可变区片段的免疫 反应，这有可能限制体内过继性T细胞的持久性。最初CAR的胞内信号转导结构域/模体一 般仅含有CD3 ζ结构域，往往不能有效诱导T细胞的活化，但经过近十年的发展，新一代融 合了多种免疫共刺激分子（如CD28和4-1ΒΒ等）信号转导结构域的CAR能够充分诱导过继 性T淋巴细胞的增殖和效应活性（Molecular Therapy νο?. 17ηο· 8, 1453 - 1464aug. 2009)。 CD28分子在调节淋巴细胞生存和增殖方面有着重要作用，也对的效应功能和细胞记忆的建 立起着关键作用；这些作用的产生是由于募集如PI3K，Grb2和Lck之类的信号转导分子， 这些分子反过来调节关键转录因子如NF- κ B的活性，进而增加 IL-2和INF- γ的合成和分 泌。TNF受体超家族，如4-1ΒΒ，也为维持Τ细胞应答提供共刺激信号，在Τ细胞生存和⑶8+Τ 细胞的记忆维持中发挥关键作用；这类受体通过招募肿瘤坏死因子受体相关因子-1/2 (TNF receptor-associated factor 1/2，TRAF1)和下游的衔接子，激活下游的ΜΑΡΚ和NF-κΒ信 号途径。
[0007] 寻找完美的信号组合时，除了增加共刺激结构域，目前还有其他一些方法用于增 加 CARS的抗肿瘤活性。在最近的一项研究中，经基因改造的T细胞表达含⑶28和⑶3 ζ 结构域的CARs并产生IL-15 ( -种对Τ淋巴细胞稳态和生存至关重要的细胞因子），这一组 合将使T淋巴细胞在体内和体外具有较高的生存能力和增殖潜能，以及体内更高效的抗肿 瘤活性。另外，过继性T淋巴细胞还可被修饰使其可诱导表达自杀基因 iCasp9以限制其增 殖和毒性，因为这些刺激信号的结合可以造成危险的无法控制的过度增殖。
[0008] 最初的CAR用总的T淋巴细胞作为基因转化的靶细胞。然而，最近研究显示，中央 记忆性T细胞（central memory T cells)这一亚群更适合进行CAR转移，它们在体内具有 更持久性且更高效的抗肿瘤活性。除了利用T淋巴细胞外，一些研究者提出利用其它淋巴 细胞群进行CAR修饰。例如，NK细胞经过CAR修饰后，对靶细胞表现出高的细胞毒性。
[0009] 重度免疫缺陷小鼠（N0D/Shi-scid/IL-2Rynull，N0G)是体内检测CARs修饰淋巴 细胞最常用的动物模型。这种小鼠没有成熟的T和B淋巴细胞，允许接种人细胞（肿瘤细 胞或淋巴细胞）到体内而没有明显的排斥反应。
[0010] FcR为一类能结合免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig)可结晶段（fragment crystallizable，Fc)的受体，在免疫调节过程中发挥重要作用。人Ig根据其重链的差异可 分为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE五类，各类Ig的功能差异主要与其Fc段结构有关。机体内 许多细胞表面表达不同类Ig的Fc受体，通过Fc受体与Fc的结合，参与Ig介导的生理功 能或病理损伤过程。目前已鉴定明确属于簇分化抗原（cluster of differentiation，CD) 的Fc受体有Fc γ R、Fc a R、Fc ε R，它们分别可以结合IgG、IgA和IgE。
[0011] 小鼠 FcyR 有四种，分别为 FcyRI、FcyRIIB、FcyRIII 和 FcyRIV。FcyR 很 保守，相应的人类蛋白为 Fc γ RIA(CD64)、Fc γ RIIA(CD32A)、Fc γ RIIB (CD32B)、Fc γ RIIC、 FcyRIIIA(CD16A)和FcyRIIIB(CD16B)。从结构上说，FcR及其配体都属于一个免疫球 蛋白的大家族。大多数Fey R都有两个胞外结构域，而Fey RI有三个。按照它们与配体 结合的亲和力不同，FcyR又可大致分为高亲和力和低亲和力受体；按照它们的功能差异， Fc γ R可大致分为激活性和抑制性受体。小鼠和人的Fc γ R中，Fc γ RI均为唯一高亲和力 受体，而其它均为低亲和力受体。信号通路方面，小鼠和人的Fc γ RIIB结合相应配体后可 以转导抑制性信号，其它Fc γ R -般在配体结合后转导激活性信号。
[0012] CAR-T细胞技术在美国已获得III期临床研究许可。目前，重大产业项目部门致 力于CAR技术的前期技术转化及与现有CIK-Prominent技术的产业整合研究。在此，我们 将常规CAR识别肿瘤相关抗原的ScFv置换成Fc γ R的Fc结合结构域，构建了一类新型嵌 合Fc受体，转染这类受体的T细胞与肿瘤特异性抗体组合使用，在体外对表达特定抗原的 肿瘤细胞具有很高的杀伤效能，在体内也有很好的抑制肿瘤生长的作用。
【发明内容】
[0013] 本发明的目的在于提供一种全新的嵌合了 Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应 用，该融合蛋白能与Ig结合并诱导T细胞活化从而实现抗肿瘤的作用。
[0014] 本发明的第一方面，提供了一种嵌合Fc受体的融合蛋白，所述融合蛋白的氨基酸 序列为 SEQ ID N0 :2 或 SEQ ID N0 :4。
[0015] 本发明的第二方面，提供了一种编码本发明第一方面所述融合蛋白的核苷酸序 列，编码氨基酸序列SEQ ID N0:2的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1;编码氨基酸序列