每种细胞悬液分成若干小份，各份中加入梯度释度的Trastuzumab(购买自罗氏制 药有限公司）、CetUximab (购买自默克雪兰诺公司）或Rituximab (购买自罗氏制药有限公 司）；共同孵育一小时后，用PBS洗涤细胞两遍；用相同体积的PBS重悬细胞后，加入相同浓 度的FITC标记的羊抗人IgGK链抗体F(aV )2段（Sigma公司产品）；孵育一小时后，在 流式细胞仪（BD公司FACSCalibur)上测定细胞的平均荧光强度。
[0039] 实验结果：如图1所示，上述上述两种基因工程T细胞均可结合IgG抗体 Trastuzumab、Cetuximab 或 Rituximab，其中 CD64-CART 的结合力明显强于 CD16A-CART。
[0040] 实施例4.基因工程T细胞的由抗体介导的细胞毒作用和细胞因子产生 [0041 ] 实验步骤：PBMC获得方法与与实施例2中所述相同；PBMC作为效应细胞与作为靶 细胞的ΒΤ474 (乳腺癌细胞系，购自ATCC)、ΗΤ29 (结肠癌细胞系，购自ATCC)和Daudi细胞 (Burkitt淋巴瘤细胞系，购自ATCC)(分别高表达肿瘤相关抗原HER2、EGFR和⑶20)分别 混合，效应细胞与靶细胞之比为20 :1 ;另外，上述基因工程T细胞作为效应细胞也分别与 BT474、HT-29和Daudi等靶细胞以20 :1的比例混合；然后在含有BT474、HT-29和Daudi的 混合细胞培养物中分别加入梯度稀释的Trastuzumab、Cetuximab和Rituximab，共同孵育 4小时；然后用乳酸脱氢酶（LDH)细胞毒检测试剂盒（Roche公司产品）检测细胞培养上清 中LDH的活性。
[0042] 丝裂霉素处理过的BT474、HT29和Daudi细胞分别与上述基因工程T细胞以1 : 20的比例混合，然后在细胞培养混合物中分别加入梯度稀释的Trastuzumab、Cetuximab和 Rituximab，于37°C、5% C02培养箱中共同孵育24小时；然后取细胞培养物上清用酶联免疫 吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)测定上清中 IL-2 的含量。ELISA法 测定上清中IL-2含量的具体实施步骤如下：大鼠抗人的IL-2捕获抗体（BD Biosciences 公司产品）用0. 05M碳酸盐缓冲液（pH9. 6)稀释成2 μ g/ml，96孔酶标板（Corning公司产 品）每孔添加100 μ 1上述稀释后的抗体溶液，置于37°C恒温箱中孵育2小时；用洗涤缓冲 液（含有〇· 05% Tween-20的磷酸盐缓冲液）洗3次，每次3分钟；然后加入封闭液（含有 5 %脱脂奶粉的0. 05M碳酸盐缓冲液，pH 9. 6)，于4°C冰箱内过夜；次日，弃去孔内溶液，用 洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟；将稀释4倍的100 μ 1上清加于上述已包被的反应孔中， 置37°C孵育1小时；用洗涤缓冲液洗涤后，加浓度1 μ g/ml的生物素化大鼠抗人的IL-2检 测抗体（BD Biosciences公司产品）于各反应孔中，每孔100 μ 1，37°C孵育1小时；洗涤缓 冲液洗涤后，加浓度1 μg/ml的辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素（Str印tavidin-HRP，BD Biosciences公司产品）于各反应孔中，每孔100 μ 1，37°C孵育1小时；用洗涤缓冲液洗涤 后，于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液100 μ 1显色，37°C放置10~30分钟；于各 反应孔中加入2M硫酸50 μ 1终止反应；置SpectraMax i3酶标仪（美国Molecular Devices 公司产品）测定450nm波长处吸光值。
[0043] 如图2和图3所示，结果表明上述基因工程T细胞与相应抗体组合后可以通过裂 解靶细胞实现杀伤作用，细胞毒性明显强于PBMC，并且可同时分泌与增强免疫紧密相关的 细胞因子IL-2。
[0044] 实施例5.基因工程T细胞的体内抗肿瘤作用
[0045] 为检测抗基因工程T细胞的体内抗肿瘤活性，此处采用以重度免疫缺陷N0G小鼠 为宿主的人肿瘤移植模型。由于实验规模的限制和处于动物保护的考虑，此实施例只选用 CD64-CART进行相关动物实验。
[0046] 将BT474接种于5-6周龄的雄性N0G小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）右 侧皮下，待接种细胞需要与一定量的Matrigel(BD Bioscience公司产品）预先混合，每只 接种1 X 107个肿瘤细胞，；待肿瘤生长至200_ 3左右时，将小鼠随机分组，每组8只，各个 实验组分别向肿瘤内部直接注射Trastuzumab或相应抗体与⑶64-CART细胞的组合，各 个对照组分别注射无关对照蛋白人IgGl或无关对照人IgGl与⑶64-CART细胞的组合， Trastuzumab剂量设置为0. 5和2mg/kg ; -周后再重复给予相同处理一次。
[0047] 将HT-29接种于5-6周龄的雄性NOG小鼠（上海斯莱克实验动物有限公司）右侧 皮下，每只接种5X10 6个肿瘤细胞；待肿瘤生长至200_ 3左右时，将小鼠随机分组，每组8 只，各个实验组分别向肿瘤内部直接注射Cetuximab或相应抗体与⑶64-CART细胞的组合， 各个对照组分别注射无关对照蛋白人IgGl或无关对照人IgGl与⑶64-CART细胞的组合， Cetuximab剂量设置为1和4mg/kg ;-周后再重复给予相同处理一次。
[0048] 尾静脉注射将Daudi接种于5-6周龄的雄性N0G小鼠（上海斯莱克实验动物有限 公司），每只接种1X 1〇5个肿瘤细胞；第二天将小鼠随机分组，每组8只，各个实验组分别向 肿瘤内部直接注射Rituximab或相应抗体与⑶64-CART细胞的组合，各个对照组分别注射 无关对照蛋白人IgGl或无关对照人IgGl与⑶64-CART细胞的组合，Rituximab剂量设置 为0. 5和2mg/kg ;-周后再重复给予相同处理一次。
[0049] 每3天用游标卡尺测量肿瘤直径的长（a)和宽（b)，用如下公式计算肿瘤体积：V =aXb2/2 ;最后用统计软件GraphPad Prism 5作图并分析实验结果。对接种Daudi细胞 的小鼠，每天统计各组小鼠的死亡情况，最终数据用Kaplan-Meier生存曲线分析。
[0050] 结果表明：如图4所示，对于免疫缺陷小鼠的BT474移植瘤模型，Trastuzumab和 抗体与CD64-CART细胞的组合均明显能够显著抑制肿瘤的生长，但后者能够使肿瘤完全消 退并且长时间不再复发；如图5所示，对于免疫缺陷小鼠的HT29移植瘤模型，Cetuximab 没有显著抑制肿瘤的生长，而抗体与CD64-CART细胞的组合能够使显著抑制肿瘤生长，在 抗体高剂量时甚至使肿瘤完全消退；如图6所示，对于免疫缺陷小鼠的Daudi移植瘤模型， Rituximab显著延长了小鼠的生存率，但抗体与⑶64-CART细胞的组合比Rituximab能够更 加显著地延长生存率，在抗体剂量最高时小鼠的生存率也最高。
【主权项】
1. 一种嵌合Fc受体的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2 或 SEQ ID NO:4。2. -种编码权利要求1所述融合蛋白的核苷酸序列，其特征在于，编码氨基酸序列SEQ ID NO:2的核苷酸序列为SEQ ID NO: 1;编码氨基酸序列SEQ ID NO:4的核苷酸序列为SEQ ID N0:3〇3. -种表达权利要求1所述融合蛋白的载体，其特征在于，所述载体含有权利要求2所 述的核苷酸序列。4. 一种表达权利要求1所述融合蛋白的工程T细胞，其特征在于，所述工程T细胞含有 权利要求3所述的载体或其基因组中整合有权利要求2所述的核苷酸序列。5. -种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的融合蛋白或 表达权利要求1所述融合蛋白的工程T细胞，以及药学上可接受的载体。6. -种制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：在合适的表 达条件下，培养权利要求4所述的工程T细胞，并表达权利要求1所述的融合蛋白。7. 权利要求1所述融合蛋白或表达权利要求1所述融合蛋白的工程T细胞在制备抗肿 瘤药物中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种嵌合Fc受体的融合蛋白及其制备方法和应用，所述融合蛋白的氨基酸序列为SEQ？ID？NO:2或SEQ？ID？NO:4。该融合蛋白可以与IgG的Fc结合，尤其是在与IgG的免疫复合物结合后，能够有效激活嵌合Fc受体细胞内部的信号传导功能，刺激细胞活化、增殖和分化，最终激活其免疫杀伤功能。
【IPC分类】A61K47/48, C12N5/10, C12N15/62, C12P21/02, C12N15/85, A61P35/00, A61K48/00, C07K19/00
【公开号】CN105601746
【申请号】CN201410674130
【发明人】赵杰, 张成海, 朱玲巧
【申请人】上海中信国健药业股份有限公司
【公开日】2016年5月25日
【申请日】2014年11月21日