SEQ ID N0:4的核苷酸序列为SEQ ID N0:3。
[0016] 本发明第三方面，提供了一种载体，所述载体含有本发明第二方面所述的核苷酸 序列。
[0017] 本发明的第四方面，提供了一种工程T细胞，所述工程T细胞含有本发明第三方面 所述的载体或其基因组中整合有本发明第二方面所述的核苷酸序列。
[0018] 本发明的第五方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明第一方 面所述的融合蛋白或本发明第四方面所述的工程T细胞，以及药学上可接受的载体。
[0019] 本发明的第六方面，提供了一种制备本发明第一方面所述的融合蛋白的方法，其 步骤包括：在合适的表达条件下，培养本发明第四方面所述的工程T细胞，并表达本发明第 一方面所述的融合蛋白。
[0020] 本发明的第七方面，提供了本发明第一方面所述的融合蛋白或表达所述融合蛋白 的工程T细胞在制备抗肿瘤的药物的应用。
[0021] 本发明公开的上述嵌合Fc受体的融合蛋白可通过本领域常规方法得到的，例 如：编码人源FcyRIA(CD64)和FcyRIIIA(CD16A)的cDNA购买自北京义翘神州生物技术 有限公司，其序列分别与国立生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI)中所提供的参照序列 NM000566. 3、NM001136219. 1 和 NM001127596. 1 相同。嵌合Fc受体，为包含Fc γ R的Fc结合结构域、跨膜区和能诱导T细胞活化的信号转 导结构域的融合蛋白。其中跨膜区和信号转导结构域参照专利US 20130309258 Α1。上述 FcyR的Fc结合结构域分别与跨膜区和信号转导结构域以重叠 PCR法重组后克隆到慢病毒 载体pLVX-IRES-ZsGreenl (Clontech公司产品）中构建成真核表达载体；用脂质体法将上 述表达载体质粒与病毒包装质粒转染HEK293细胞，通过过滤和高速离心制备高滴度复制 缺陷的转染用病毒。用血液透析白细胞去除法分离健康志愿者提供的血液样品中的原代人 白细胞，然后用试剂盒R〇ssetSep(购买自Stem cell technology公司）进一步富集CD4和 CD8阳性T细胞，所得细胞在培养基中和抗CD3/CD28抗体包被的免疫磁珠共同培养以使T 细胞群体扩增。用上述病毒转染所获得的扩增后的T细胞，进而得到稳定持续表达嵌合Fc 受体的治疗用基因工程T细胞。
[0022] 本发明的发明人对上述嵌合Fc受体进行亲和力检测、基因工程T细胞增殖实验、 体内抑制肿瘤生长等实验。实验结果表明，本发明公开的基因工程T细胞可以与IgG的Fc 结合，尤其是在与IgG的免疫复合物结合后，能够有效激活嵌合Fc受体细胞内部的信号传 导功能，刺激细胞活化、增殖和分化，最终激活其免疫杀伤功能。实验表明，与相应IgG抗体 组合使用，基因工程T细胞在体内外对表达特定抗原的肿瘤细胞均具有很高的杀伤效能。
[0023] 现有CAR-T细胞在移植到患者体内后经常会导致无法控制的强烈免疫反应，细胞 因子大量分泌，从而产生严重的毒副作用。然而，本发明融合蛋白能够通过调整相应抗体的 使用剂量来控制毒副作用。另外，本发明CAR-T细胞能够与靶向多种抗原的抗体组合使用， 可以用于治疗不同类型的疾病而不用重新设计新的基因表达载体。
【附图说明】
[0024] 图1是CD64-CART和CD16A-CART对IgG Fc段的亲和力效果图；
[0025] 图2是由抗体介导的细胞毒作用结果图；
[0026] 图3是由抗体介导的细胞因子产生结果图；
[0027] 图4是由Trastuzumab介导的体内抗肿瘤作用效果图；
[0028] 图5是由Cetuximab介导的体内抗肿瘤作用效果图；
[0029] 图6是由Rituximab介导的体内抗肿瘤作用效果图。
【具体实施方式】
[0030] 以下实施例、实验例是对本发明的进一步说明，不应理解为对本发明的限制。实 施例不包括对常规方法的详细描述，如那些用于构建载体和质粒的方法，将编码蛋白的基 因插入到这样的载体和质粒的方法或将质粒引入宿主细胞的方法。这样的方法对本领域 中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如：Sambr 〇〇k， J. , Fritsch, E.F. and Maniais, T. (1989)Molecular Cloning ：A Laboratory Manual,2nd edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press。
[0031] 实施例1.嵌合Fc受体表达载体的构建以及慢病毒制备
[0032] 编码人源FcyRIA(CD64)和FcyRIIIA(CD16A)的cDNA购买自北京义翘神州生物 技术有限公司。其中跨膜区和信号转导结构域参照专利US20130309258 A1中的SEQ ID N0 12,其编码序列由苏州金唯智生物技术服务有限公司全基因合成。根据DNA序列分别设计 弓丨物用聚合酶链式反应扩增FcyR基因的Fc结合结构域编码区，以及跨膜区和信号转导结 构域的编码区；设计引物时引入一定长度的互补重叠区，以便用重组PCR法将Fc结合结构 域基因连接到跨膜区和信号转导结构域的基因片段上。
[0033] PCR均采用高保真DNA聚合酶（例如：Takara公司的PrimcSTARK HS DNA Polymerase)。反应条件按照DNA聚合酶生产商说明书合理设置：95°C 20秒；55°C 10秒， 72°C 1分/kb;30个循环。以上PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收后用于重组PCR的模 板，重组PCR反应条件为：95°C 20秒；55°C 10秒，72°C 2分；6个循环后再加入相应的引 物；95°C 20秒；55°C 10秒，72°C 1分/kkPCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到 慢病毒载体pLVX-IRES-ZsGreenl中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID ΝΟ:1、 SEQIDNO:2分别显示了嵌合CD64的核苷酸和氨基酸序列；SEQIDNO:3、SEQIDNO :4分 别显示了嵌合⑶16A的核苷酸和氨基酸序列。
[0034] 携带目的基因的慢病毒载体与相应慢病毒包装质粒共同转染HEK293细胞，48小 时后收集细胞上清液，〇. 45 μ m滤膜过滤后，4°C以25000rpm离心2h，离心前在离心管底部 加入2ml含有20%蔗糖的磷酸盐缓冲溶液形成一个蔗糖垫。离心完毕后小心取出超速离心 管，小心弃去上清液，留下管底沉淀。100 μ L冷PBS重悬，并轻轻吹打溶解沉淀，注意避免产 生气泡，-80 °C冻存。
[0035] 实施例2.表达嵌合Fc受体的基因工程T细胞的制备
[0036] 分离白细胞的血液样品均来自健康志愿者。血液的采集遵循本公司机构审查 委员会和并获得志愿者的签署的知情同意书。人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC)通过以下方法获得：在离心管中加入适量PBMC(Sigma公司产 品）；取肝素抗凝静脉血与等量RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面 上，注意保持清楚的界面；水平离心2000rpmX 20分钟；离心后管内分为三层，上层为血浆 和RPMI1640,下层主要为红细胞和粒细胞，中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一 以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，此细胞层包含单个核细胞包括淋巴细胞和单核细 胞，此外，还含有皿小板；用滴管擦到云雾层，吸取单个核细胞，置入另一离心管中，加入5 倍以上体积的RPMI1640,1500rpmX 10分钟，洗涤细胞两次；末次离心后，弃上清，加入含有 10%小牛血清的RPMI1640,重悬细胞；取一滴细胞悬液与一滴0. 2%台盼兰染液混合，于血 球计数板上，计细胞总数和活率。然后获得的PBMC用试剂盒RossetS印（购买自Stem cell technology公司）进一步富集⑶4和⑶8阳性T细胞，所得细胞在培养基中和抗⑶3/⑶28 抗体包被的免疫磁珠 （Life technologies公司产品；磁珠与细胞之比为1 :3)于37°C、5% 〇)2培养箱中共同培养以使T细胞群体扩增；第二天，用上述病毒转染所获得的扩增后的T 细胞，进而得到稳定持续表达嵌合Fc受体的基因工程T细胞；第四天，洗涤细胞除去残余病 毒粒子，继续培养；第六天，在小型生物反应器中继续培养；第十天左右，除去免疫磁珠，离 心收集细胞，洗涤和浓缩后，将所得细胞用可注射的冷冻培养基冻存于液氮。最终得到的两 种工程T细胞根据嵌合受体的来源分别命名为⑶64-CART和⑶16A-CART。
[0037] 实施例3.基因工程T细胞对IgG Fc亲和力检测实验-流式细胞法
[0038] 实验步骤：上述两种基因工程T细胞分别用磷酸盐缓冲液（以下简称PBS: 135mM NaCl，2. 7mM KC1，1. 5mM KH2P04,8mM Κ2ΗΡ04;ρΗ 7. 2)洗涤后将细胞密度均调整为 2X 10 5/ ml ;上述...