或无推进气体的 可吸入溶液。根据本公开内容的包含活性物质的可吸入粉剂可以只由上述活性物质组成或 由上述活性物质和生理学可接受的赋形剂的混合物组成。
[0180]这些可吸入粉剂可以包括单糖(例如葡萄糖或阿拉伯糖），二糖(例如乳糖、蔗糖、 麦芽糖），寡糖和多糖(例如葡聚糖），多元醇(例如山梨醇、甘露糖醇、木糖醇）、盐(例如氯化 钠、碳酸钙)或其相互的混合物。适当地使用单糖或二糖，使用乳糖或葡萄糖，特别地但不仅 限于它们的水合物形式。
[0181 ]用于在肺中沉积的颗粒要求颗粒尺寸小于10微米，例如1-9微米，例如0.1至5μηι， 特别地1至5μπι。活性成分(例如抗体或片段)的颗粒大小是最重要的。
[0182] 可用于制备可吸入气雾剂的推进气体是本领域已知的。适合的推进气体选自烃 (例如正丙烷、正丁烷或异丁烷)和卤代烃(例如甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、环丙烷或环丁烷的 氯化和/或氟化衍生物）。上述的推进气体可以单独使用或混合使用。
[0183] 特别适合的推进气体是卤代烷烃衍生物，其选自TG 11、TG 12、TG 134a和TG227。 在上述的卤代烃中，TG134a(l，l，l，2-四氟乙烷)和TG227(1，1，1，2,3,3,3-七氟丙烷)及其 混合物是特别适合的。
[0184] 包含推进气体的可吸入气雾剂还可包含其他成分，例如助溶剂、稳定剂、表面活性 试剂（表面活性剂）、抗氧化剂、润滑剂和用于调整pH的试剂。所有这些成分是本领域已知 的。
[0185] 根据本发明的包含推进气体的可吸入气雾剂可以包含以重量计多达5%的活性物 质。根据本发明的气雾剂包含，例如，以重量计〇. 002至5%，以重量计0.01至3%，以重量计 0.015至2%，以重量计0.1至2%，以重量计0.5至2%或以重量计0.5至1 %的活性成分。
[0186] 可选地，还可以通过施用液体溶液或悬浮液制剂局部施用至肺，例如使用装置例 如喷雾器，例如连接至压气机的喷雾器（例如由Pari Respiratory Equipment，Inc·， Richmond,Va制造的连接至Pari Master(R)压气机的Pari LC-Jet Plus(R)喷雾器）。
[0187] 本发明的抗体形式可以分散在溶剂中递送(例如以溶液或悬浮液的形式）。其可以 在合适的生理溶液(例如生理盐水)或其他的药理学上可接受的溶剂或缓冲溶液中悬浮。本 领域中已知的缓冲溶液可以包含0.05mg至0.15mg乙二胺四乙酸二钠，8.Omg至9.Omg NaCl， 0 · 15mg至0 · 25mg聚山梨醇酯，0 · 25mg至0 · 30mg无水梓檬酸和0 · 45mg至0 · 55mg朽1檬酸钠 /lml 水，以使pH为大约4.0至5.0。悬浮液可以用于，例如冻干的抗体。
[0188] 治疗悬浮液或溶液制剂还可以包含一种或多种赋形剂。赋形剂是本领域公知的并 且包括缓冲剂(例如柠檬酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、醋酸缓冲剂和碳酸氢盐缓冲剂）、氨基酸、 尿素、醇、抗坏血酸、磷脂、蛋白（例如血清白蛋白）、EDTA、氯化钠、脂质体、甘露醇、山梨醇和 甘油。溶液或悬浮液可以封装在脂质体或可生物降解的微球中。通常使用无菌制造工艺以 基本上无菌的形式提供制剂。
[0189]这可以包括通过本领域技术人员熟知的方法，通过过滤用于所述制剂的缓冲溶 剂/溶液、在无菌缓冲溶剂溶液中无菌悬浮抗体和将制剂分装入无菌容器来生产和灭菌。 [0190]可以例如以包装在箱包层中的单剂量单位(例如密封的塑料容器或小瓶）的形式 提供根据本公开内容的可喷射(nebulizable)制剂。各个小瓶包含在一定体积例如2ml溶 剂/溶液缓冲液中的单位剂量。
[0191] 据信本公开内容的抗体形式适合于经由喷雾作用递送。
[0192] 关于眼部施用，根据本发明的化合物可以方便地配制为在等渗、pH经调整的无菌 盐水中的微离子化(microionized)悬浮液(具有或不具有防腐剂例如杀细菌或杀真菌剂， 例如硝酸苯汞、苯扎氯铵或醋酸氯己定）。可选地，用于眼部施用的化合物可以配制到软膏 (例如凡士林)中。
[0193] 关于直肠施用，根据本发明的化合物可以方便地配制为栓剂。可以通过将活性组 分与适合的无刺激的赋形剂混合来制备所述栓剂，所述赋形剂在室温下是固体但在直肠温 度下是液体，因此栓剂在直肠中融化以释放活性组分。此类材料包括例如，可可脂，蜂蜡和 聚乙二醇。
[0194] 预防或治疗具体病况所需的本发明的化合物的量将根据所选化合物和要治疗的 患者的病况而变化。然而，通常，用于口服或口腔施用的日剂量可以为约l〇ng/kg至lOOOmg/ kg，一般地100ng/kg至100mg/kg，例如约0 · 01mg/kg至40mg/kg体重，用于肠胃外施用的日剂 量可以为约l〇ng/kg至50mg/kg体重，和用于经鼻施用或通过吸入或喷射施用的日剂量可以 为约0 · 05mg至约lOOOmg，例如约0 · 5mg至约lOOOmg。
[0195] 本发明的各个实施方案的优选特征经适当修正后适于各个其他实施方案。所有出 版物，包括但不限于本说明书中引用的专利和专利申请通过引用并入本文，如同明确地和 分别地指明各个单独的出版物通过引用并入本文，如同充分陈述的那样。
[0196] 在本说明书的背景中，包含意味着包括。
[0197] 当技术上合适时，可以组合本发明的实施方案。
[0198] 本文的实施方案描述为包含某些特征/要素。本公开内容还扩展至由或基本上由 所述特征/要素组成的分开的实施方案。
[0199] 现将参照下列实施例描述本发明，所述实施例仅仅是示例性的并且不应以任何方 式解释为限定本发明的范围。
[0200] 附图列表：
[0201 ] 图1: Fab-dAb的图示，其中dAb位于C-末端。
[0202]图 2A:Fab-didAb的图示。
[0203]图2B:在dAb之间具有额外的二硫键稳定作用的Fab-d i dAb的图示。
[0204] 图 3: FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1)和FabA-dAbL3 (CK-G [APAPA] 2) (2)的 SDS PAGE分 析。
[0205] 图 4: FabA-dAbL3 (CK-SG4SE) (1)和FabA-dAbL3 (CK-G [ APAPA ] 2) (2)的 We s t ern 印迹 分析。
[0206] 图4a:FabB-didAb的SDS PAGE
[0207] 泳道M = SeeBlue标志物
[0208] 泳道 l&2 = IgG 对照
[0209] 泳道 3=FabB
[0210] 泳道 4=FabB-didAb，-dAbLl (CK-G4Sx2) &dAbHl (CHI -G4Sx2)
[0211 ]泳道 5=FabB-didAb，-dAbL2 (CK-G4Sx2) &dAbH2 (CHI -G4Sx2)
[0212] 图5:结构域抗体(^诎1、(^诎2、(^乩1和(^乩2和来源于各个抗体的0)1?的序列。
[0213] 图6:包含与结构域抗体融合的FabB重链或轻链可变结构域的FabB-dAb构建体。
[0214] 图7: Fab，A重链和轻链序列和FabA重链序列。
[0215]图8a、8b&8c:鼠源化的（Murinised)Fab-didAb的氨基酸序列。
[0216]图8a展示多种鼠 dAb中的CDR的氨基酸序列。
[0217] 图8b展不mFabD-mdidAb的氨基酸序列：
[0218] dAbLl(CK-G4Sx2)
[0219] dAbHl(CHl-G4Sx2)
[0220] dAbL2(CK-G4Sx2)&
[0221] dAbH2(CHl-G4Sx2)
[0222] 图8c展不mFabD-mdidAb的氨基酸序列：
[0223] dAbLl(CK_G4Sx2)&
[0224] dAbHl(CHl-G4Sx2)mFabC-mdAbHl
[0225] dAbL2(CK-G4Sx2)&
[0226] dAbH2(CHl-G4Sx2
[0227] 图9展示FabB-didAb的SDS PAGE
[0228] 泳道 1&4 为 Fab'B
[0229 ]泳道 2&5 为 FabB-didAb，-dAbLl (CK-G4Sx2) &-dAbHl (CHI -G4Sx2)
[0230]泳道 3&6 为 FabB-didAb，-dAbL2 (CK-G4Sx2) &-dAbH2 (CHI -G4Sx2)
[0231 ] 图10展示Thermofluor热稳定性测定的图示。
[0232] 图11展示HSA-FITC信号/与活化的小鼠 T细胞结合的HSA-FITC混合物的曲线。
[0233] 图12展示聚集稳定性测定的曲线。
[0234] 图13展示皮下给药和静脉内给药后随时间变化的体内浓度特征。
[0235] 图14A、B和C展示某些CD4+细胞和CD8+细胞读数(readout)。
[0236] 图 15展示 FabB_645Fv的 SDS-PAGE 分析。
[0237] 图16展示FabB_645Fv的尺寸排阻分析。
[0238] 图17展示具有不同连接体长度的FabB_645Fv的热像图。
[0239] 图18展示某些FabB构建体的SDS-PAGE分析。
[0240] 图19展示多种FabB_645Fv构建体的尺寸排阻分析。
[0241 ]图20至24展示某些形式的序列。
[0242] 关键词
[0243] _645Fv等同于didAbLl和H1 (除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同 的)。
[0244] 648Fv等同于didAbL2和H2(除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同的）。 [0245] _645dsFv等同于didAbLl和H1 (除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同 的），其中L1和H1通过二硫键稳定。
[0246] _648dsFv等同于didAbL2和H2(除非另外指出，否则用于各个dAB的连接体是相同 的），其中L2和H3通过二硫键稳定。
[0247] Fab Δ是缺失链间半胱氨酸键(即CH和CL或CK之间）的Fab。
[0248] 实验：
[0249]缩写:除非上下文另外指出，否则〃m〃作为前缀是指鼠(murine)。
[0250] 除非上下文另外指出，否则〃h〃作为前缀是指人。
[0251] Fab A、Fab B、Fab C和Fab D组分在下文中以不同的形式提供。
[0252]实施例1.对人血清白蛋白特异的dAb的产生
[0253] 使用重组DNA技术产生符合读框的DNA编码转录单元，所述转录单元编码具有针对 人血清白蛋白的特异性的dAb。
[0254] 期望时，可以使用重组DNA技术产生符合读框的DNA编码转录单元，所述转录单元 编码具有针对募集蛋白的特异性的dAb。
[0255] 实施例2.抗体片段的产生
[0256]为了将dAb与轻链的C-末端融合，合成编码人κ轻链恒定区（具有κ恒定区的Km3同 种异形），肽连接体和dAb的DNA并且将其作为SacI-PvuII限制性片段克隆入UCB-Celltech 内部表达载体pTT0D(Fab)(pTT0_l的衍生物，描述于Popplewell等人，Methods Mol .Biol. 2005 ; 308:17-30中），所述表达载体pTTOD(Fab)包含编码人γ -1CH1恒定区的 DNA。这产生双顺反子基因排列，其由经由连接体与dAb融合的人源化轻链的基因，和随后的 人源化重链Fab片段的基因组成，两个基因都在tac启动子的控制下。还在Gly4Ser连接体上 游编码唯一的BspEl位点，或在富含Ala-Pro的连接体的上游编码AscI位点。
[0257]为了将dAb与重链的C-末端融合，合成编码人CH1片段（γ 1同种型的）（其后为连接 体编码序列和dAb)的DNA。将其作为Apal-EcoRI限制性片段亚克隆入UCB-Celltech内部表 达载体pTTOD (Fab) (pTTO-1的衍生物，Popp 1 ewe 11等人，同上），所述表达载体包含编码人 γ-lCHl恒定区的DNA。这产生双顺反子基因排列，其由人源化轻链的基因，非编码基因间序 列和随后的经由连接体与dAb融合的重链组成，两个基因都在tac启动子控制下。将重组表 达质粒转化到大肠杆菌菌株W3110中，其中通过添加 IPTG诱导表达。最初，以小规模(5ml培 养体积)进行表达实验且在〇D(600nm)为大约0.5时添加200uM IPTG，诱导2小时后收获细胞 并且在30°C在Tris/EDTA中进行过夜提取。将澄清的提取物用于通过Biacore的亲和力分 析。选择产生期望的表达产量和活性的构建体以用于发酵。
[0258] 适用于下列实施例的方法
[0259] 在下面的实施例中，dAb与其融合的抗体链表示为CK或LC(对于ck轻链)和表示为 CH1或HC(对于重链恒定结构域CH1)。
[0260]用于在大肠杆菌中表达的FabA-dAb融合质粒的构建
[0261 ] 通过将dAbL3或dAbH4融合至FabA轻链或重链的恒定区的C-末端构建Fab-dAb融合 蛋白。柔性（SGGGGSE(SEQ ID N0:1))或刚性(G(APAPA)2(SEQ ID N0:34))连接体用于将dAb 与CK区（SEQ ID N0:75)连接，而连接体DKTHTS(SEQ ID N0:2)用于将dAb与CHI区（SEQ ID N0:76)连接。将编码恒定区-dAb融合物的DNA序列合成制备为片段，以使得能够亚克隆入内 部pTTOD载体的FabA序列中。
[0262] 通过将合成的基因的Sacl-Apal片段亚克隆入能够表达FabA的质粒的相应位点构 建轻链-dAb融合物，所述合成的基因编码经由（SGGGGSE(SEQ ID NO: 1))或刚性(G(APAPA)2 (SEQ ID N0:34))连接体与dAbL3或dAbH4融合的C-末端cκ。通过将合成的基因的ApaI-ECORI片段亚克隆入能够表达FabA的质粒的相应位点构建重链-dAb融合物，所述合成的基 因编码经由DKTHTS连接体与dAbL3或dAbH4融合的C-末端CHI。
[0263] Fab'A来源于IL-Ιβ结合抗体，其重链和轻链序列分别提供于SEQ ID N0:74和75 中，如图7所示的。在Fab ' A中，当轻链与dAb连接时，将重链的铰链改变为DKTHTS，即便没有 dAb与重链(SEQ ID N0:76)连接。
[0264] FabA包含相同的轻链序列（SEQ ID N0:75)和截短的重链序列，所述重链序列在链 间半胱氨酸终止(SEQ ID N0:77)。
[0265] dAbL3和dAbH4分别是结合人血清白蛋白的轻链和重链结构域抗体。
[0266] 用于在大肠杆菌中表达的FabA-didAb融合质粒的构建
[0267] 通过将编码CHl-dAb融合物的Apal-EcoRI片段亚克隆入已有的Fab-dAb质粒构建 在轻链和重链上都具有dAbL3或dAbH4的FabA-didAb，其中dAb经由柔性连接体与轻链融合。
[0268] 用于在哺乳动物细胞中表达的FabB-dAb融合质粒的构建
[0269] FabB-dAb，FabB-dAbHl(CHl-G4Sx2)，FabB-dAbH2(CHl-G4Sx2)，FabB-dAbLl(CHl-G4Sx2)，FabB-dAbL2(CHl-G4Sx2)都通过PCR进行装配，然后克隆入在HCMV-MIE启动子和 SV40E polyA序列控制下的哺乳动物表达载体。将这些载体与包含FabB轻链的相似载体配 对，用于在哺乳动物细胞中进行表达(参见下文）。
[0270] FabB来源于结合细胞表面共刺激分子的抗体。如实施例3描述的，获得dAbHl、 dAbH2、dAbLl和dAbL2〇
[0271] FabB-dAb和didAb的哺乳动物表达
[0272]根据厂商的说明书，使用Invitrogen的293fectin转染试剂，用重链和轻链质粒转 染HEK293细胞。简言之，将2yg重链质粒+2yg轻链质粒与10μ1 293fectin+340yl Optimem培 养基一起在RT下温育20分钟。然后，将混合物添加至悬浮液中的5xl06个HEK293细胞并且在 37°C在振荡下温育4天。
[0273] Biacore
[0274] 通过表面等离子共振(SPR)确定Fab-dAb构建体的相互作用的结合亲和力和动力 学参数，所述表面等离子共振在使用CM5传感器芯片和HBS-EP (1 OmM HEPES (pH7.4)，150mM NaCl，3mM EDTA，0.05%v/v表面活性剂P20)运行缓冲液的Biacore T100上进行。用人F (ab'）2特异性山羊Fab( Jackson ImmunoResearch，109-006-097)或内部产生的抗人CHI单 克隆抗体将Fab-dAb样品捕获至传感器芯片表面。通过标准胺偶联化学实现捕获抗体的共 价固定。
[0275] 各个测定循环由下列步骤组成:首先用1分钟注射捕获Fab-dAb，然后进行由抗原 的3分钟注射组成的结合阶段，之后监控解离5分钟。各个循环后，通过40mM HC1的2x 1分钟 注射，随后5mM NaOH的30秒注射来再生捕获表面。使用的流速为10μ1/分钟（用于捕获），30μ 1/分钟（用于结合和解离阶段），和Ι0μ1/分钟（用于再生）。
[0276]关于动力学测定，进行抗原的滴定(对于人血清白蛋白，一般62.5ηΜ_2μΜ;对于几-1β，1.25-40ηΜ)，空白流动池用于参照扣除，且包括缓冲液空白注射以减去仪器噪音和偏 差。
[0277] 使用Biacore Τ100评估软件，通过所得的传感图（sensorgram)至标准1:1结合模 型的同时全局拟合，确定动力学参数。
[0278] 为了检验同时结合，在捕获的Fab-dAb上注射5μΜ HSA或ΙΟΟηΜ IL-Ιβ或5μΜ HSA和 ΙΟΟηΜ IL-Ιβ的混合溶液的3分钟注射。
[0279] 从大肠杆菌纯化Fab-dAb [0280]周质提取
[0281] 将在周质内包含Fab-dAb的大肠杆菌沉淀重悬浮在具有100mM Tris/HCl，10mM EDTA，pH 7.4的起始培养体积中。然后在4°C，250rpm下温育这些悬浮液16小时。在lOOOOxg， 4°C下，离心重悬浮的沉淀1小时。移出上清并且进行0.45μπι过滤。
[0282]蛋白G捕获
[0283]通过蛋白G层析从过滤的上清捕获Fab-dAb。简言之，将所述上清以20分钟停留时 间应用于在20mM憐酸盐，150mM NaCl ρΗ7·1 中平衡的Gammabind Plus Sepharose(GE Healthcare)柱。用20mM磷酸盐，150mM NaCl ρΗ7·1清洗柱子并且用0.1M甘氨酸/HC1 ρΗ2·8 洗脱结合的材料。收集洗脱峰并且用1Μ醋酸钠调整pH至约ρΗ5。浓缩pH经调整的洗脱液并且 使用10k MWC0膜渗滤入50mM醋酸钠 pH4.5。
[0284] 离子交换
[0285] 进一步通过阳离子交换层析在pH4.5下用NaCl洗脱梯度纯化Fab-dAb。简言之，将 经渗滤的蛋白G洗脱液用于在50mM醋酸钠 pH4.5中平衡的Source 15S(GE Healthcare)柱。用 50mM醋酸钠 pH4.5清洗柱子并且用20个柱体积的在50mM醋酸钠 pH4.5中的从0至1M NaCl的 线性梯度洗脱结合的材料。在整个梯度洗脱过程中，收集第三个柱体积的级分。通过A280和 SDS-PAGE分析所述级分并且合并相关的级分。
[0286]凝胶过滤
[0287] 需要时，进一步通过凝胶过滤纯化Fab-dAb。简言之，将FabA_dAbL3 (CK-SG4SE)的 合并的离子交换洗脱级分应用于在50mM醋酸钠，125mM NaCl pH 5.0中平衡的Superdex200 (GE Healthcare)柱并且用50mM醋酸钠，125mM NaCl pH 5.0的同溶剂梯度进行洗脱。在整 个梯度洗脱过程中，收集1/120个柱体积的级分。通过A280和SDS-PAGE分析所述级分并且合 并相关的级分。
[0288] 对于未经凝胶过滤的Fab-dAb，浓缩合并的离子交换洗脱级分并且使用10k MWC0 膜渗滤入50mM醋酸钠，125mM NaCl pH 5.0中。
[0289] SDS-PAGE
[0290] 需要时，用水稀释样品，然后向10μ1样品中添加 1 OyL 2X样品运行缓冲液。对于非 还原的样品，此时添加 2yL 100mM的NEM;对于还原的样品，添加 2yL 10X还原剂。涡旋样品， 在85°C温育5分钟，冷却并且以12500rpm离心30秒。将制备的样品装载到4-20%丙烯酰胺 Tris/甘氨酸SDS凝胶上并且在125V下电泳100分钟。将凝胶转移到用于Western印迹分析的 PVDF膜上或用Coomassie Blue蛋白染色剂染色。
[0291 ] Western 印迹分析
[0292] 在12mM Tri s，96mM甘氨酸pH8.3中在150mA下将凝胶转移到PVDF膜，进行16小时。 用在PBS+0.1 % Tween20中的2 % Marve 1? (封闭缓冲液)封闭PVDF膜1小时。
[0293]抗轻链
[0294] HRP-兔抗人κ轻链，在封闭缓冲液中1/5000稀释，1小时。
[0295] 抗重链
[0296] 小鼠抗人重链，在封闭缓冲液中1 /7000稀释，1小时。随后HRP-山羊抗小鼠，在封闭 缓冲液中1/2000稀释，1小时。
[0297] 抗His标签
[0298] 兔抗Hi s6,在封闭缓冲液中1/1000稀释，1小时。随后HRP-山羊抗兔IgG，