专利名称：一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物模型构建领域，具体涉及一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。
背景技术：
细菌产生耐药性是人类在病菌控制和治疗中碰到的一个棘手问题，对抗生素产生耐药性的细菌正在成为日益严重的威胁，并且变得越来越普遍。而抗生素的过度使用导致细菌产生多重耐药性，从而使人类面临“超级细菌感染”的危险[I]。大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，2011年5月在德国爆发的肠出血性大肠杆菌(EHEC)疫情就是由一种名为“huSec41”的肠出血性大肠杆菌(EHEC)变种引起的，这一变种对很多抗生素具有耐药性。抗生素在畜牧业中的滥用也导致多种动物源大肠杆菌具有了一定抗生素耐 药性[2]，这使得畜牧业的稳定和健康发展时刻面临巨大的威胁。要解决具有多重耐药性的超级细菌对人类健康和畜牧业发展的威胁，除了加强对抗生素使用的规范管理，减少抗生素的滥用外，最根本的办法还是要加快抗生素的研发速度，开发出新的、更为有效的抗生素。只有不断采用新的研究技术和工艺，才能加快抗生素的研发速度。虽然体外细胞实验可以很好地阐明病菌和宿主之间相互作用的关键步骤，但是无法获得与整体动物相关的一些重要信息。随着生物学技术的进步和动物替代模型的出现，曾经阻碍用活体动物进行病菌毒性研究的技术障碍和伦理问题都已经得到了很好地解决。常用的较为低等的病菌感染替代动物模型包括果蝇[3]、线虫[4，5]和阿米巴虫[6]等一些发育生物学研究已经很广泛的动物，对这些低等动物发育生物学的深入研究已经为医药学家提供了大量的实验工具和实验材料。但是，果蝇和线虫等低等动物与人类的生物等级差别太大，基因相似度低，生理结构和生理功能有较大差别，因此，其药物实验结果的预测可靠性与可比性较差。所以，迫切需要开发新的较为低等的动物模型，以便既能替代大小鼠等高等动物，又能保证实验结果的预测可靠性与可比性较高。斑马鱼是一种硬骨鱼，属于脊椎动物，与果蝇、线虫和阿米巴虫等低等相比，斑马鱼与人类的基因相似度更高(85%以上)、生理结构和生理功能更为接近；与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低[7]。此外，斑马鱼有着与哺乳动物非常相似的发育良好的免疫系统(包括先天性免疫和获得性免疫)[8，9]。这些优点使得斑马鱼成为了研究病菌感染机制和筛选抗生素的一种非常有用的动物模型。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷和不足，发明人经研究，旨在提供一种简单、快速、经济、高通量的斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。本发明是通过以下技术方案实现的I. 一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤(I)斑马鱼选取
挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)细菌注射设置若干个细菌注射组、I个溶剂注射组、I个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的IXPBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的IXPBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。优选的，还包括以下步骤(3)图像分析和/或微孔板分析；(4)统计学分析。
优选的，步骤⑴中挑选的斑马鱼为受精后2天的斑马鱼；优选的，步骤(2)中每个斑马鱼细菌注射量为3000-3500CFU ；优选的，步骤(2)中的注射方式为心包注射或卵黄囊注射；优选的，步骤⑵中细菌为大肠杆菌；优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28°C、pH为7. 2-7. 6、总硬度为 200-250mg/L ；优选的，步骤⑵中斑马鱼恒温培养的温度为34°C ；优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的时间为72h。优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以土SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。2.前述的构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于细菌感染研究的用途。3.前述的构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于评价或筛选抗生素的用途。优选的，还包括以下步骤(3)化合物处理移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组若干个化合物处理组，I个模型组，I个阳性对照组，化合物处理组中加入相同体积、浓度分别为O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和200 μ M的化合物；模型组加入等体积的养殖用水；于34°C恒温培养箱中培养；(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。优选的，步骤(3)阳性对照组加入的溶液为氨苄西林；优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度；优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度；优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以土SE表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。优选的，化合物处理后的斑马鱼培养时间为48小时。优选的，所述的化合物为卡那霉素、庆大霉素、氯霉素或链霉素。本发明提供了一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用，该方法具有简便、快速、成功率高、重复性好且稳定可靠等优点，能实现定性分析与定量分析。将用荧光标记的细菌注射到斑马鱼体内之后，只要在荧光显微镜下观察斑马鱼体内的荧光强度就可以斑马鱼体内的细菌数量进行定性分析；在荧光显微镜下拍照并利用图像分析软件对斑马鱼体内的细菌数量进行定量分析；也可以用荧光酶标仪对斑马鱼体内的细菌数量进行高通量的定量分析。具体地说，本发明具有如下优点I)活体内——实验材料为活体斑马鱼，作为一种脊椎动物，其筛选模型属体内模型，能够真实反映药物在体内的吸收、分布、代谢与排泄，真正反映药物的整体生物活性。2)高通量——斑马鱼幼鱼很小，只有1-4毫米，能够在一个标准的6，12，24，48，96或384孔板内进行分析和实验周期短使斑马鱼成为一种能进行高通量自动化体内药物筛选的理想模型。3)经济一所需费用低，以猴子为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于10美元，以老鼠为实验载体的筛选实验每只每天耗费大于I美元，而以斑马鱼为实验载体的筛选实验每只每天耗费小于0.01美元。4)化合物用量少——检测化合物用量少，通常只需几毫克，而传统的筛选实验则需几毫克以上的化合物。5)简便一实验过程操作简单，斑马鱼经药物处理后便可直接观察并进行定量与定性分析，不需要其它实验操作，而传统实验操作过程复杂且容易产生假阳性结果。6)快速一实验周期短，可在2 3天内完成；而老鼠常需要数周到数月的时间，猴子常需要数月至数年的时间。斑马鱼在第一个72小时(h)以内完成胚胎发育。多数的内部器官，包括心血管系统、肠、肝脏和肾，在24-48h内快速成型，传统的实验载体老鼠和猴子则分别需要21天和9个月方可完成胚胎发育。7)高效一斑马鱼胚胎及幼鱼透明，可同时观察多个器官系统，实验分析方法简单、快速。8)可靠的预测性一斑马鱼的基因与人类基因的相似度高达85%以上，其生物学功能与哺乳动物及人类高度相似，实验结果可比性强，预测性好。9)直观性强一胚胎及幼鱼透明，可直接置于显微镜下观察细菌的生长和繁殖。10)稳定性高、重复性好一本发明重复实验十几次，所获实验结果基本相同。·
本发明应用价值斑马鱼细菌感染模型具有可靠、快速、高效、低廉、高性价比等优点，本模型可用于细菌感染研究以及筛选抗生素。本发明对加快降血脂药物的研发及改善高脂血症患者的治疗具有意义重大。发明详述本发明的目的在于提供一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法及其应用。本发明提供的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点。一、本发明提供一种建立斑马鱼细菌感染模型的方法，设计方案为I.细菌的培养将带有卡那霉素抗性的红色荧光质粒RFP(Kan+)转入氯霉素抗性大肠杆菌BL21(DE3)Plyss (Chl+)中，转化成功后涂LB固体平板(Kan+、Chl+)，筛选能够产生红色荧光且具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的大肠杆菌(下文简称BL21RFP)，长出单菌落后4°C保存平板。每次对斑马鱼进行细菌注射前一天，挑取BL21RFP单菌落到LB液体培养基中(Kan+、Chl+)，37°C>200rpm 培养 16h,备用。2.斑马鱼选取取4 5对斑马鱼亲本交配,按照Westerfield[10]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常且发育阶段一致的斑马鱼移入
6、12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。3.细菌注射设置5个实验组3个细菌注射组、I个溶剂注射组、I个空白对照组。将步骤I中培养好的细菌用灭菌的IXPBS缓冲液洗脱3次；将斑马鱼麻醉后，用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内——可采用心包注射或卵黄囊注射。3个细菌注射组的细菌注射量分别为600-700CFU、3，000-3，500CFU和15，000-18，000CFU,溶剂注射组注射等体积灭菌的IXPBS缓冲液。注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水(溶解氧质量浓度为6-8mg/L ;水温为28°C ；pH为7. 2-7. 6 ;总硬度为200-250mg/L,下同)，按最佳培养时间长度于34°C恒温培养箱中培养。4.结果分析统计各实验组的斑马鱼存活率，并在荧光显微镜下观察斑马鱼体内细菌的生长情况，拍照并保存。用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析，定量分析斑马鱼体内的细菌荧光强度，进而定量评价斑马鱼体内的细菌生长情况。二、本发明提供了一种利用斑马鱼细菌感染模型评价与筛选抗生素的方法，设计方案为I.细菌的培养每次对斑马鱼进行细菌注射前一天，挑取BL21RFP单菌落到LB液体培养基中(Kan+、Chl+)，37°C、200rpm 培养 16h，备用。I.细菌的培养将带有卡那霉素抗性的红色突光质粒RFP (Kan+)转入氯霉素抗性大肠杆菌BL21(DE3)Plyss (Chl+)中，转化成功后涂LB固体平板(Kan+、Chl+)，筛选能够产生红色荧光且具有卡那霉素抗性和氯霉素抗性的大肠杆菌(下文简称BL21RFP)，长出单菌落后4°C保存平板。每次对斑马鱼进行细菌注射前一天，挑取BL21RFP单菌落到LB液体培养基中(Kan+、Chl+)，37°C>200rpm 培养 16h,备用。2.斑马鱼选取取4 5对斑马鱼亲本交配,按照Westerfieldtici]的方法孵化胚胎。将处于最佳处理阶段的斑马鱼置于解剖显微镜下观察，挑取发育正常且发育阶段一致的斑马鱼移入6、 12、24、48、96或384孔微孔板中，根据微孔板规格放入不同数量的斑马鱼。3.细菌注射设置9个实验组7个细菌注射组、I个溶剂注射组、I个空白对照组。将步骤2中培养好的细菌用灭菌的IXPBS缓冲液洗脱3次；将斑马鱼麻醉后，用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内——可采用心包注射或卵黄囊注射。5个细菌注射组的细菌注射量均为3，000-3, 500CFU，溶剂注射组注射等体积灭菌的IXPBS缓冲液。注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水。4.化合物处理7个细菌注射组中，5个化合物处理组，I个模型组，I个阳性对照组。移除微孔板中的养殖用水，化合物处理组中加入一定体积(根据微孔板规格而定)浓度分别为O. ΙμΜ、I μ Μ、10-、100 μ M和200 μ M的庆大霉素；阳性对照组中加入氨苄西林；模型组加入等体积的养殖用水。按照最佳处理时间长度于34°c恒温培养箱中培养。5.图像分析移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，定性评价化合物的体内抗菌效果。空白组和溶剂组在荧光显微镜下观察无荧光，细菌注射模型组的荧光很强，阳性对照组和化合物处理组的荧光强度减弱(图I)。用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析，计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度(S)，定量评价化合物的体内抗菌效果(图
2)。化合物的抗菌效果评价公式如下
权利要求
1.一种斑马鱼细菌感染模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)斑马鱼选取 挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中； (2)细菌注射 设置若干个细菌注射组、I个溶剂注射组、I个空白对照组，将带有荧光标记的细菌用灭菌的IXPBS缓冲液洗脱3次，然后用显微注射的方式将细菌注入斑马鱼体内，注射结束后，洗脱除去残留的麻醉剂，并将斑马鱼转入6孔板中，每孔中加入等体积的养殖用水，作为细菌注射组；溶剂注射组注射等体积灭菌的IXPBS缓冲液；空白对照组注射等体积的养殖用水；恒温培养。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，还包括以下步骤 (3)图像分析和/或微孔板分析； (4)统计学分析。
3.如权利要求I或2所述的建立方法，其特征在于优选的，步骤(I)中挑选的斑马鱼为受精后2天的斑马鱼； 优选的，步骤(2)中每个斑马鱼细菌注射量为3000-3500CFU ； 优选的，步骤(2)中的注射方式为心包注射或卵黄囊注射； 优选的，步骤(2)中细菌为大肠杆菌； 优选的，所述养殖用水其溶解氧浓度为6-8mg/L、水温为28°C、pH为7. 2-7. 6、总硬度为200_250mg/L ； 优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的温度为34°C ； 优选的，步骤(2)中斑马鱼恒温培养的时间为72h。
4.如权利要求2或3所述的构建方法，其特征在于 优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度； 优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度； 优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，p < O. 05为差异性显著。
5.权利要求1-4所述构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于细菌感染研究的用途。
6.权利要求I或3所述构建方法得到的斑马鱼细菌感染模型用于评价或筛选抗生素的用途。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于还包括以下步骤 (3)化合物处理 移除微孔板中的养殖用水，设置多个实验组若干个化合物处理组，I个模型组，I个阳性对照组，化合物处理组中加入相同体积、浓度分别为O. I μ M、I μ M、10 μ M、100 μ M和·200 μ M的化合物；模型组加入等体积的养殖用水；于34°c恒温培养箱中培养；(4)图像分析和/或微孔板分析； (5)统计学分析。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于 优选的，步骤(3)阳性对照组加入的溶液为氨苄西林； 优选的，图像分析具体步骤为移除微孔板中的液体，加入等体积浓度为O. 64mM的甲磺酸将斑马鱼麻醉处死后，用3%甲基纤维素胶将斑马鱼固定于双凹载玻片上后，置于荧光显微镜下观察各实验组斑马鱼体内的细菌生长情况并拍照保存，用ImageJ图像分析软件或尼康NIS-Elements D3. 10高级图像处理软件对图像进行分析,计算斑马鱼体内的细菌相对荧光强度； 优选的，微孔板分析具体步骤为将斑马鱼转入96孔板，每孔I尾。然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度； 优选的，统计学分析步骤为统计学处理结果以表示，多组间比较采用单因子方差分析，两组间比较采用Dunnett’ s T-检验进行统计学处理，P < O. 05为差异性显著。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于 化合物处理后的斑马鱼培养时间为48小时。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于 所述的化合物为卡那霉素、庆大霉素、氣霉素或链霉素。
全文摘要
本发明涉及一种细菌感染模型的构建方法，并利用该动物模型进行细菌感染研究以及筛选抗生素。模型的构建方法主要包括斑马鱼选取，细菌注射，图像分析和/或微孔板分析，统计学分析几个步骤。本发明的方法具有简便、快速、经济、高效、高通量等优点，本模型可用于细菌感染研究以及筛选抗生素。本发明对加快降抗生素的研发及改善细菌感染患者的治疗具有意义重大。
文档编号A01K61/00GK102907356SQ201210377599
公开日2013年2月6日 申请日期2012年9月27日 优先权日2012年9月27日
发明者李春启, 张勇, 劳乔聪, 朱凤, 郭胜亚 申请人:杭州环特生物科技有限公司