专利名称：斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA及其克 隆、表达技术。
背景技术：
由于APRIL在外周血淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞上有较高水平的表达，与BAFF 一样能与TACI和BCMA结合，并且在小鼠体内注射大量重组APRIL可导致B细胞在脾中积 聚而引起脾的重量的增加，这就使人们认为APRIL和BAFF具有相似的功能。APRIL是一有效的T细胞体外刺激因子。APRIL除了对T细胞有增殖作用，而且还 可明显延长T细胞的存活时间。APRIL可能通过上调Bcl-2而影响了 T细胞的存活。各种研究表明，许多恶性B系肿瘤异常表达APRIL，并且这些肿瘤细胞表面表 达一种或多种APRIL受体。人们也研究了 “诱饵受体” BCMA-Fc、TACI-Fc及BAFF的单克隆 抗体对这些B系肿瘤抑制的影响，发现这些抗体及抗体类似物均能恢复这些肿瘤细胞的凋 亡作用。BAFF/APRIL配体-受体系统极有可能成为对抗多种恶性肿瘤的分子靶点库。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大主要核酸序列数据库搜索结果得知，目前已 知BAFF基因序列的鱼类包括虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点绿河豚；APRIL基因序列包括虹 鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰，并分别已在GenBank数据库中申请了序列号，序列号分别 是 ABC84582、NP_001135232, SINFRUP00000153079、EF451543、DY736744、CB940845。斑马 鱼B淋巴细胞增殖诱导配体(zAPRIL) cDNA还未被克隆出来，关于斑马鱼BAFF基因的研究 在整个国内外还处于完全空白状态。斑马鱼(Zfeflio rerio)，又名蓝条鱼、花条鱼、斑马担尼鱼，属于辐鳍亚纲 (Actinopterygii)鲤科iPyprinidae)短担尼鱼属(JMnio)的一种硬骨鱼。原产自印度东 部、巴基斯坦、缅甸、孟加拉国等南亚地区，是一种常见的热带鱼。斑马鱼是国际标准化组织 认可的5种鱼类实验动物之一，已经成为发育生物学、遗传学、毒理学等研究常用的模式生 物。60年代末70年代初，Mreisinger首先对这种生物进行了单倍体培育，建立了第 一个用紫外线突变的突变体。随着纯合子培养技术的成熟和广泛高效的突变剂ENU的出 现，位于TUbingen和Boston等地的几个实验室自1993年开始对斑马鱼进行ENU大规模系 统突变筛选和建库工作。1994年，在冷泉港召开的斑马鱼研究专题会议，标志着斑马鱼已成 为继小鼠，果蝇，线虫后又一生物学研究的重要模式生物。虽然斑马鱼最初主要被用来进行遗传学及发育生物学研究，但近几年，随着对斑 马鱼了解的日趋深入，其在免疫学中的应用也越来越为人们所重视。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种从斑马鱼提取的B淋巴细胞增殖诱导配体 cDNA，并提供斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法及重组技术。本发明从斑马鱼中克隆到B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所 示的序列。斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体，它具有SEQ ID NO. 2所示的序列。本发明的斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法如下
(1)提取斑马鱼脾脏总RNA，
(2)根据增殖诱导配体的保守序列设计兼并引物
正义寡核苷酸引物 zAPRILl :5，- ATGGCTGAAATAACCCAGCGGTT-3， 反义寡核苷酸引物 ZAPRIL2 :5，- TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG-3， (3 )通过RT-PCR方法，利用上述弓I物zAPRILl和zAPRIL2为引物，扩出编码区全长cDNA 序列(600bp)的片段，克隆入PMD-19T载体，挑取阳性克隆进行序列碱基测定。上述斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法具体操作如下
(1)利用Trizol试剂一步法提取斑马鱼脾脏组织总RNA
(2)通过Clustalw软件分析虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰APRIL cDNA保守区，设 计兼并引物 zAPRILl :5’ - ATGGCTGAAATAACCCAGCGGTT-3’ ；
ZAPRIL2 :5’ - TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG-3’ ；
应用RT-PCR方法，以上述zAPRILl及ZAPRIL2为特异性引物，扩增出一段cDNA序列，全 长为600bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测定。RT-PCR的反应条件为以总 RNA为模板，在50μ 1反应体系中，加入5XRT-PCR反应缓冲液10μ l、25mM MgS042 μ 1、IOmM dNTP混合物1μ 1、20μΜ的上下游引物各2. 5 μ 1、AMV逆转录酶(Takara公司)1μ 1、Tfl DNA聚合酶1μ 1及RNA模板2 μ 1，补水至50 μ 1。RT-PCR循环参数为48°C逆转录45min， 94 V变性2 min，再进行30个PCR循环(94 V变性30s，56 V退火30s，72 °C延伸Imin )，最后 于72°C延伸7 min。RT-PCR产物用1 %的琼脂糖凝胶电泳分离后，用胶回收试剂盒回收约 600bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，挑取10个阳性克隆进行碱基序列测定。(3)用MEGA 3. 1软件对GenBank上已知的各种动物(对应的GenBank号分别为 dog EU909456、horse XM001918372、pig EF591082、cattle XM581161、mouse NM023517、 rabbit EF494239、human NM003808、salmon BT050319、rainbow trout EF451543, channel catfish CB940845)的APRIL蛋白的氨基酸序列所构建的Neighbor-joining分子进化树， 显示zAPRIL与斑点叉尾鮰的亲缘关系最近，与哺乳动物的亲缘关系较远。我们构建了原核表达载体pSUMO-zsAPRIL，在大肠杆菌中就成功表达可溶性的 SUMO-zsAPRIL融合蛋白。经体外试验证实SUMO蛋白并没有对融合蛋白的活性产生影响。 且在目的蛋白和SUMO蛋白之间有一个SUMO蛋白酶切位点，可以利用SUMO蛋白酶I切割 得到不带SUMO的目的蛋白。
图1是zAPRIL (GenBank NO. FJ598137)的cDNA序列及对应的蛋白序列。图2是SDS-PAGE分析SUMO-zsAPRIL在大肠杆菌中的表达1重组蛋白非诱导；2重组蛋白诱导20 h ；3纯化后蛋白SUMO-zsAPRIL ;4酶切后蛋白zsAPRIL ； 5 western blotting 图。图3是流式细胞术检测zsAPRIL对小鼠淋巴细胞的促存活作用。(a)和(c)图为 PBS检测结果，(b)和(d)图为用12yg/ml SUMO-zsAPRIL处理48h后的检测结果，细胞用 PI染色。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1
斑马鱼购自南京大学模式动物遗传中心
(1)引物设计通过Clustal w软件分析虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰APRIL cDNA 保守区，设计兼并引物 zAPRILl :5，- ATGGCTGAAATAACCCAGCGGTT-3，； ZAPRIL2 :5’ - TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG-3’ 。(2)提取总RNA 应用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手 册提取斑马鱼脾脏细胞的总RNA，并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外 分光光度计测定其浓度。(3)RT-PCR 以上述zAPRILl及zAPRIL2为引物引物进行PCR扩增，得到600bp 的片段。①逆转录
在DEPC处理的1. 5ml Eppendorf管中依次加入总RNA抽提物3 μ 1，Oligo d(T)18 1μ 1， 10mmol/L dNTP 2 μ 1，DEPC水5 μ 1置于；65 ° C，15min后立即冰浴5min ；再在上述体系 中加入 5 X RT 反应缓冲液 4 μ 1，RNase inhibitor 0· 5 μ 1 (20u)，AMV 反转录酶 2 μ 1，DEPC 水2. 5μ1至总体积为20μ1的反应液，于42 ° C反应1.5h，94 ° C，IOmin终止反应，置 于冰上； ②PCR
利用逆转录所得模板进行PCR，体系为5 O μ 1，10 μ mo 1 /L上、下游引物各2. 5 μ 1， 2. 5mmol/L dNTP 4 μ 1，25mmol/L MgCl2 3 μ 1，IOX 缓冲液 5 μ 1，cDNA 模板 5 μ 1，rTaq 酶 IylJnddH2O 27 μ I0 反应程序为94 ° C 5min，94 ° C 30s, 56 ° C 30s,72° C lmin, 30个循环，最后72 ° C孵育7min。反应完成后将产物于1%琼脂糖凝胶中电泳分离，用胶回收试剂盒回收得到约 600bp的DNA条带，克隆入pMD19-T载体，经含Amp抗生素(50mg/ml)的琼脂糖平板筛选转 化子，挑出阳性克隆送往上海英骏测序公司进行碱基序列测定。实施例2
斑马鱼APRIL重组表达载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达根据dAPRIL cDNA序列和pSUMO的stu I酶切位点，设计一对特异性PCR引物为 zsAPRILl 5' -TCGAGGATCC TCATCCATAAAC-3，(SEQ ID NO. 5)
zsAPRIL2 5' - TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG -3，(SEQ ID NO. 6)。并在下游引物插入 BamH I酶切位点。将扩增片段亚克隆入pSUMO载体，构建成重组载体pSUMO- ZsAPRIL0将 此重组载体转入大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3)，胞浆内可高可溶性表达出目的蛋白SUMO-zsAPRIL。经SDS-PAGE检测(图2)显示，在大约37kDa处为目的蛋白，经IPTG诱导5 h达 到最大表达量。重组目的蛋白的Ni+亲和纯化
IPTG低温诱导含有重组载体pSUMO-zsAPRIL的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3) 24小 时后，4°C收菌，冰上超声破碎(160W,工作4s，暂停8s，共99次)表达菌体，4°C，13,000 X g， 20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，先后用10倍体积的Binding buffer 禾口 6 倍体积、的 Washing buffer (20 mmol/L Imidazole，0· 5 mol/L NaCl，20 mmol/ L Tris HCl，pH 7. 9)洗去杂蛋白，最后用 Elute buffer (1 mol/L Imidazole，0. 5 mol/L NaCl，20 mmol/L TrisHCl, pH 7.9)洗脱目的蛋白，分管收集，PBS除盐。SDS-PAGE检测各 收集管蛋白纯度和紫外分光光度计测定蛋白浓度。如图2 (条带3)所示。Western 印记分析
Western-blot中所用一抗为鼠抗Hk6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG。 其简要步骤是将样品先进行SGS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素膜 (NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与一 抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。 结果如图2 (条带4)所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。实施例3 流式细胞仪检测
将小鼠脾脏于盛有PBS溶液的小平皿中剪碎，充分研磨后过200目网筛，用PBS洗数 次，去除红细胞后后加入淋巴细胞分离液进行分离得到小鼠淋巴细胞。将分离得到的小鼠 淋巴细胞(5 X IO5)与 12 μ g/ml SUMO-zsAPRIL 在 37° C，5%C02 培养 48h 后用 PBS 洗三遍，再 用10 μ g/ml的PI在37° C染色30min后用PBS洗三遍。用流式细胞仪(BD bioseicnces) 检测。以加PBS作为空白对照。流式细胞术检测结果(图3)显示融合蛋白SUMO-zsAPRIL 在体外anti-IgM存在下，能够促进小鼠淋巴细胞的存活。实施例4
将实施例1获得的斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA通过现有基因工程方法，转入 动物体内，增加其免疫力，在饲养中应用。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导 配体基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体CDNA，其特征在于，具有SEQID NO. 1所示的序列。
2.—种权利要求1所述的斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的克隆方法，其特征在 于包括以下步骤(1)提取斑马鱼脾脏总RNA，(2)根据增殖诱导配体的保守序列设计兼并引物正义寡核苷酸引物 zAPRILl :5，- ATGGCTGAAATAACCCAGCGGTT-3， 反义寡核苷酸引物 ZAPRIL2 :5，- TCATATGCTGAAGAGCCCCATGAAG-3，(3)通过RT-PCR方法，利用上述引物zAPRILl和zAPRIL2为引物，扩增出600bp的片 段，克隆入PMD-19T载体，挑取阳性克隆进行序列碱基测定。
3.一种权利要求1所述的斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA的重组应用，是通过现 有基因工程方法，生产重组斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体，作为斑马鱼类免疫增强剂。
4.斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体，其特征在于，具有SEQID NO. 2所示的序列。
全文摘要
斑马鱼B淋巴细胞和增殖诱导配体(zAPRIL)cDNA及其克隆方法和重组应用，涉及生物基因工程领域。斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体基因的克隆方法如下TR提取斑马鱼脾脏总RNA并进行逆转录；通过Clustalw软件分析虹鳟鱼,大西洋鲑鱼,斑点绿河豚以及虹鳟鱼，大西洋鲑鱼，斑点叉尾鮰APRILcDNA保守区设计兼并引物进行PCR扩增，获得600bp全长cDNA。所述斑马鱼B淋巴细胞增殖诱导配体cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组斑马鱼APRIL。
文档编号A61P37/04GK102121011SQ20101059827
公开日2011年7月13日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者张双全, 梁臻宁, 闵翠 申请人:南京师范大学