专利名称：一种多重分型的斑马鱼遗传质量检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及斑马鱼遗传质量检测方法领域，特别是一种针对4个斑马鱼常用品系挑选12个SNP位点，设计12对引物和特异探针，利用SNP位点引物PCR结合连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)检测斑马鱼遗传质量的多重分型方案试剂盒。
背景技术：
目前，斑马鱼对发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究极其重要。目前国内斑马鱼除了微生物学和寄生虫学的质量情况，还存在遗传质量上的软肋。 国际上早已形成较为成熟的几个斑马鱼品系，并以此为探索新的育种。国内很多单位在斑马鱼的引种和保育方面不但存在盲目引种，还有饲养管理不善引起的种质退化和混种等情况。遗传质量也是构成实验动物质量的重要方面，而水生实验动物也不适宜采用啮齿类动物通用的生化或组织学遗传鉴定方法。此外，因为遗传学检测可以与微生物学检测共享核酸样品，所以无疑能够事半功倍。目前国内尚无可以应用于水生实验动物质量控制与检测的标准或推荐方法，对于国内实验用鱼质量的现状也缺乏系统的调查和一手资料。我们拟引入国际标准鱼株，采用分子遗传学方法，进行实验室分析，来检测国内斑马鱼的遗传质量。DNA分子作为遗传信息的直接载体，不受环境、生物发育阶段及器官组织的影响， 因而能较为准确地反映出各个物种间的系统发生关系，但常规的PCR方法针对每个SNP位点需要一个PCR反应来扩增。为了节省样本、减少实验时间、本研究采用多重PCR，即通过将多对引物设计在一次PCR反应中，这样既可以节约试剂用量，同时也大大缩短实验时间，并达到质量检测的目的。SNP位点引物PCR结合连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)技术是使用多对引物对多个SNP位点序列进行扩增，根据品系间特异性单核苷酸位点，构建不同长度的LDR特异探针，利用高温连接酶的高特异性对基因内部的序列差异进行检测，因而具有高通量，高准确度，高灵敏度等特性，是一种可移植性很强的检测方案。SNP由于具有独特的遗传特性，因此被用来分析生物遗传多样性和亲缘关系。由于探针和引物具有高度敏感性和特异性，使其能对多个物种进行检测分型。本试剂盒通过选择12个已知SNP位点进行品系间遗传多态性分析，设计12对位点PCR引物和LDR探针，对样本进行同时扩增。待检样本经引物PCR放大后再用连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)来对样本进行分型和定量。DNA连接酶催化两条DNA链发生缩合反应生成磷酸二酯键。由于要在核苷酸片断与模板链完全配对的情况下，连接酶才能把缺口连接上，特别是上游片断的3’端，3’端一个碱基的错配，也将导致连接反应的失败，所以连接反应被用于单碱基突变的研究。在LDR中，只要上下游探针的选取与设计恰当，就可以保证连接产物的特异性，所以LDR在分型中的应用也是很有优势的。并且多对探针同时进行连接反应，相互之间的干扰也是很小的，我们就可以在一个样本中区分多个序列。首先，抽提各物种的基因组DNA，定量到统一浓度。其次，在数据库中选取25
6个SNP位点对4种斑马鱼品系进行分型，从中选取12个SNP位点，重新设计探针，构建多重探针检测方案，并优化方案。再次，用已分型过的4种斑马鱼品系和国外已知斑马鱼品系对多重探针检测方案做SNP特异性评估。最后用多重探针检测方案检测未知斑马鱼样本的遗传质量。
发明内容
本发明目的是建立一种斑马鱼遗传质量检测方法的多重分型方案试剂盒。本方法针对已有SNP位点有效扩增出所有目标序列，保证了各目标序列都可被检测到。各目标物种的特异探针进一步又保证了特异性，使各目标序列完全区分出来，实现多重分型定量。本试剂盒主要由SNP位点引物PCR和特异探针LDR两部分组成。在PCR中，设计的位点引物扩增出所选SNP位点序列。再经过连接反应，各物种特异的LDR探针达到分型的目的。LDR信号由ABI Prism 377型核酸分析仪检出，测得的荧光值作为定性的依据。本试剂盒采用的方案包括以下步骤1.多重分型方案的获得(1)靶标SNP的确定、斑马鱼样本的获得选取的斑马鱼为TU、TL、AB、WIK四个近交系，其中TU为M尾，TL为M尾，AB为 14尾，WIK为16尾。在数据库中选取斑马鱼25对染色体上已有的SNP位点作为靶标，进行分型研究，构建多物种联合检测的PCR体系和多重LDR体系。(2) SNP位点弓丨物及探针设计根据挑选的SNP 序列，用 primer3 在线软件(http//frodo. wi. mit. edu/ primer3/)设计引物，选择性扩增不同染色体区段的SNP位点序列。引物设计主要借助 01igo6.0 程序(Molecular Biology Insights Inc. ,USA)完成，同时将 PCR 扩增片段的范围设计在100 400bp之间。针对物种特异性SNP位点设计LDR探针，各物种连接探针连接产物长度为82 120bp，相邻片段间隔为2bp。(3)探针特异性评估抽提各物种的基因组DNA，定量到统一浓度(10pg/yL)。首先，取25个位点 (http://cascad. niob. knaw. nl/snpview/)分析4个品系的所有样本，经测序仪分析，得到 4个品系在25个SNP位点的多态性分布，选出品系特异性SNP位点，共12个。其次，取选出的12个SNP位点，重新合成探针，各物种连接探针连接产物长度为82 120bp，相邻片段间隔为2bp，组成两组多重LDR体系。用该LDR体系分析已分型过的4种斑马鱼品系和国外已知斑马鱼品系的样本，做SNP特异性评估，经测序仪分析，特异性良好。2.样本的检测(1)用多重探针检测方案检测未知斑马鱼样本的遗传质量。
图1是位点引物PCR结合LDR分型定量斑马鱼试剂盒的样本检测的示意图。按照图示所标记，㈧为斑马鱼的样本DNA模板⑶为针对斑马鱼SNP位点序列设计的位点引物，(C)内是利用位点引物和样本DNA模板进行的PCR反应，⑶为针对斑马鱼已知SNP位点序列设计的特异LDR探针，(E)内进行的是按特异探针混合方案进行的多重LDR反应， (F)为ABI ft~ism377型核酸分析仪上获得的多重探针优化方案定量分型分析图，(G)为ABI Prism 377型核酸分析仪上获得的多重探针优化方案检测国内样本的分型分析图。
具体实施例方式94°C 30s — 50°C 2min(30cycles) 实施例三探针特异性评估 (I)SNP特异性评估
取选出的13个SNP位点检测国外已知斑马鱼品系的样本，做SNP特异性评估，国
外斑马鱼品系比较纯，能够用来检测国内斑马鱼的遗传质量。
权利要求
1.一种多重分型方案的斑马鱼遗传质量检测试剂盒，试剂盒能成功检测TU、TL、AB、 WIK四个近交系的遗传质量，其特征在于针对4种斑马鱼品系的SNP设计了位点引物和特异探针，利用SNP位点引物PCR结合连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR)检测斑马鱼样本的遗传质量。
2.根据权力要求1所述的一种斑马鱼遗传质量检测方法的多重分型方案试剂盒，其特征在于针对TU、TL、AB、WIK四个近交系的SNP位点序列设计的引物序列为(1)rs41048771，位点PCR 引物上游，5 ‘ -CAGATCACTGTGGGAGGGATA-3 ‘ 下游，5 ‘ -TGAACCGACACACAGACAAAA-3 ‘(2)rs41152074，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -AGGACGCATCCATCGAAATA-3 ‘ 下游，5 ‘ -CTTACTGAGGCTGGGACTCG-3 ‘(3)rs41069005，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -GCAGATCAGTGTCGGTGAGA-3 ‘ 下游，5 ‘ -TTGTATGTGTCGCCCTCTGA-3 ‘ G)rs40862853，位点 PCR 引物上游，5 ‘ -TGTCAAGTGTGACCTGCAAAG-3 ‘ 下游，5 ‘ -AGATTCCGTCTGGCCCTACT-3 ‘(5)rs40734836，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -CGAGTCTCTACCCTCCTCCA-3 ‘ 下游，5 ‘ -GGCAGGAAGTCTGGCTGTTA-3 ‘(6)rs40628703，位点PCR 引物上游，5 ‘ -TTCAATGTGAGCTACTTGCAAAA-3 ‘ 下游，5 ‘ -TGCTGTCAGATTGCTTGCTT-3 ‘(7)rs41187367，位点PCR 引物上游，5 ‘ -CATTCAGGATGCATGAAATGA-3 ‘ 下游，5 ‘ -TCCAGGACAACATGCAAAAA-3 ‘(8)rs40926827，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -TCCAGAATGACTCCTCGTGA-3 ‘ 下游，5 ‘ -TTTGTTGCAATGCAGTGTTG-3 ‘(9)rs40926570，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -CAGCTGAAAGGGACTTTGCT-3 ‘ 下游，5 ‘ -GAATTCATCCCAGAGCGTGT-3 ‘(10)rs41027608，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -GCGCCAAGAGAGAGACAGAC-3 ‘ 下游，5 ‘ -GAAATCTGACGCGAAAATCC-3 ‘(11)rs41040443，位点PCR 引物 上游，5 ‘ -GACCGGCTATGTTTCGTTGT-3 ‘ 下游，5 ‘ -TGTGTTATGGTCGTCGTCGT-3 ‘(12) rs41195135，位点 PCR 引物 上游，GTTTTCGCTTGGGTGGTTTA 下游，TGAACATGAGCGAAGCAAAC
3.根据权力要求1所述的一种斑马鱼遗传质量检测的多重分型方案试剂盒，其特征在于针对TU、TL、AB、WIK四个近交系的位点引物设计的特异探针序列为(1)rs41048771,LDR 探针 rs41048771_modify P-GAAAAGTCGGTGTGTGAACATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAM rs41048771_A :TTTTTTTTTTTTTTTTACGTGCACATGTGAACAGACTAAGT rs41048771_T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTACGTGCACATGTGAACAGACTAAGA(2)rs41152074,LDR 探针rs41152074_modify :P-GGGGTTGAAATGGTATTTATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs41152074_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTACACACTGGGACGGGATCTTCTCTG rs41152074_T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACACACTGGGACGGGATCTTCTCTA(3)rs41069005,LDR 探针rs41069005_modify :P-AAGAGAAGGACCAAATTCCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs41069005_A :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACGCCACGAGACCCGTGGATTAT rs41069005_T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAACGCCACGAGACCCGTGGATTAA(4)rs40862853,LDR 探针rs40862853_modify :P-TCTGCTTTACAACAGGGCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs40862853_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCACAAGGTATCGTAGTGCCAGCG rs40862853_T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCACAAGGTATCGTAGTGCCAGCA(5)rs40734836,LDR 探针rs40734836_modify :P-AGACGCTGCTGATCCACCAATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAMrs40734836_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGTGACTTGCTGTGCATGAGTTAG rs40734836_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCTGTGACTTGCTGTGCATGAGTTAC(6)rs40628703,LDR 探针rs40628703_modify :P-TCCAAGATTAAGTTTTGATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs40628703_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGTTGTCTATGTATTTTG rs40628703_T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGCAGTTGTCTATGTATTTTA(7)rs41187367,LDR 探针rs41187367_modify :P-ATAATCATTTCATGCATCCTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs41187367_A :TTTTTTTTTTTTTTTTTTCCATTAATACACGTACAAAGGCAAT rs41187367_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCATTAATACACGTACAAAGGCAAC(8)rs40926827,LDR 探针rs40926827_modify :P-AATCATCACGAGGAGTCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs40926827_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGACATCCTTCAGAAATTTCAAAG rs40926827 T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGGACATCCTTCAGAAATTTCAAAA(9)rs40926570,LDR 探针rs40926570_modify :P-TCAGTTACTTTCCGTCCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs40926570_A :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAATATCAGTTTTACTTTCAT rs40926570_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCCTGAATATCAGTTTTACTTTCAG(10)rs41027608,LDR 探针rs41027608_modify :P-AAAAGAGTTAATCTCGCCTGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAM rs41027608_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCCGCAAGAAGTTTGAAAGCAATG rs41027608_G :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTATCCGCAAGAAGTTTGAAAGCAATC(11)rs41040443,LDR 探针rs41040443_modify :P-CATAACACAATGTTAAAAACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_FAMrs41040443_A :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATAACCCAACTCTATGGGTTCT rs41040443_T :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTACAATAACCCAACTCTATGGGTTCA(12)rs41195135,LDR 探针rs41195135_modify :P_TATCTTTATTACTCTGCATTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-FAMrs41195135_A :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGAACATGAGCGAAGCAAACTTT rs41195135_C :TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCATGAACATGAGCGAAGCAAACTTG
4.根据权力要求1所述的一种斑马鱼遗传质量检测方法的多重分型方案试剂盒，其特征在于针对TU、TL、AB、WIK四个近交系的多重引物和探针混合方案为(1)第一组多重引物混合方案(PM)rs41048771、rs41152074、rs41069005、rs40862853、rs40734836(pM) 100 100 100 100 100第一组多重探针混合方案(pM)rs41048771、rs41152074、rs41069005、rs40862853、rs40734836(pM)100 100 100 100 100(2)第二组多重引物混合方案(pM)rs40628703、rs41187367、rs40926827、rs40926570、rs41027608、rs41040443、rs4119 5135(pM)100 100 100 100 100 100 100第二组多重探针混合方案(pM)rs40628703、rs41187367、rs40926827、rs40926570、rs41027608、rs41040443、rs4119 5135(pM)100 100 100 100 100 100 100
5.根据权力要求1所述的一种斑马鱼遗传质量检测方法的多重分型方案试剂盒，其特征在于其多重方案的制作步骤如下(1)已知斑马鱼品系DNA的抽提。(2)将25对PCR引物扩增已知斑马鱼品系的DNA。(3)将PCR产物用于LDR分型检测，最后ABIPrism 377型核酸分析仪获取荧光信号， 根据结果选出能将单个品系区分开的SNP位点，共选出12个SNP位点。(4)对选出的12个SNP位点重新设计探针，组成两组多重方案，并优化方案。(5)用4已分型过的种斑马鱼品系和国外已知斑马鱼品系对多重探针检测方案做SNP4特异性评估，经测序仪分析，特异性良好。
6.根据权力要求1所述的斑马鱼遗传质量检测方法的多重分型方案试剂盒，其特征在于其样本检测的步骤如下(1)利用多重引物扩增未知品系的斑马鱼样本DNA(2)将PCR产物用于LDR分型检测，最后ABIPrism 377型核酸分析仪获取荧光信号， 并检测未知品系样本的遗传质量。
全文摘要
斑马鱼品系繁多，实验用斑马鱼对发育生物学、遗传学、肿瘤学、药物学、毒理与环保等方面的研究极其重要。尤其重要的是，斑马鱼种质退化和混种将严重影响到实验结果的科学性，对斑马鱼遗传质量进行检测具有重要的科学意义。本试剂盒利用SNP位点引物PCR结合连接酶检测反应(ligase detection reaction，LDR)技术，针对4种斑马鱼品系TU、TL、AB、WIK为研究对象，针对已知SNP位点设计引物和探针，建立了一种斑马鱼遗传状态检测方法的多重分型方案试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102344955SQ20101024214
公开日2012年2月8日 申请日期2010年8月2日 优先权日2010年8月2日
发明者刘雄伟, 沈志敏, 濮俊毅, 胡建华, 赵莹 申请人:上海实验动物研究中心