一种斑马鱼的繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及动物饲养技术领域，尤其涉及一种斑马鱼的繁殖方法。
【背景技术】
[0002]薇马IkQBrachydoniο rer1)属于脊索动物门福鳍鱼纲鲤形目鲤科短丹尼鱼属，具有繁殖能力强、性成熟周期短、免疫系统成熟、个体小易于养殖等特点，同时斑马鱼基因与人类基因的相似度高，有利于科学研宄成果的拓展。因此，斑马鱼已成为科学研宄中常用的模式生物，广泛应用于生命科学、毒理学、环境科学和农业科学等领域。斑马鱼胚胎被用于新化学物质登记中的毒性评价，幼鱼常被用于开展亚慢性、慢性毒性试验研宄，而斑马鱼成鱼通常被用于农药登记急性毒性试验研宄。
[0003]专利号为201210237027.3的发明公开了一种斑马鱼的饲养方法，主要建立了斑马鱼饲养过程中的日常管理方法及其饵料丰年虾的培育方法，并未提及斑马鱼繁殖方法。现有技术中斑马鱼的繁殖方法，主要是通过在饲养缸底部放置产卵网箱收集受精卵，此方法会导致斑马鱼产卵量低、受精卵死亡率高的问题，24h内受精卵的死亡率甚至达到40%。目前各研宄单位采用的斑马鱼繁殖方法不同，且斑马鱼产卵率、胚胎孵化率及对药物的敏感程度不同，导致最终研宄结果的重复性差，各单位试验结果不能互相认可。因此，提供一种易操作、斑马鱼产卵量高、受精卵死亡率低的繁殖方法尤为重要。
【发明内容】
[0004]本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种易操作、斑马鱼产卵量高、受精卵死亡率低的斑马鱼繁殖方法。
[0005]为解决上述技术问题，提供了一种斑马鱼的繁殖方法，包括以下步骤:
51、挑选鱼龄为6?12个月、体长大于3Cm的健康斑马鱼成鱼作为亲鱼进行专缸培育；
52、在繁殖前3?7天，将雌鱼和雄鱼分开饲养；
53、在繁殖前I天，将雌鱼和雄鱼按照1: 2的比例在繁殖盒内饲养，饲养过程中用隔板将雌鱼和雄鱼分开；黑暗条件饲养12?14 h后，将隔板抽出，使斑马鱼的雌鱼在光照刺激下产卵受精得到受精卵；
54、将步骤S3中得到的受精卵吸出，置于培养皿内静置培养，完成斑马鱼的繁殖。
[0006]在S2步骤中，雌雄斑马鱼鉴别方法为:雌性较肥大，体色较淡，条纹偏蓝、间隔有银灰色条纹，怀卵期间腹部膨大；雄性较修长，体色偏黄，条纹偏黄、间隔有梓檬色条纹，身体细长扁平。
[0007]上述的繁殖方法，优选的，所述步骤SI中所述专缸培育的条件是:培育密度小于0.5 g/L，每天喂食4次，日投喂量为斑马鱼体重的4?6%。
[0008]上述的繁殖方法，优选的，所述专缸培育过程中，喂食的具体步骤为:每天交替投喂鲜活饵料和配合饲料。
[0009]上述的繁殖方法，优选的，所述鲜活饵料为丰年虫、红虫等。
[0010]上述的繁殖方法，优选的，所述配合饲料为热带鱼饲料。
[0011]上述的热带鱼饲料中主要的营养物质为蛋白质、粗脂肪、维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E ;其中蛋白质含量大于40%，粗脂肪含量大于4%，水分低于6%。
[0012]上述的繁殖方法，优选的，所述S4步骤中所述受精卵以I?2枚/mL水的密度进行静置培养。
[0013]上述的繁殖方法，优选的，所述S4步骤中将所述受精卵吸出时采用无菌塑料软管。
[0014]上述的繁殖方法，优选的，所述S4步骤中将所述受精卵吸出过程中应防止受精卵与空气接触，并尽量减少与受精卵一同吸入的水量。
[0015]上述的繁殖方法，优选的，所述斑马鱼繁殖过程中每日的光照与黑暗时间分别为14h 和 1ho
[0016]优选的，步骤S3中繁殖后的雌性斑马鱼与雄性斑马鱼混合饲养，雌斑马鱼和雄斑马鱼分开饲养的时间应不超过14 do
[0017]优选的，步骤S4中保持胚胎均匀分布在培养皿内，胚胎之间不能相互粘连，防止死胚污染健康胚胎。
[0018]上述的繁殖方法，优选的，所述斑马鱼繁殖过程中饲养用水为存放24 h以上并经曝气处理的自来水，pH为6.5?8.0，溶解氧含量不低于空气饱和值的60%，水的硬度为10?250mg/L，水温控制在25.0?28.5°C。
[0019]与现有技术相比，本发明的优点在于:
本发明提供了一种斑马鱼繁殖方法，可提高斑马鱼产卵率，使每次产卵量达到300枚左右，胚胎孵化率均达到80%以上，从而为药物安全性评价提供高质量的生物试材。
【具体实施方式】
[0020]以下结合具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
实施例
[0021]以下实施例中所采用的材料和仪器均为市售。
[0022]实施例1:
本实施例中采用的饲养用水为存放24 h以上并经曝气处理的自来水，调节pH为7.5?7.8，溶解氧含量为空气饱和值的80?88%，水的硬度(以CaCCU+)为65 mg/L，水温控制在26.0 ?28.(TC。
[0023]1、材料准备:
亲鱼饲养用缸:选择体积为70 L (长X宽X高为0.6 mX0.3 mX0.4 m)的方形玻璃缸作为亲鱼饲养用缸，亲鱼饲养缸中加装循环水装置。在初次使用前用20 mg/L高锰酸钾溶液浸泡30 min，然后用清水冲洗干净。
[0024]2、亲鱼饲养:在亲鱼饲养用缸中加入40 L饲养用水，然后放入20尾斑马鱼，雌雄各半。在饲养过程中每天8:30、14:30饲喂鲜活饵料(本实施例采用的鲜活饵料为丰年虫)，每天11:00、17:00饲喂配合饲料(本实施例采用的配合饲料为市售的热带鱼饲料，该热带鱼饲料中含有蛋白质、粗脂肪、维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E，其中蛋白质含量为45%，粗脂肪含量为8%，水分为6%，喂食前研磨成碎片)。并采用40W的日光灯照明，控制每日光照时间为14h，黑暗时间为10h。7d后将亲鱼饲养用缸中1/2的饲养用水换成新鲜的饲养用水。
[0025]3、产卵受精:
3.1、在繁殖前3天，从亲鱼饲养缸中挑选I尾鱼龄约为8个月(鱼龄为6?12均可)、体长约3.5 cm、腹部膨大的雌鱼，2尾鱼龄约为8个月(鱼龄为6?12均可)、体长约3 cm、健康活泼的雄鱼，分别将I尾雌鱼和2尾雄鱼放入不同亲鱼饲养用缸中，单独分开饲养3 do
[0026]3.2、将挑选的雌鱼和雄鱼置于繁殖盒内，用隔板将雌雄鱼分开，黑暗条件饲养12h后，将隔板抽出，斑马鱼在光照刺激下产卵受精(产卵过程保持环境安静)。2 h后亲鱼完成排卵，用抄网将亲鱼捞出放回亲鱼饲养缸中饲养。
[0027]3.3、采用内径不小于4 mm的无菌塑料软管将受精卵全部吸出放入直径为20 cm的结晶皿中，其中，结晶皿内装有I L干净的饲养用水，且温度与繁殖用水温度一致。在转移受精卵时，尽量减少与卵一同吸入的