专利名称：斑马鱼多发性硬化症模型的建立方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于药物筛选(评价)领域，具体涉及一种简便、经济、高通量的斑马鱼多发性硬化症模型的建立方法，并利用该动物模型筛选多发性硬化症治疗药物或评价化合物诱导的神经髓鞘损伤的方法。
背景技术：
多发性硬化症(multiple sclerosis，MS)是以中枢神经系统白质脱髓鞘病变为特点的自身免疫病，可能是遗传易感个体与环境因素作用而发生的神经免疫过程，由于其发病率较高，成慢性病程和倾向于年轻人罹患，而成为最重要的神经系统疾病之一 [1]。流行病学显示该病在北美洲约有40万例患者，我国约有6. 5万例患者，全球的患者超过100万例，女性患者多于男性，多发于20-40岁年龄段的人群[2]。MS新药研发是国际主要制药公司新药研发的重点项目之一。尽管目前临床已经有多种MS治疗药物，包括激素类、免疫调节类、免疫抑制类、他汀类药物等，但是这些药物对MS的疗效有限，且毒副作用大，费用高， 因此迫切需要研发新的MS治疗药物[3]。MS病理损伤机制与T细胞介导的自身免疫反应，胆碱能神经的功能异常，胞浆型磷脂酶A2、激肽释放酶等酶的激活和大量自由基释放等密切相关[4]。传统医学认为MS是由T细胞介导的自身免疫性疾病，即人体对其自身组织发动免疫攻击而造成发病。MS的动物模型实验性变态反应性脑脊髓炎(experimental allergic encephalomyelitis,EAE)也证实激活的T细胞启动了 MS的炎性过程导致脱髓鞘等病变，并伴随炎症细胞侵润和炎性介质释放，产生大量自由基、细胞因子及趋化因子等活性物质。这些活性物质可以直接成为发病的原因或加重因素，导致中枢神经系统(central nervous system,CNS)血管及组织的完整性破坏和功能异常[2_5]。EAE的临床表现及病理改变与急性多发性硬化症极其相似，因而成为研究MS免疫病理学机制及其实验性治疗的最佳动物模型[6]。EAE是一种人工诱导的中枢神经系统特异性自身免疫疾病，可以在多种动物品系中诱导产生。EAE可以通过主动免疫脊髓组织匀浆诱导产生，或经免疫弗氏完全佐剂乳化的髓鞘抗原蛋白如髓鞘碱性蛋白、蛋白脂蛋白或髓鞘少突胶质细胞糖蛋白，也可经被动注入髓鞘抗原反应活性的T细胞诱导产生[7_14]。虽然 EAE是经典的研究MS的方法，但该模型实验周期长、操作复杂、成本高、特异性不强、重复性差、且无法实现高通量药物筛选的目的。目前还没有合适的研究髓鞘的体外细胞模型。有研究曾采用背根神经节(DOG)神经元和少突胶质细胞联合培养的方法来探索髓鞘形成过程中生长因子对髓鞘形成的影响 [15_16]。但细胞联合培养体系的建立耗时较长，方法不稳定，重复性差，尚不适宜进行体外高通量MS治疗药物筛选，并且体外细胞缺少药物在生物整体的代谢转化和体内的循环分布， 不能反映药物在体内的真实情况[17]。因此建立一种能很好的模拟药物在体内的过程，又能快速方便的评价与筛选多发性硬化症治疗药物的动物模型具有重要意义。斑马鱼是一种新颖的模式生物。与传统的体内和体外筛选模型相比较，活体斑马鱼筛选模型具有诸多优势，克服了原有体外模型在吸收、分布、代谢和排泄环节验证的欠缺及传统体内筛选模型实验周期长、操作复杂、成本高的弊端。斑马鱼是一种脊椎动物，与人类基因的相似度高达85%左右，实验结果可比性强。与鼠类等哺乳动物相比，斑马鱼胚胎透明，可同时观察分析多个器官，实验周期短，样本容量大，结果可信度高，所需费用低_。更重要的是，斑马鱼模型具有与生俱来的优点[18_19]:①饲养成本低，性成熟周期短繁殖能力强，一尾雌鱼每次可产200 300枚卵；③生长发育速度快，在受精后24小时(24hpf)， 斑马鱼主要的组织器官原基已形成，可为研究提供大量的样本和较短的实验周期；④胚胎及幼鱼透明，体外受精，体外发育，可直接观察，并可同时分析多个器官系统；⑤胚胎有可以提供营养的卵黄，第一周内不需喂食，可避免化合物处理时化合物与食物成份的相互作用；
⑥胚胎体积小，幼鱼体长只有l_4mm，能够在一个标准的6、12、24、48或96孔板内进行分析；
⑦给药方式简单溶于水的小分子物质可直接经皮肤、鳃及消化系统进入斑马鱼体内；不溶于水的物质、大分子物质及蛋白质可进行显微注射。因此斑马鱼可作为很好的评价与筛选药物的高通量体内脊椎动物模型。研究表明斑马鱼的髓鞘少突胶质细胞的结构特性和细胞谱系关系与哺乳动物具有高度的可比性[2CH23]。斑马鱼体内与髓鞘形成相关的基因(如dm20基因，mbp基因和PO 基因等)与哺乳动物具有很好的同源性[23]。尽管这些基因与哺乳动物有些不同，但高度保守的基因序列足够表达出功能类似的蛋白(表1)[24]。斑马鱼大约发育到2dpf时大脑内紧凑型髓鞘已经形成，在此之前，斑马鱼少突胶质细胞中与髓鞘形成相关的三大基因呈共同表达[24]。表I斑马鱼与哺乳动物中与髓鞘相关的主要蛋白的比较
权利要求
1.一种活体斑马鱼多发性硬化症模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤(1)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个不同浓度的诱导剂处理组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养；(3)整体斑马鱼免疫荧光染色；(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。
2.一种评价或筛选多发性硬化症治疗药物的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个化合物组合处理组、I个模型组、I个阳性对照组、I个溶剂对照组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养；(3)整体斑马鱼免疫荧光染色；(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。
3.一种评价化合物诱导的髓鞘损伤的方法，其特征在于，包括以下步骤(1)斑马鱼选取挑取发育正常的斑马鱼放入微孔板中；(2)化合物处理移除微孔板中的培养液，设置多个实验组若干个待测化合物处理组、I个髓鞘损伤阳性对照组、I个溶剂对照组和I个空白对照组，每个实验组根据微孔板的规格分别加入相同体积的相应溶液，然后恒温培养；(3)整体斑马鱼免疫荧光染色；(4)图像分析和/或微孔板分析；(5)统计学分析。
4.根据权利要求1-3所述的方法，其特征在于所述步骤(I)中斑马鱼为2dpf的斑马鱼，所述步骤(2)中斑马鱼培养时间为96小时，所述步骤(2)中空白对照组使用的溶液为斑马鱼养殖用水。
5.根据权利要求I所述的方法，其特征在于所述步骤(2)中的诱导剂为溴化乙锭 (EB)。
6.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述步骤(3)整体斑马鱼免疫荧光染色包括以下步骤1)固定；2)水化；3)加入封闭液，室温下轻轻摇晃；.4)将斑马鱼与兔抗斑马鱼神经髓鞘蛋白抗体(anti-MBP)共同4°C静置孵育过夜；.5)PBST 清洗；.6)加入FITC标记的羊抗兔IgG二抗，室温孵育，避光；.7)PBST 清洗。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于步骤(2)中化合物组合处理组加入的溶液为EB和待测化合物的混合溶液，模型组加入的溶液为EB溶液，阳性对照组加入的溶液为 EB和多发性硬化症治疗药物的混合溶液，溶剂对照组中加入的溶液为O. 1%的DMS0。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于步骤(2)中待测化合物处理组加入的溶液为待测化合物溶液，髓鞘损伤阳性对照组中加入的溶液为EB溶液，溶剂对照组中加入的溶液为O. 1%的DMS0。
9.根据权利要求1-3任一项所述的方法，其特征在于所述步骤(4)图像分析具体步骤为整体斑马鱼免疫荧光染色结束后，显微镜拍照并保存，一方面通过观察斑马鱼髓鞘荧光强度来定性评价，另一方面利用软件进行图像分析，计算斑马鱼髓鞘荧光强度；所述步骤(4)微孔板分析具体步骤为整体斑马鱼免疫荧光染色后，将斑马鱼转入96孔板中，每孔I 尾，然后将微孔板置于多功能微孔板分析仪下检测荧光强度，定量评价化合物对髓鞘再生的影响或化合物诱导的髓鞘损伤。
10.根据权利要求1-3任一项所述的方法，所述步骤(3)整体斑马鱼神经髓鞘荧光染色使用免疫组织化学染色方法、活性染料荧光染色方法或非活性染料荧光染色方法。
全文摘要
本发明涉及一种斑马鱼多发性硬化症模型的建立方法，并利用该动物模型筛选多发性硬化症治疗药物或评价化合物诱导的神经髓鞘损伤的方法。主要包括斑马鱼选取，化合物处理，整体斑马鱼免疫荧光染色，图像分析和/或微孔板分析，统计学分析几个步骤。本发明的方法具有经济、简便、快速、高效、化合物用量少等优点，可实现体内高通量筛选多发性硬化症治疗药物的目的，并对加速多发性硬化症治疗药物的研发进程及多发性硬化症患者的治疗意义重大。
文档编号A61K31/473GK102600156SQ20121001607
公开日2012年7月25日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者朱凤, 朱晓宇, 李春启, 郭胜亚 申请人:杭州环特生物科技有限公司