专利名称：一种宫颈癌预防性vlp疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于诱导抗高危型人乳头瘤病毒的疫苗。
背景技术：
人乳头瘤病毒(HPV)是小型DNA病毒，存在100个以上的基因型，其中有15个基因型(高危型:16、18、31、33、35、39、45、52、56、58、59、66、68、73 型)是子宫颈癌的原因。HPV16 型在50-60%的子宫颈癌中被检出。在欧美以18型居多，在亚洲以16、58型居多。HPV病毒壳体为正20面体骨架上具有12分子的L2蛋白质的结构，所述正20面体骨架由72个Ll蛋白质五聚体形成。L2蛋白质的两端位于病毒壳体的内部，而其N末端侧的一部分露出在壳体表面。如果采用重组DNA技术仅使Ll蛋白质大量表达，则会产生病毒样颗粒(Virus-like particle ；VLP)0实验证实，如果将牛乳头瘤病毒、棉尾兔乳头瘤病毒的VLP或L2蛋白质接种于动物，则会对病毒侵染表现出抵抗性。目前尚没有可供HPV增殖的培养细胞系。为了监测HPV的感染，制作了假病毒。 在表达SV40T抗原的人293细胞中导入具有SV40复制起点的分泌性碱性磷酸酶(SEAP)表达质粒、以及Ll和E7蛋白质表达质粒，则复制的SEAP表达质粒组入L1/E7-病毒样颗粒， 从而形成了感染性假病毒。可以通过抑制假病毒的感染性的活性来测定中和抗体(Rose， R. C.，Bonnezj W.，Reichmanj R. C.，Garceaj R. L， 1993. Expression of human papillomavirus type 11 Ll protein in insect cells: in vivo and in vitro assembly of virus-like particles. J. Virol. 67，1936 - 1944)。将HPV的VLP接种于动物而得到的抗血清具有基因型特异性的中和活性 (Chen, X. S. , Garcea, R. L. , Goldberg, I. , Casini, G. , Harrison, S. C. , 2000. Structure of small virus-like particules assembled from the Ll protein of human papillomavirus 16. Mol. Cell 5, 557 - 567 ；Harper, D. Μ. , et al. : Sustained efficacy up to 4. 5 years of abivalent Ll virus-like particle vaccine against human papillomavirus type 16 and 18:follow up from a randomized control trial. Lancet 367(9518)，1247-1255)。基于此，Merck公司开发出了 HPV16、18型VLP的混合疫苗。这些疫苗在大规模临床实验中显示出基因型特异性的感染预防效果，Merck公司的疫苗于2006 年取得了 FDA和欧洲委员会的认证并上市销售。但是，如上述，如果用HPV的Ll-病毒壳体免疫动物，则会诱导出相应型病毒基因特异性的免疫应答。如使用16型Ll-病毒壳体疫苗进行的临床实验的中间成绩显示对16 型的感染的预防有效性，但也显示对于其它基因型基本没有预防效果。在15个高危HPV群体中，现在销售的HPV疫苗仅对16型和18型有效。因为VLP 诱导基因型特异性的中和抗体，为了针对全部高危HPV群，必须使用15种VLP的鸡尾酒，以此作为实用性疫苗抗原是困难的。因此，希望开发诱导交叉反应性中和抗体的疫苗抗原。W02007/018049公开的抗原是至少能够抗全部高危型的抗原，而且是基因型共有性更高的抗原。但是，其使用的感染性假病毒仅为16、18型，相对于这些感染性假病毒，W02007/018049使用的抗原显示了良好的中和活性。而本申请发明人在后续的实验中发现， W02007/018049公开的抗原对本发明人新开发的52、58型的感染性假病毒的中和活性并不
尚ο为了用疫苗预防子宫颈癌的发生，至少必须开发出能够抵抗所有高危型病毒的疫
田ο
发明内容
本发明的目的在于提供一种可以对抗多种高危型HPV病毒的疫苗。本发明所采取的技术方案是
一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体，所述嵌合蛋白通过在HPV 18型、52型或58型的Ll蛋白的140与141位之间插入HPV 16型的 E7 表位而得到，其中，E7 表位为 MLDLQPETT (SEQ ID NO 1), RAHYNIVTF (SEQ ID NO :2)、 LLMGTLGIV (SEQ ID NO :3)、TLGIVCPI (SEQ ID NO :4)中的至少一种。聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。优选的，五聚体病毒壳粒的个数为60 85个。疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位，优选的，含有4种E7表位。疫苗还含有可接受的药用辅料。本发明的有益效果是
本发明的疫苗，可以高效地诱导抗多种抗高危型HPV病毒的中和抗体，免疫效果好，免疫时间长。
具体实施例方式一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体， 所述嵌合蛋白通过在HPV 18型、52型或58型的Ll蛋白的140与141位之间插入HPV 16 型的 E7 表位而得到，其中，E7 表位为 MLDLQPETT (SEQ ID NO 1), RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 2), LLMGTLGIV (SEQ ID NO :3)、TLGIVCPI (SEQ ID NO :4)中的至少一种。在本发明中，从蛋白质的氨基末端起依次对氨基酸残基进行编号，例如第50号位的氨基酸记作氨基酸50。本发明中HPV 18型、52型或58型Ll蛋白的序列分别如SEQ ID NO :5 7所示。为了制作本发明的嵌合蛋白质而插入Ll蛋白质的人乳头瘤病毒16型的E7表位序列为
MLDLQPETT (以下简称12-20 E7表位) RAHYNIVTF (以下简称49-57 E7表位) LLMGTLGIV (以下简称82-90 E7表位)或 TLGIVCPI (以下简称86-93 E7表位)。12-20 E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸12-20区域的9个氨基酸构成。 49-57 E7表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸49-57区域的9个氨基酸构成。82-90 E7 表位由HPV16型的E7蛋白质的氨基酸82-90区域的9个氨基酸构成。86-93 E7表位由 HPV16型的E7蛋白质的氨基酸86-93区域的8个氨基酸构成。
HPV的基因型多，因而，通常以HPV16、HPV58等表示方式将其基因型一并表示出来。在本文中，类似将HPV16型的Ll-病毒壳体表述为16L1-病毒壳体。聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。优选的，五聚体病毒壳粒的个数为60 85个。如前述，HPV粒子中，72个由5个分子的Ll蛋白质聚集而成的病毒壳粒聚集在一起形成正20面体的病毒壳体。如果使Ll蛋白质在细胞中高表达，则Ll蛋白质集中在核内， 并自主性的形成病毒壳体。仅由Ll蛋白质形成的病毒壳体称为Ll-病毒壳体或病毒样颗粒(virus-like particle :VLP)。如果使Ll蛋白质和E7蛋白质同时表达，则12个分子的 E7蛋白质会组入Ll-病毒壳体，从而形成L1/E7-病毒壳体(或L1/E7-VLP)。Ll-病毒壳体与L1/E7-病毒壳体无法用电子显微镜辨别。天然型VLP通常由360个分子的Ll蛋白质形成，这种情况下，每个粒子具有360 个交叉反应性表位。使用重组杆状病毒在昆虫sf9细胞中表达将HPV16E7蛋白质的氨基酸12 20、49 57、82 90、86 93的序列插入HPV18型、52型、58型Ll蛋白质的氨基酸140/141之间而VLP，电子显微镜照片显示各嵌合蛋白形成了 VLP粒子，分别命名为 Chl2/20、Ch49/57、Ch82/90、Ch86/93。疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位，优选的，含有4种E7表位。这可以获得更多的交叉中各反应，使得该疫苗可以对抗更多的高危型HPV。疫苗还含有可接受的药用辅料。将E7表位对应的核酸序列插入到相应的Ll蛋白基因中的对应位置，之后将得到的核酸序列插入表达载体中表达，即可得到相应的嵌合蛋白。下面结合实施例，进一步说明本发明。兔肽抗血清的制作
对2只新西兰兔(2. 5kg 3. Okg)进行了免疫。所使用的抗原是化学合成的肽与KLH (keyhole limpet hemocyanin)相结合而得到的。首次致敏是将0. 5mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。首次施用2周后将0.25mg抗原与弗氏完全佐剂一起皮下施用。而且，在 2周后、4周后、6周后同样(0. 25mg)地进行致敏，共计进行5次致敏。在末次致敏1周后， 采集全血，得到了血清。采用以下所示的中和实验，考察了用具有HPV16型E7-表面区域的氨基酸序列的合成兔肽兔而得到的抗血清。结果如表1所示。由表1所示的结果可知氨基酸12-20、 49-57,82-90,86-93区域中存在交叉反应性表位。中和实验
1)中和实验前一天，在96孔细胞培养用平板中播种10000个/孔的细胞(购自 Invitrogen 公司)；
2)用NeautralizationBuffer (在除去酚红的DMEM培养基中添加10%FCS、1%非必需氨基酸、1%L-谷氨酸、IOmM HEPES而得到)稀释血清，并与感染性假病毒相混合，4°C反应1 小时，再将其添加于前一天播种的细胞；
3)培养约72小时后，回收上清20μ1，采用Roden等的方法(参照http://home.ccr. cancer. gov/lco/colorimetricSEAP. htm)测定碱性磷酸酶活性。表1、抗E7肽抗体中和活性
权利要求
1.一种宫颈癌预防性VLP疫苗，所述疫苗含有人乳头瘤病毒HPV的嵌合蛋白聚集体， 所述嵌合蛋白通过在HPV 18型、52型或58型的Ll蛋白的140与141位之间插入HPV 16 型的 E7 表位而得到，其中，E7 表位为 MLDLQPETT (SEQ ID NO 1), RAHYNIVTF (SEQ ID NO: 2)、LLMGTLGIV (SEQ ID NO :3)、TLGIVCPI (SEQ ID NO :4)中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于聚集体由多个五聚体病毒壳粒聚集而成。
3.根据权利要求2所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于聚集体的五聚体病毒壳粒的个数为60 85个。
4.根据权利要求1 3任意一项所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于所述疫苗的聚集体中，至少含有两种不同的E7表位。
5.根据权利要求4所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于所述疫苗的聚集体中，含有4种E7表位。
6.根据权利要求1所述的一种宫颈癌预防性VLP疫苗，其特征在于所述疫苗还含有可接受的药用辅料。
全文摘要
本发明公开了一种宫颈癌预防性VLP疫苗，VLP是HPV18型、52型、58型L1蛋白的环部位插入1个16型的E7表位而得到的嵌合蛋白的聚集体。本发明的疫苗可以高效地诱导抗多种抗高危型HPV病毒的中和抗体，免疫效果好，免疫时间长。
文档编号A61P31/20GK102552897SQ20121001561
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者安鸿, 尹海滨 申请人:广东华南联合疫苗开发院有限公司