专利名称：一种菜籽活性多肽的制备方法
技术领域：
本发明属于食品加工技术领域，涉及一种菜籽活性多肽的制备方法及应用。
背景技术：
油菜是重要的油料作物之一，我国油菜产量居世界第一位。一般情况下，油菜籽经加工可得约3506菜籽油和65%左右菜籽粕。菜籽粕中富含粗蛋白质、粗脂肪、卵磷脂、多种维生素、氨基酸等，其蛋白质中可消化蛋白质含量可达27. 8%。此外，菜籽粕中还含有较高胆碱、生物素、叶酸、烟酸及硫胺素、核黄素等B族维生素和Ca、P、Fe, Se, Cu、Zn、Mn等多种微量元素。菜籽粕的粗蛋白含量一般在35%-45%，为优质的全价植物蛋白，对其进行开发利用具有重要的经济意义与社会意义。但是，目前我国对菜籽粕的利用相当有限，仅用作肥料或按少量比例添加到反刍动物和淡水鱼类的养殖饲料中，这造成了一定资源浪费。蛋白质是一切生命活动的主要体现者和物质基础。一切生命活动都与蛋白质有关，因此有关蛋白质的研究一直以来都是生物技术领域的研究的热点。而近年来，越来越多的研究表明肽比蛋白质具有更优秀的性质。现代生物代谢研究发现由多个氨基酸结合而成的低聚肽比游离氨基酸更容易被消化吸收，其中尤以二肽、三肽吸收为最好最快。相比于原料蛋白及相同组成的氨基酸，酶解产物多肽能表现出良好的持水力、凝胶性、表面活性等物理功能特性以及抗氧化、降血脂、调节免疫力等多种生理功能，而这些是原料蛋白质和组成游离氨基酸所不具备的。因此，将菜籽粕用来加工高附加值产品，具有显著的社会意义和经济意义。蛋白质的水解方法一般包括酸碱降解法和酶解法。酸碱法水解动物蛋白是利用蛋白质在不同PH下溶解度不同，先在极端条件下使绝大部分蛋白质溶解，去掉不溶解物，再调PH至蛋白质的等电点沉淀回收。化学降解法以其操作简单、成本低、蛋白质收率高等特点成为早期蛋白质水解的主要手段，但随着对蛋白质水解的研究深入，渐渐发现化学法水解蛋白质存在许多缺陷，如(1)过于极端剧烈的反应条件给环境带来很大的污染，同时也加重了后续环境治理的成本；( 酸碱的调节会导致水解产物成分复杂，盐分过高，使用范围受到很大限制，而现今的肽类产品大都作为食品、保健品、化妆品等；(3)激烈的反应过程会使氨基酸的构型由L-氨基酸转变为D-氨基酸，而D-氨基酸的功能性远不如L-氨基酸；(4)酸碱法难以控制反应进程，不能实现目标产物的定位水解。综合考虑，近几年已经很少采用化学法水解蛋白质，取而代之的是酶法水解蛋白质。采用生物法水解食物蛋白比化学酸碱处理法具有更突出的优势，如蛋白酶能在温和的条件下水解食物类蛋白，不会造成大的环境污染；蛋白酶水解蛋白质也不会造成氨基酸构型的变化，较好的保存了氨基酸原有的功效；蛋白酶水解可以实现定位水解，易于实现水解进程的控制，从而使肽类的应用性和功能性变广，满足市场的需求。但是酶解蛋白质并不是一个简单的工艺过程，它涉及到很多步骤。第一步就是筛选合适的酶，因为酶不仅影响反应的速率、产物的得率，而且还直接影响到产品的风味、理化特性和生理活性，选择依据不仅与酶自身的作用位点的专一性有关，还与底物以及工艺条件有很大关系。总体来说，菜籽蛋白氨基酸组成合理，接近联合国粮农组织(WHO)和世界卫生组织(FAO)推荐的氨基酸组成模式，但高温榨油工艺会造成蛋白质变性，另外，从菜籽粕中分离得到的菜籽粗蛋白或多或少存在一些抗营养因子，使其开发利用受到一定限制。因此，如何有效利用菜籽蛋白成为亟需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术的不足，本发明的目在于提供一种菜籽活性多肽的制备方法，从而进一步实现提高菜籽粕的附加值。为了实现本发明的目的，发明人通过大量试验研究，最终获得了如下技术方案 一种菜籽活性多肽的制备方法，包括如下步骤
(1)取脱壳脱脂干燥菜籽粕，粉碎过60目筛后置于提取罐中，加入8-12倍量蒸馏水， 40士2°C下搅拌浸提0. 8-1. 5h，5500-6500rpm、4°C离心20min，过滤上清液得到沉淀，按上述步骤再进行相同的浸提操作2-3次，合并所得的上清液，用lmol/L盐酸沉淀上清液，调pH 至4. 0后5500-6500rpm、4°C离心IOmin获得沉淀，将沉淀置于蒸馏水中透析16_48h，并每隔他分别更换蒸馏水，然后真空冷冻干燥后得菜籽清蛋白；
(2)将菜籽清蛋白加蒸馏水配制成质量分数为5-8%的蛋白溶液，按每克菜籽清蛋白添加4000U的Flavourzyme蛋白酶，维持温度55士2°C、pH7. 0，水解2. 5_汕，再按每克菜籽清蛋白添加^OOU的Alcalase蛋白酶，维持温度52士2°C、pH8. 0，水解3. 5_4h，水解结束后快速升温至95°C，保持10 15min，水解液冷却到常温后，12000rpm离心15min，取上清液， 得粗制多肽液；
(3)在粗制多肽液中按菜籽清蛋白质量的2.5%加入活性炭，在55飞0°C下搅拌反应 60min，15000rpm离心15min，取上清液，得粗制脱色多肽液；
(4)将粗制脱色多肽液先后经滤纸过滤，IOOnm微滤膜过滤，500Da纳滤膜过滤，纳滤液在_45°C真空冷冻干燥，得菜籽活性多肽。通过动物试验研究发现，利用上述方法制备的菜籽活性多肽在提高衰老小鼠模型的学习和记忆能力方面具有显著的作用。因此，本发明的第二个目的在于提供一种产品新用途，即利用上述方法获得的菜籽活性多肽在制备提高记忆力的保健品、食品或药品中的应用。本发明制备的菜籽活性多肽是菜籽蛋白经蛋白酶作用，再经特殊处理后得到的蛋白质水解物，由许多分子链长度不等的低分子小肽混合物组成，还含有少量游离氨基酸、糖类和无机盐等成分。本发明涉及的菜籽活性多肽的制备方法具有如下优点和显著的进步(1)筛选得到了理想的复合蛋白酶及其用量，获得了风味较好的活性多肽，实现了对废料的综合利用， 进一步提高了菜籽粕的附加值。(2)生产工艺简单，反应条件温和，对生产设备的要求低，适合工业化大生产。(3)利用该方法制备的菜籽活性多肽能显著提高老年人的学习和记忆能力。(4)利用该方法制备的菜籽活性多肽不仅具有良好的酸溶性、低勃度、抗凝胶形成性，在体内消化吸收快，蛋白利用率高等特点，而且具有低抗原性，不会产生过敏反应，还具有良好的理化性质及生理活性，可作为运动营养剂、减肥食品、老年食品的添加剂。
具体实施例方式以下是本发明制备菜籽活性多肽的具体制备例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。实施例1菜籽活性多肽的制备
(1)取脱壳脱脂干燥菜籽粕(粗蛋白含量38.5%)，粉碎过60目筛后置于提取罐中，加入 10倍量蒸馏水，40士2°C下搅拌浸提lh，6000rpm、4°C离心20min，过滤上清液得到沉淀，按上述步骤再进行相同的浸提操作3次，合并所得的上清液，用lmol/L盐酸沉淀上清液，调pH 至4. 0后6000rpm、4°C离心IOmin获得沉淀，将沉淀置于蒸馏水中透析Mh，并每隔他分别更换蒸馏水，然后真空冷冻干燥后得菜籽清蛋白；
(2)将菜籽清蛋白加蒸馏水配制成质量分数为6%的蛋白溶液，按每克菜籽清蛋白添加 4000U的Flavourzyme蛋白酶，维持温度55士2°C、pH7. 0，水解2. 5h，再按每克菜籽清蛋白添加的^OOU Alcalase蛋白酶，维持温度52士2°C、pH8. 0，水解3.证，水解结束后快速升温至95°C，保持lOmin，水解液冷却到常温后，12000rpm离心15min，取上清液，得粗制多肽液；
(3)在粗制多肽液中按菜籽清蛋白质量的2.5%加入活性炭，在58°C下搅拌反应60min， 15000rpm离心15min，取上清液，得粗制脱色多肽液；
(4)将粗制脱色多肽液先后经滤纸过滤，IOOnm微滤膜过滤，500Da纳滤膜过滤，纳滤液在-45°C真空冷冻干燥，得无苦味、风味好的菜籽活性多肽。实施例2菜籽活性多肽促进小鼠记忆试验研究
六周龄健康小鼠(体重22g-25g，雌雄各半)，将试验小鼠随机分成3组，每组15只，即青年对照组、衰老模型组、活性肽处理组。其中，衰老模型组、活性肽处理组小鼠的颈背部皮下注射生理盐水稀释的0. 8% D-半乳糖溶液0. 5ml/20g(200mg/kg)，l次/d，连续6周，造成衰老模型，青年对照组皮下注射等量生理盐水，活性肽处理组在造模的同时每日上午九点灌胃一次本发明实施例1制备的菜籽活性多肽，剂量为0. 8g/kg体重，活性多肽以生理盐水稀释，连续6周，青年对照组和衰老模型组灌胃给予等体积生理盐水。各组小鼠处理6周后，进行水迷宫试验，迷宫是80CmX50CmX20Cm双层不透明有机玻璃箱，内设起始点、终点平台和四个盲端，平台附近为安全区。试验时迷宫水深12cm， 水温保持(25士 1)°C，迷宫周围一切空间标志在整个试验过程中保持不变。正式试验前一天，帮助每只小鼠在迷宫中熟悉水环境15min，如小鼠在60s内未到达平台，可帮助式地将小鼠赶至平台，并使小鼠在平台上停留20s。第2天开始正式试验。小鼠面向壁在起始点放入水中，记录小鼠放入水中到达终点平台时间(游全程时间)和进入盲端的次数(错误次数)，统计结果见表1。根据试验结果可以看出，模型组与青年组相比，水迷宫试验游全程时间明显延长 、P < 0. 01)，错误次数显著增加Gd <0.01)；而活性肽处理组小鼠虽未达到青年组的水平， 但较模型组这两项成绩均有显著改善0° < 0. 05)，这说明本发明制备的菜籽活性多肽能够提高衰老小鼠的学习和记忆能力。
表1菜籽活性多肽对小鼠水迷宫试验成绩的影响(n=15，X士 S)
权利要求
1.一种菜籽活性多肽的制备方法，包括如下步骤(1)取脱壳脱脂干燥菜籽粕，粉碎过60目筛后置于提取罐中，加入8-12倍量蒸馏水， 40士2°C下搅拌浸提0. 8-1. 5h，5500-6500rpm、4°C离心20min，过滤上清液得到沉淀，按上述步骤再进行相同的浸提操作2-3次，合并所得的上清液，用lmol/L盐酸沉淀上清液，调pH 至4. 0后5500-6500rpm、4°C离心IOmin获得沉淀，将沉淀置于蒸馏水中透析16_48h，并每隔他分别更换蒸馏水，然后真空冷冻干燥后得菜籽清蛋白；(2)将菜籽清蛋白加蒸馏水配制成质量分数为5-8%的蛋白溶液，按每克菜籽清蛋白添加4000U的Flavourzyme蛋白酶，维持温度55士2°C、pH7. 0，水解2. 5_汕，再按每克菜籽清蛋白添加^OOU的Alcalase蛋白酶，维持温度52士2°C、pH8. 0，水解3. 5_4h，水解结束后快速升温至95°C，保持10 15min，水解液冷却到常温后，12000rpm离心15min，取上清液， 得粗制多肽液；(3)在粗制多肽液中按菜籽清蛋白质量的2.5%加入活性炭，在55飞0°C下搅拌反应 60min, 15000rpm离心15min，取上清液，得粗制脱色多肽液；(4)将粗制脱色多肽液先后经滤纸过滤，IOOnm微滤膜过滤，500Da纳滤膜过滤，纳滤液在_45°C真空冷冻干燥，得菜籽活性多肽。
2.根据权利要求1所述的方法制备的菜籽活性多肽在制备提高记忆力的保健品、食品或药品中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种菜籽活性多肽的制备方法，该方法包括将脱壳脱脂干燥菜籽粕粉碎后用水浸提、离心，所得上清液用酸沉淀、并置于水中透析，所得菜籽清蛋白经双酶水解后脱色除杂，得菜籽活性多肽。本发明的生产工艺简单，反应条件温和，对生产设备的要求低，适合工业化大生产。
文档编号A61P25/00GK102533918SQ20121001565
公开日2012年7月4日 申请日期2012年1月18日 优先权日2012年1月18日
发明者吴雷, 张丽琍, 张超, 祁斌 申请人:安徽燕之坊食品有限公司