专利名称：马肿瘤坏死因子超家族成员13B的cDNA序列及其克隆方法和重组应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物基因工程领域，具体涉及马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA序 列及其克隆方法和重组应用。
背景技术：
人肿瘤坏死因子超家族成员 13B(Tumor necrosis factor superfamily, member 13b,TNFSF13B)是1999年发现的一种与人体免疫调控密切相关的肿瘤坏死因子家族成员， 主要在外周血单核细胞、脾脏、淋巴结和骨髓中表达。TNFSFUB具有很强的B细胞趋化性， 体外它作为B细胞增殖和分化的共刺激因子，能诱导活化的B细胞分泌大量的IgG、IgA、IgM 等，对于休眠B细胞，TNFSFUB虽不能独立激活使之进入细胞周期循环，但通过上调细胞 表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-&的表达，延长休眠B细胞的寿命。体内它可以促进脾脏内 Tl-B细胞向T2-B细胞以及成熟B细胞的发育。TNFSFUB的正常表达是GC形成、抗体亲和 力成熟、记忆性B细胞形成及B细胞正常发育的必须条件。由于TNFSFUB具有多种重要免 疫功能，自从被发现以来就显示了巨大的临床应用前景。2000年11月，美国FDA已正式批 准重组人TNFSFUB进入人体临床试验，用于治疗普通变异免疫缺乏症(CVID)患者。根据GenBank、EMBL和DDBJ国际三大核酸序列数据库搜索结果得知，马肿瘤坏死 因子超家族成员13B (horse TNFSF13B) cDNA尚未被克隆，关于马TNFSFliBB基因的研究 在国内国外完全处于空白状态。TNFSFUB对激活B细胞的促抗体分泌、促增殖的生物学 活性强烈提示TNFSFUB很可能像已成功应用于经济畜禽疫病防治的细胞因子免疫佐剂 IL-2、⑶40L—样，具有分子免疫佐剂样效应。马TNFSFUB蛋白有可能开发成一种能增强 马免疫能力的生物制剂。近年来，随着对细胞因子研究的不断深入，许多细胞因子基因工程药物上市， 为家禽、家畜疾病治疗提供了新的手段，同时创造了巨大的经济和社会效益，因此重组马 TNFSF13B蛋白具有巨大的潜在市场应用价值。
发明内容
本发明提供一种马肿瘤坏死因子超家族成员1 的cDNA及其克隆方法。本发明所说的马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA，它具有SEQ ID NO. 1所示的 序列。马肿瘤坏死因子超家族成员13B蛋白质具有SEQ ID NO. 2所示的序列。本发明的马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA的克隆方法如下
(1)根据马肿瘤坏死因子超家族成员13B基因5'和3'非翻译区序列设计Nest PCR 引物
第一轮PCR引物
正义 1 :5' - CGACAGCCAAGCTGGGCGATGTAGTC -3' (SEQ ID N0. 3)反义 1 :5' - CGCCCTACAGATGTGGGCACCGG -3' (SEQ ID NO. 4) 第二轮PCR引物
正义 2:5' - GGTCACTTATTCTAAAGGCCCGAACC -3' (SEQ ID NO. 5) 反义 2:5' - GACACCCTTTGGCTGTGGTTGTCGG -3' (SEQ ID NO. 6)
(2)应用RNA抽提试剂TRIzol(Invitrogen公司)，按照操作手册，提取马外周血总
RNA ；
(3)RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，正义1和反义1为引物，进行第一轮PCR ；以 1:50稀释的第一轮PCR产物为模板，正义2和反义2为引物，进行第二轮PCR，扩增出一段 cDNA序列，全长为1111 bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测序。从马的外周血细胞总RNA中克隆得到的肿瘤坏死因子超家族成员13B (horse TNFSF13B)的全长 cDNA 共 1111 bp，其中开放阅读框(open reading frame, 0RF) 873 bp，分别含有46和192 bp的5'和3'非翻译区序列。根据873 bp ORF推测得到的 TNFSFUB蛋白含有四0 aa,具有TNFSFliBB家族共有的结构特点。体外功能试验证实重组 马TNFSFliBB蛋白可刺激B淋巴细胞增殖。马TNFSFliBB 1111 bp cDNA和四0 aa序列如 SEQ ID NO. 1 和 SEQ ID N0. 2 所示。本发明所说的重组应用中将获得的马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA通过现 有基因工程方法，生产重组horse sTNFSF13B，作为马类免疫增强剂。
图1是horse TNFSF13B全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。图2是horse TNFSFUB与人、鼠、牛、鸡TNFSF13B全长氨基酸序列同源性比较图。 箭头所指代表弗林蛋白酶识别位点，切割后的C端为TNFSF13B的胞外可溶功能区。图3是融合蛋白His-horse sTNFSFUB在BL21 (DE3)中的诱导表达，Ni+柱纯化的 SGS-PAGE鉴定及鼠抗His6-tag的western-blotting鉴定结果，图中电泳样品1是经IPTG 诱导4. 5小时后的全菌蛋白，2是未经IPTG诱导的全菌蛋白，3是经M+柱纯化后目的蛋白； 4是鼠抗Hi -tag单抗的western-blotting鉴定结果。
具体实施例方式在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常 理解的含义。下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发 明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。 所用到的引物，均在首次出现时标明，其后所用相同引物，均以首次标明的内容相同。实施例1:
(1)引物设计根据马肿瘤坏死因子超家族成员1 基因5'和3'非翻译区序列设 计Nest PCR引物 第一轮PCR引物
正义 1 :5' - CGACAGCCAAGCTGGGCGATGTAGTC -3' (SEQ ID N0. 3)
4反义 1 :5' - CGCCCTACAGATGTGGGCACCGG -3' (SEQ ID NO. 4) 第二轮PCR引物
正义 2:5' - GGTCACTTATTCTAAAGGCCCGAACC -3' (SEQ ID NO. 5) 反义 2:5' - GACACCCTTTGGCTGTGGTTGTCGG -3' (SEQ ID NO. 6) (2)提取总 RNA:应 用RNA抽提试剂TRIzol (Invitrogen公司)按照其操作手册提取马外周血细胞的总RNA， 并通过甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定其质量和纯度，紫外分光光度计测定其浓度。(3)应用RT-PCR方法，以上述第一轮及第二轮PCR引物，两轮PCR反应扩增出 horse TNFSF13B全长cDNA，共1111 bp，克隆入pMD19_T载体，并对其碱基序列进行测定， 得到如图1所示的horse TNFSF13B全长cDNA碱基序列及推测编码氨基酸序列。(6)生物信息学分析1111 bp的马TNFSF13B cDNA，分别含有46和192 bp的5' 和3' 非翻译区序列，中间的开放阅读框(open reading frame, 0RF)为873 bp。根据 873 bp ORF推测得到的TNFSFUB蛋白含有四0 aa，具有TNFSFliBB家族共有的结构特点 (http://smart, embl-heidelberg. de/)。对GenBank、EMBL和 DDBJ 国际三大主要数据库进 行相似性搜索及同源性分析，发现马TNFSF13B蛋白的可溶性功能区与已知的牛(GenBank 登录号 NM_001114506)、鸡(GenBank 登录号 AF506010)、人(GenBank 登录号 AFl 16456)、鼠 (GenBank登录号AF119383)的TNFSFliBB可溶性功能区氨基酸序列相似性分别是96%、77%、 90%、87% (图 2)。实施例2
可溶性horse TNFSF13B重组载体的构建及其在大肠杆菌中的诱导表达 以实施例1得到的horse TNFSF13B全长cDNA为模板，上游引物 CTCCATATGGCCGCTCAGGACTCAGC SEQ ID N0. 7)和下游引物 GCGAAGCTTTCACAGAAGTTTCAGTGC (SEQ ID N0. 8)扩增出 horse TNFSF13B cDNA 胞外可溶区段(hsTNFSFUB)，亚克隆入 pET-28a载体，构建成重组载体pET-28a-hsTNFSF13B。将此重组载体转入大肠杆菌表达菌 株BL21 (DE3)，胞浆内可高可溶性表达出目的蛋白His-horse sTNFSF13B，此融合蛋白经促 存活与增殖试验检测证实具有良好的生物学功能。
重组目的蛋白的的Ni+亲和纯化
IPTG诱导含有重组载体pETj8a-horse sTNFSF13B的大肠杆菌表达菌株BL21 (DE3) 4.5小时后，4°C收菌，冰上超声破碎(工作10s，暂停10s，共99次)表达菌体，4°C，13， 000Xg，20min离心超声破碎液后，弃沉淀，留上清过Ni+-NTA柱。简要过程是3体积 Binding Buffer平衡Ni+-NTA柱后，手动上样含可溶性重组蛋白的上清，6体积Wash Buffer (60mM 咪唑，0. 5M NaCl,20mM Tris-HCl pH7. 9)洗去未结合上Ni+-NTA柱的杂蛋白， 最后 6 体积 Elute Buffer(lM 咪唑，0.5M NaCl, 20mM Tris-HCl ρΗ7· 9)洗脱目的蛋白，PBS 透析除盐，以SDS-PAGE及毛细管电泳分析纯度并以紫外分光光度计检测蛋白浓度，如图3 所示，表达得到的目的蛋白经Ni+柱亲和纯化得到纯度达95%的活性目的蛋白。
western 印迹分析
Western-blot中所用一抗为羊抗Hk6单抗，二抗为辣根过氧化酶标记的鼠抗羊IgG。 其简要步骤是将诱导的产物先行SDS-PAGE，然后以浸入式法将蛋白电转移至硝酸纤维素 膜(NC膜)上，用记号笔标记蛋白marker各条带，然而依次经5%脱脂奶粉室温封闭lh，与 一抗孵育lh，与HRP标记的二抗IgG孵育lh，每步完成后均严格洗膜，最后加TMB避光显色。结果如图3所示在目的蛋白位置出现了特异性条带。实施例3
将实施例1获得的马肿瘤坏死因子超家族成员13B cDNA通过现有基因工程方法，生产 重组horse sTNFSF13B,作为马类免疫增强剂。按照本发明的方法可以通过现有基因工程技术，修饰马肿瘤坏死因子超家族成员 13B基因并用于所述研究和生产。
权利要求
1.马肿瘤坏死因子超家族成员13BCDNA，其特征在于它的序列如SEQID NO. 1所示。
2.—种权利要求1所述的马肿瘤坏死因子超家族成员UBcDNA的克隆方法，其特征在 于，步骤如下(1)根据马肿瘤坏死因子超家族成员13B基因5'和3'非翻译区序列设计NestPCR 引物第一轮PCR引物正义 1 :5' - CGACAGCCAAGCTGGGCGATGTAGTC -3'反义 1 :5' - CGCCCTACAGATGTGGGCACCGG -3'第二轮PCR引物正义 2 5' - GGTCACTTATTCTAAAGGCCCGAACC -3'反义 2 5' - GACACCCTTTGGCTGTGGTTGTCGG -3'(2)应用RNA抽提试剂TRIzoI，提取马外周血总RNA；(3)RNA逆转录为cDNA，以cDNA为模板，正义1和反义1为引物，进行第一轮PCR ；以 1 50稀释的第一轮PCR产物为模板，正义2和反义2为引物，进行第二轮PCR，扩增出一段 cDNA序列，全长为1111 bp，克隆入pMD19-T载体，并对其碱基序列进行测序。
3.一种权利要求1所述的马肿瘤坏死因子超家族成员UBcDNA的重组应用，是通过现 有基因工程方法，生产重组马肿瘤坏死因子超家族成员13B，作为马的免疫增强剂。
4.马肿瘤坏死因子超家族成员13B蛋白质，其特征在于它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所示。
全文摘要
马肿瘤坏死因子超家族成员13B(horseTNFSF13B)cDNA及其克隆方法,涉及生物基因工程领域。马肿瘤坏死因子超家族成员13B的cDNA和蛋白质，分别具有SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示的序列。其克隆方法如下根据马肿瘤坏死因子超家族成员13B基因5′和3′非翻译区序列设计引物；从马外周血提取总RNA；通过RT-PCR方法，扩增出全长cDNA序列，克隆入pMD19-T载体，挑取阳性克隆进行测序。所述马肿瘤坏死因子超家族成员13B的cDNA可通过现有基因工程方法，生产重组horseTNFSF13B，作为马免疫增强剂。
文档编号A61K48/00GK102115747SQ20101059830
公开日2011年7月6日 申请日期2010年12月21日 优先权日2010年12月21日
发明者吴海涛, 张双全 申请人:南京师范大学