专利名称：抗人light单克隆抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于遗传工程领域，涉及一种抗人LIGHT单克隆抗体及其在制备抑制T细胞体外增殖和相关细胞因子分泌的药物中的应用。
背景技术：
由免疫效应细胞活化的双信号学说提出的共信号分子网络表明，活化T细胞需要共刺激/抑制分子协助其产生有效的免疫应答，刺激和抑制信号的相互制约保障了机体各类免疫细胞发挥正常功能。共信号分子在结构上分为TNF/TNFR肿瘤坏死因子超家族、 CD28/B7免疫球蛋白超家族以及细胞因子超家族。肿瘤坏死因子家族(TNF superfamily，TNFSF)配体成员可通过旁分泌、自分泌及内分泌以膜结合或可溶性的形式而发挥作用。当其成员与对应的肿瘤坏死因子TNF受体超家族成员(TNFRSF)结合后可诱发下游产物的寡聚结合，启动相应的信号传导过程，包括 caspases的活化、核因子(NF- κ B)的转位以及一些蛋白激酶的激活，如c-Jun NH2-末端激酶(JNK)、细胞外信号调节激酶(ERK)，可引起细胞凋亡、炎症反应、自身免疫疾病以及参与细胞增殖、分化、细胞因子分泌、Ig类型转换等许多生理病理过程。近年来发现了不少新的TNF超家族成员，已知并命名的多达十几种。除了分泌型的LTa，TNF家族成员多为II 型跨膜糖蛋白[3]，其中TNF-α、⑶40LJasL、TRANCE的胞外段还可从细胞表面脱落，通过细胞间配体/受体模式传递信号。LIGHT是其中能介导共刺激作用的配体成员之一，其表达于活化的T细胞及未成熟的树突状细胞，细胞表面的LIGHT分子可与金属离子形成螯合蛋白。LIGHT与相应的受体TR2/HVEM，LT-β R或DcR3/TR6作用可介导不同的生物学效应，包括阻断HVEM依赖的 HSVl感染、诱导和调节肿瘤细胞凋亡以及刺激T淋巴细胞的增生。单纯疱疹病毒侵入介质 HVEM(Herpesvirus entry mediator)，主要表达在造血组织和淋巴组织，例如脾脏、胸腺和纯化的外周血中静止及活化的⑶4+、⑶8+ T细胞、⑶19+ B细胞与单核细胞都高表达HVEM， 与LIGHT作用后，HVEM能够传递刺激T细胞活化、增殖的正性信号；LT β R(Lymphotoxin β Receptor)主要表达在上皮细胞而不表达在成熟的T、B细胞，初始单核细胞和外周血DC上， 在某些肿瘤细胞上，LIGHT/LTi3 R信号能引发细胞凋亡。可溶性受体DcR3在部分正常组织及血清中少量表达，在一些恶性肿瘤中表达明显增加，DcR3 一旦高表达可通过阻断外源性死亡受体途径介导细胞凋亡，与肿瘤的发生、发展密切相关。LIGHT受体之一的HVEM可作为配体与免疫球蛋白超家族成员BTLA或⑶160相互作用介导负性共抑制信号，并且相关文献亦表明LIGHT / HVEM、HVEM/BTLA和HVEM/CD160 间亦存在逆向信号作用，因此LIGHT/HVEM/BTLA(⑶160)实现了正、负信号分子及⑶观/ B7、TNF/TNH 两大超家族成员间的联系，构成了一个共信号分子中复杂、动态的微观免疫调节网络。所以研究和揭示LIGHT/HVEM信号对T细胞的共刺激作用对阐述LIGHT/HVEM/ BTLA (⑶160)的作用特性与机理及其在T细胞调控中的地位具有重要的理论意义。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种抗人LIGHT单克隆抗体以及能产生所述抗人LIGHT 单克隆抗体的杂交瘤细胞株。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株的制备方法包括以下步骤
1)构建高表达人LIGHT的转基因细胞首先，使用RT-PCR技术从活化的T细胞中扩增出人LIGHT基因，将LIGHT基因克隆入真核表达载体ρIRES2-EGFP，得到重组载体 PIRES2-EGFP-LIGHT ；然后使用重组载体pIRES2_EGFP_LIGHT转染细胞，然后筛选出高表达人LIGHT的转基因细胞L9^/LIGHT ；
2)获取融合细胞生长克隆以步骤1)所得转基因细胞L^9/LIGHT免疫BALB/C小鼠， 从免疫合格小鼠无菌取其脾细胞作为抗原致敏的B细胞，按常规方法，将B细胞与骨髓瘤细胞SP2/0株融合，然后利用常规的融合细胞HAT筛选方法进行筛选，进而获取融合细胞生长克隆；
3)应用流式细胞术、Western印迹法、免疫沉淀法等方法鉴定后，挑选出具有高抗体分泌水平的杂交瘤细胞株。上述技术方案中，步骤1)中L929/LIGHT细胞的制备方法可以按照本领域技术人员熟知的 DNA 操作技术(例如参见 Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour，1989)进行基因的分离、核苷酸片段的切割与连接、克隆和表达载体的构建及扩增、核苷酸序列的分析与鉴定、细胞的转化和培养；高表达人LIGHT分子的转基因细胞Li^9/LIGHT具有较强的免疫原性，并且所表达的抗原分子的空间构型能以自然状态暴露于细胞膜表面，从而可更有效地激发机体的免疫反应。另外，由于细胞是鼠源性的成纤维细胞，其表面的其他分子具有相对较弱的抗原性，因此用该细胞作为免疫原将会减少非特异性抗体的产生，使单克隆抗体的筛选更为方便并大大提高阳性检出率。上述技术方案中，步骤2)中，用转基因细胞L^9/LIGHT免疫BALB/C小鼠时，当被免疫动物的血清抗体水平达到峰值时，分离动物的脾细胞并制备单细胞悬液；必要时，可使用免疫吸附方法筛选脾细胞，例如，可以将脾细胞悬液加到LIGHT抗原蛋白质包被的平板或小孔内，表达LIGHT多肽特异性免疫球蛋白的B细胞即结合到平板上，而不能被其余的悬液洗掉。然后可以收集所得到的B细胞或所有解离的脾细胞，并在适当的融合剂(例如聚乙二醇)的诱导下与骨髓瘤融合以形成杂交瘤，并在选择性培养基例如HAT培养基中培养以筛选融合的杂交瘤细胞。上述杂交瘤细胞株的保藏信息为保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会， 普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间2011年4月27日；保藏号CGMCC No. 4788 ；分类命名分泌小鼠抗人LIGHT分子单克隆抗体杂交瘤细胞株。采用上述杂交瘤细胞株制备单克隆抗体的方法有以下两种
1)在杂交瘤培养液中接种上述杂交瘤细胞，培养后培养液中分离纯化所需单克隆抗
体；
2)在动物腹腔内接种上述杂交瘤细胞，动物腹水液中分离和纯化所需单克隆抗体。
上述技术方案中，制备本发明的抗人LIGHT单克隆抗体的方法可以参照本领域已知的常规方法(Kohler and Milstein, Nature 265:495 -497,1975)。本发明同时要求保护上述杂交瘤细胞株产生的抗人LIGHT单克隆抗体，并且所述抗人LIGHT单克隆抗体为抗膜型人LIGHT的单克隆抗体。流式细胞仪分析结果显示，本发明提供的抗人LIGHT单克隆抗体能识别两种LIGHT基因转染细胞株上的LIGHT分子。竞争试验结果进一步显示，本发明的抗人LIGHT单克隆抗体与HVEMIg融合蛋白可识别不完全相同的抗原位点。为了鉴定本发明的抗人LIGHT单克隆抗体的生物学功能，本发明进行体外活化T 细胞试验。实验结果表明，本发明的抗人LIGHT单克隆抗体能阻断HVEM/LIGTH结合，以剂量依赖方式抑制CD3激发型单抗协同转基因细胞株Li^9/LIGHT对T淋巴细胞体外增殖和细胞因子分泌的促进作用。因此，本发明同时要求保护所述抗人LIGHT单克隆抗体在制备抑制T细胞体外增殖的药物中的应用，和所述抗人LIGHT单克隆抗体在制备抑制T细胞分泌相关细胞因子的药物中的应用。上述技术方案中，所述术语“LIGHT”是指某些哺乳动物细胞上表达的可与LIGHT 受体特异结合的蛋白质；术语“LIGHT受体”是指抗原活化的T细胞表面上表达的蛋白质。本发明与该现有技术中(参见杨明峰，人LIGHT基因转染细胞的构建及鼠抗人 LIGHT单克隆抗体的研制；苏州大学硕士论文；2006年)所述单克隆抗体的克隆号不同，快速定性试纸检测结果显示本发明所述单抗与对比文件中描述单抗的重链为不同类型，且本发明单抗与其受体分子的融合蛋白的结合位点有部分重叠，在体外实验中，本单抗对 LIGHT介导的刺激T细胞增殖和相关细胞因子的分泌具有部分阻断作用(杨明峰硕士的毕业论文中未见描述)。由于上述技术方案的应用，本发明和现有技术相比具有以下优点
该抗人LIGHT单克隆抗体能阻断HVEM/LIGTH结合，以剂量依赖方式抑制CD3激发型单抗协同转基因细胞株Li^9/LIGHT对T淋巴细胞体外增殖和细胞因子分泌的促进作用。因此，所述抗人LIGHT单克隆抗体可应用于制备抑制T细胞体外增殖的药物中或抑制T细胞分泌相关细胞因子的药物。
杂交瘤细胞株的保藏信息为保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会，普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏时间2011年4月27日；保藏号CGMCC No. 4788 ；分类命名分泌小鼠抗人 LIGHT分子单克隆抗体杂交瘤细胞株。图1为实施例一中L929/LIGHT转基因细胞的构建示意图2为实施例一中PCR及双酶切法鉴定重组质粒pIRES2-EGFP-LIGHT的结果图； 图3为实施例一中流式细胞术分析抗人LIGHT单克隆抗体7A8对转基因细胞上LIGHT 分子的识别；其中灰色峰为阴性对照，一抗为小鼠IgG，二抗为荧光素PE标记的羊抗鼠IgG ； 透明峰显示转基因细胞与抗人LIGHT单抗反应的结果，其中第一抗体分别是商品化抗人 LIGHT单抗aLIGHT (阳性对照)及本发明的抗人LIGHT单抗7A8，第二抗体是荧光素PE标记的羊抗鼠 IgG ；其中，1. L929/mock; 2. L929/LIGHT; 3. CH0/LIGHT ； 图4为实施例一中7A8杂交瘤细胞株染色体的核型分析(X 1000倍)； 图5为实施例一中流式细胞术分析单克隆抗7A8与融合蛋白HVEMIg在转基因细胞上的抗原识别位点；
图6为实施例二中MTT法分析单抗7A8体外阻断LIGHT基因转染细胞协同激发型CD3 mAb刺激的T细胞增殖；其中纵坐标为OD值，横坐标为不同反应组1: T细胞+L929/LIGHT ； 2: T 细胞+L^9/LIGHT+1 μ g/ml 7A8 mAb; 3: T 细胞+L^9/LIGHT+2 μ g/ml 7Α8 mAb ；4: T 细胞+L929/LIGHT+4 μ g/ml 7A8 mAb; 5: T 细胞+L929/LIGHT+8 μ g/ml 7A8 mAb ；
图7为实施例二中单抗7A8对L^9/LIGHT介导的刺激T细胞分泌相关细胞因子的效应具有阻断作用。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
实施例一本实施例描述抗人LIGHT单克隆抗体7A8的制备方法，过程参见图1，具体包括以下步骤
(1)转基因细胞L929/LIGHT和L9^/mock的建立
(a)人LIGHT基因的克隆根据GenBank中已知的人LIGHT基因序列，分别设计用于PCR 扩增人LIGHT全长序列的上下游引物(SEQ ID No :1和SEQ ID No :2)。抽提活化T细胞的 mRNA,并将其逆转录为cDNA，以此cDNA为模板，上下游引物LA -FcoR I和LB- BamH I配合Pyrobest高保真酶进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性5min ；94°C变性45s，55 °C退火45s，72°C延伸lmin, 35个循环；然后72°C延伸IOmin0(b)重组真核表达载体的构建PCR扩增产物用试剂盒进行纯化后，限制性内切酶I和及I同时对纯化产物和质粒载体PIRES2-EGFP双酶切，回收酶切片段， 在T4 DNA连接酶作用下与pIRES2-EGFP载体连接，转化感受态细菌ToplO筛选阳性克隆，经重组质粒PCR和酶切鉴定，鉴定结果参见图2，图2为PCR及双酶切法鉴定重组质粒PIRES2-EGFP-LIGHT的结果图，其中图2A中，泳道1，2，3 :EcoR I BamH I双酶切鉴定 PIRES2-EGFP-LIGHT; M: DNA Marker ；图 2B 中，泳道 1，2，3 PCR鉴定 pIRES2_EGFP_LIGHT 重组质粒；M: DNA Marker ；并进一步测序确证，获得重组子pIRES2-EGFP-LIGHT。(c)稳定表达人LIGHT的转基因细胞的构建首先以试剂盒(Invitrogen，美国)操作手册推荐的脂质体法，将重组PIRES2-EGFP-LIGHT用脂质体法转染预铺于6孔板中的细胞，置于含G418 (1000 μ g/ml)的选择培养基中，筛选培养，待抗性克隆长至足够大，选取单克隆集落，进行扩大培养。同时制备阴性对照的空质粒转染细胞Li^9/m0Ck。收集L9^/LIGHT和L9^/mock基因转染细胞，用流式细胞术检测绿色荧光蛋白(GFP)报告基因的表达。进一步用商品化LIGHT抗体与上述基因转染细胞作用后，以PE-羊抗鼠IgG为二抗，流式细胞术检测LIGHT分子在细胞膜上的表达。通过筛选以及后续的亚克隆复筛几次，成功获得稳定高表达人LIGHT分子的基因转染细胞L9^/LIGHT并与HVEMIg融合蛋白稳定结合ο(2)抗人LIGHT单克隆抗体的制备
使用如上得到的高表达LIGHT分子的转基因细胞(L929/LIGHT)作为免疫原，三次免疫接种Balb/c小鼠(107500μ1/只)(间隔3周)。末次免疫后第四天，取小鼠脾脏细胞与 SP2/0骨髓瘤细胞株进行细胞融合(共20块96孔板)。以高表达LIGHT分子的L^9/LIGHT 为阳性对照及不表达LIGHT分子的L^9/moCk为阴性对照，用间接免疫荧光法对杂交瘤培养物上清进行初步筛选、蛋白鉴定及Ig亚类鉴定(参见图3，4)。阳性克隆经3次有限稀释后，证明克隆的阳性率达到约95%。经复筛及亚克隆后获得稳定地分泌特异性鼠抗人LIGHT 的杂交瘤细胞株，并分别被命名为7A8。这株杂交瘤细胞经体外持续传代(40代以上)后，仍能稳定地分泌特异性抗体。对杂交瘤细胞株7A8的染色体分析显示，其染色体数目为80-100 (参见图3)。(3)抗人LIGHT单克隆抗体的生产与特性鉴定
(a)采用本室建立的腹水体内诱生方法生产单克隆抗体。取6-8周龄的雌性Balb/c小鼠，腹腔内注入I^ristane (0.5ml/只)。一周后腹腔内接种杂交瘤细胞(1 X IO7/只)，同时再次腹腔内注射I^ristane与福氏不完全佐剂的等体积混合物(0. aiil/只)。5-10天后收获腹水，并离心取上清于-80°C保存。(b)腹水型单抗的纯化和定量。腹水液经去除纤维蛋白和盐析处理后，以蛋白G 亲和柱层析法纯化。收集蛋白峰流出液，对磷酸盐缓冲液(PBS)透析后用751紫外分光光度计测定抗体蛋白浓度为0.8 10mg/ml。间接免疫荧光法分析，纯化后单抗的效价为1:1000 以上。(C)Ig亚类鉴定。采用试纸快速测定(Argen公司)法，鉴定Ig亚类，结果显示7A8 为小鼠IgG2b型。(d)抗体识别抗原位点的竞争性抑制试验。将L929/LIGHT细胞(5X105/管)， PBS洗涤后，加入0. 5 μ g/ μ 1的抗人HVEMIg (设置浓度梯度每管0. 25 μ g/100 μ 1， 0. 5μ g/ΙΟΟμ 1,1. 25μ g/ΙΟΟμ 1，2. 5μ g/ΙΟΟμ 1)，于 4°C 反应 45min，用含 2% 小牛血清的 PBS洗涤两遍，各管加入5. 0 μ 1/0. 25 μ g/ μ 1的7Α8单抗；再于4°C反应45分钟，洗涤后加入鼠抗人PE 二抗，4°C孵育30min，含m小牛血清的PBS洗涤后进行FACS分析。结果如图 5所示，四张图分别用纯化的不同浓度的融合蛋白阻断抗LIGHT单抗7A8与Li^9/LIGHT转基因细胞的结合，HVEMIg融合蛋白可部分阻断抗人LIGHT单克隆抗体7A8与L9^/LIGHT 转基因细胞的结合，由此表明，单抗7A8的抗原表位与HVEM/LIGHT间的结合位点有部分重叠。实施例二 抗人LIGHT单克隆抗体7A8体外抑制T细胞活化增殖和细胞因子的分泌，本实施例描述以MTT法检测单克隆抗体7A8对T细胞体外增殖和分泌细胞因子的抑制作用。(I)T细胞制备取正常志愿者外周血100ml (得自苏州红十字血站)，分离 (Ficoll)得到单个核细胞。洗细胞后，用含10%小牛血清的RPMI1640培养基稀释至3X IO6/ ml。然后将细胞加入6孔培养板(2ml/孔)中培养2小时(5%C02，37°C)。轻轻吸出悬浮细胞，即得到PBMC。然后按照常规绵羊红细胞结合法分离得到T细胞(纯度>90%)。(2)抑制T细胞体外增殖和细胞因子分泌用激发型抗⑶3单克隆抗体(1. 0μδ/ ml)包被96孔板(4°C过夜)。次日，向小孔内加入纯化的T细胞并分为5组1为LIGHT基因转染细胞协同激发型⑶3 mAb刺激组(对照);2为1. 0μδ/πι1单克隆抗体7Α8阻断组；3为 2. 0μδ/πι1单克隆抗体7Α8阻断组。4为4. 0μδ/πι1单克隆抗体7Α8阻断组。5为8. 0μδ/πι1单克隆抗体7A8阻断组。刺激3天后MTT法检测T细胞增殖情况。由图6，7可以看出，单克隆抗体7A8mAb可部分阻断T细胞经由基因转染细胞协同激发型⑶3 mAb介导的增殖效应，且上清中IL-2、IFN-Y和IL-10的含量显著减少。
权利要求
1.一种杂交瘤细胞株，其特征在于，所述杂交瘤细胞株为一种分泌小鼠抗人LIGHT分子单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CGMCC No. 4788。
2.一种抗人LIGHT单克隆抗体，其特征在于，所述抗人LIGHT单克隆抗体为权利要求 1所述保藏编号CGMCC No. 4788的杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体。
3.权利要求2所述抗人LIGHT单克隆抗体在制备抑制T细胞体外增殖的药物中的应用。
4.权利要求2所述抗人LIGHT单克隆抗体在制备抑制T细胞分泌相关细胞因子的药物中的应用。
全文摘要
本发明属于遗传工程领域，涉及肿瘤坏死因子超家族成员的结合蛋白质或多肽，本发明公开了一种杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株为一种分泌小鼠抗人LIGHT分子单克隆抗体杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞的保藏编号为CGMCC No.4788。本发明同时公开了一种抗人LIGHT单克隆抗体，所述抗人LIGHT单克隆抗体为上述杂交瘤细胞株产生得到。该抗人LIGHT单克隆抗体能阻断HVEM/LIGTH结合，以剂量依赖方式抑制CD3激发型单抗协同转基因细胞株L929/LIGHT对T淋巴细胞体外增殖和细胞因子分泌的促进作用。因此，所述抗人LIGHT单克隆抗体可应用于制备抑制T细胞体外增殖的药物中或抑制T细胞分泌相关细胞因子的药物。
文档编号A61P31/22GK102329781SQ20111031477
公开日2012年1月25日 申请日期2011年10月17日 优先权日2011年10月17日
发明者张学光, 王雪峰, 黄子逸 申请人:苏州大学